Purificação de Fibroblastos e Células Schwann de nervos sensoriais e motores in Vitro

Aqui, apresentamos um método para purificar fibroblastos e células Schwann de nervos sensoriais e motores in vitro.

Este protocolo pode ser usado para obter um grande número de sensores e o fibroblasto motor e células Schwann rapidamente. As células obtidas através desta mensagem podem ser utilizadas no estudo da regeneração nervosa e doenças do sistema nervoso. Mostramos que a demonstração pode representar o experimental para controlar melhor o tempo de passo digestivo diferencial e tornar os passos experimentais mais fáceis de entender.

Para estourar use uma tesoura para fazer uma incisão de três centímetros, na pele das costas. Remova a coluna vertebral. Abra cuidadosamente o canal vertebral para expor a medula espinhal.

Renda a medula espinhal em uma placa de Petri de 60 milímetros, com três a quatro mililitros de gelo d Hanks solução de sal equilibrado sob um microscópio dissecando, extirem a raiz ventral e a raiz dorsal. Coloque-os em solução de sal balanceada D Hanks. Depois de remover o HBSS, corte os nervos em pedaços de três a cinco milímetros, com uma tesoura.

Adicione um mililitro de 0,25% de trippsina e transfira as peças nervosas para cinco tubos de centrífuga mililitro. Incubar a 37 graus Celsius por 18 a 20 minutos. Em seguida, para parar a digestão, adicione em três a quatro mililitros de DMEM contendo soro bovino 10%.

Pipeta a mistura para cima e para baixo suavemente cerca de 10 vezes. Centrifugar a 800 vezes G por cinco minutos. Após a centrifugação descarte o supernasce.

E suspender o precipitado em dois ou três mililitros de DMEM suplementados com 10% de FBS. Filtre a suspensão da célula através de um filtro de malha de 400 e, em seguida, use a suspensão para inocular uma placa de Petri de 60 milímetros. Incubar as placas de Petri por quatro a cinco dias a 37 graus Celsius, na presença de 5% de dióxido de carbono.

Quando a cultura atingir 90% de confluência, lave as células uma vez usando 1XPBS. Em seguida, para digerir as células Schwann, adicione um mililitro de 0,25% de trippsina a 37 graus Celsius por prato de 60 milímetros. Após oito a 10 segundos em temperatura ambiente, pare a digestão, adicionando três mililitros de DMEM suplementados com 10% de FBS.

Para separar as células Schwann, golpee suavemente a cela com uma pipeta. Verifique por microscópio que as células estão separadas. Em seguida, colete o meio, que contém as células cisne, e centrífuga a 800 vezes G por cinco minutos.

Descarte o supernaspeuta e suspenda o precipitado em três mililitros de meio. Use esta suspensão para inocular placas de Petri de 60 milímetros não revestidas e incubar os pratos a 37 graus Celsius por 30 a 45 minutos. Marcas para o meio, que conterão as células Schwann para um prato médio revestido de Poli L, e incubar o prato a 37 graus Celsius por dois dias.

Depois de remover o meio contendo as células Schwann lavar os fibroblastos, aderindo às placas de Petri com 1XPBS. Para digerir os fibroblastos, adicione um mililitro de 0,25% de trippsina a 37 graus Celsius. Após seguir a digestão para prosseguir por dois minutos a 37 graus Celsius, termine a digestão adicionando DMEM suplementado com 10% de FBS.

Para desprender os fibroblastos, use uma pipeta para soprar na parte inferior do prato. Colete o meio, incluindo os fibroblastos, e transfira-o para tubos centrífugas. Centrifugar os tubos a 800 vezes G por cinco minutos.

Descarte o supernasce e resuspenque o precipitado com dois mililitros de DMEM contendo 10% de FBS. Inocular as células em pratos não codificados, 60 milímetros, petri, e incubar a 37 graus Celsius por 30 a 45 minutos. Isole os fibroblastos que aderirão às placas de Petri, removendo e descartando o meio de crescimento.

Adicione três mililitros de DMEM suplementados com 10% de FBS. Incubar a 37 graus Celsius por dois dias até que a passagem uma das células atinja 90% de confluência. Repita a digestão diferencial e a adesão.

Depois de esculpir a passagem para fibroblastos e células Schwann por dois dias, digerir as células, recolhê-las e contá-las. Lâminas revestidas de PLL inoculadas em uma concentração de uma vez 10 dessas células por poço para coloração icc. A microscopia de contraste de Bay mostra a morfologia de células e fibroblastos schwann cultivados durante todo o processo de isolamento.

Após um tempo prolongado de cultura, as células schwann foram agrupadas entre os fibroblastos ou localizadas na superfície dos fibroblastos. Após a digestão por 10 segundos, as células schwann, indicadas pelas setas vermelhas, eram redondas enquanto os fibroblastos permaneceram planos e foram anexados ao fundo do prato. Após o isolamento por digestão diferencial e adesão diferencial foram observadas morfologias celulares típicas para todos os quatro tipos de células.

Fibroblastos motores, fibroblastos sensoriais, células schwann motoras e células schwann sensoriais. Os fibroblastos sensoriais e motores foram visualizados usando um microscópio de varredura a laser focal do cone. Os fibroblastos foram manchados com anticorpos contra o cd 90 X33342 corante foi usado para rotular os núcleos celulares.

As imagens mescladas de fibroblastos imunossundo e coloração nuclear, indicaram que 92,51% e 92,64% das células cd 90 e co-rotuladas hexatos estavam presentes nos fibroblastos motor e sensorial, respectivamente. As células schwann sensoriais e motoras foram visualizadas usando um microscópio de varredura a laser confocal. As células Schwann foram manchadas com anticorpos contra o corante S100 X33342 foi usado para rotular os núcleos celulares.

As imagens de fusão de células cisnes e coloração nuclear indicaram a presença de 91,61% e 93,56% de células S100 e co-rotuladas em células schwann motoras e sensoriais, respectivamente. A pureza celular também foi analisada por meio da citometria de fluxo. Nas culturas do fibroblasto, aproximadamente 90% das células eram fibroblastos, indicados por M2 nos gráficos da FCA, enquanto as células restantes eram células Schwann.

Nas culturas celulares schwann, mais de 92% das células eram células Schwann, novamente indicadas por M2 nos gráficos da FCA, enquanto as células restantes eram fibroblastos. Este protocolo raramente é útil para iniciar o mecanismo de regeneração de sensores e nervos motores de fibroblastos, e o transplante de células Schwann, para promover a regeneração nervosa.