Name: Purificação de Fibroblastos e Células Schwann de nervos sensoriais e motores in Vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Aprenda a purificar fibroblastos e células de Schwann de nervos sensoriais e motores in vitro. Este método rápido e eficiente permite obter culturas com mais de 90% de pureza para estudos de regeneração nervosa e doenças do sistema nervoso.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este estudo foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (Grant No. 2017YFA0104703), a Fundação Natural Nacional da China (Grant No. 31500927).

Este estudo foi realizado de acordo com as Diretrizes Institucionais de Cuidados Com Animais da Universidade de Nantong. Todos os procedimentos, incluindo os animais, foram eticamente aprovados pelo Comitê de Administração de Animais Experimentais, província de Jiangsu, China.
1. Isolamento e cultura de fibroblastos motores e sensoriais e SCs
<ol><li>Use ratos esponjosos de sete dias de idade (SD) fornecidos pelo Centro Animal Experimental da Universidade de Nantong da China. Coloque os ratos em um tanque contendo 5% de isoflurane por 2-3 minutos, permita que os animais respirem lentamente e não tenham atividade independente e, em seguida, higienize usando 75% de etanol antes da decapitação.</li>
	<li>Use uma tesoura para cortar a pele traseira por cerca de 3 cm e remover a coluna vertebral. Abra o canal vertebral cuidadosamente para expor a medula espinhal.</li>
	<li>Mantenha a medula espinhal em uma placa de Petri de 60 mm com 2-3 mL de solução de sal balanceada D-Hanks (HBSS).</li>
	<li>Com base na estrutura anatômica, extirve a raiz ventral (nervo motor) e, em seguida, a raiz dorsal (nervo sensorial) sob um microscópio dissecando. Em seguida, coloque-os em uma solução de sal balanceada D-Hanks (HBSS).</li>
	<li>Depois de remover o HBSS, corte os nervos em pedaços de 3-5 mm com tesoura e digerir com 1 mL de 0,25% (w/v) trypsin a 37 °C por 18-20 min. Em seguida, suplemento com 3-4 mL de DMEM contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) para parar a digestão.</li>
	<li>Pipeta a mistura para cima e para baixo suavemente cerca de 10 vezes e centrífuga a 800 x g por 5 min. Depois disso, descarte o supernasal e suspenda o precipitado em 2-3 mL de DMEM suplementado com 10% de FBS.</li>
	<li>Filtre a suspensão da célula usando um filtro de malha de 400 e, em seguida, inocular as células em placa de Petri de 60 mm e cultura a 37 °C na presença de 5% de CO2. Após 4-5 dias de cultivo, isole a passagem 0 (p0) de fibroblastos e SCs após atingir 90% de confluência.</li>
	<li>Isolamento e cultura das SCs (Figura 1)<ol>
<li>Lave as células uma vez usando 1x PBS. Adicione 1 mL de 0,25% (w/v) trippsina (37 °C) por placa de Petri de 60 mm para digerir as células para 8-10 s em temperatura ambiente. Depois disso, adicione 3 mL de DMEM suplementado com 10% de FBS para parar a digestão.</li>
		<li>Sopre suavemente a mistura para separar os SCs com uma pipeta. Em seguida, colete e centrifuge os SCs a 800 x g por 5 min.</li>
		<li>Descarte o supernasciante/estreptomicina, 2 μM forskolin e 10 ng/mL HRG, e depois inocula as células em placa de Petri de 60 mm não revestida. Depois de culminar a 37 °C por 30-45 min, os fibroblastos (um número de fibroblastos são digeridos com SCs) anexam ao fundo do prato.</li>
		<li>Transfira o supernasciente (incluindo os SCs) para outro prato médio revestido de poli-L(PLL) e cultura a 37 °C por 2 dias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolamento e cultura de fibroblastos (Figura 1)<ol>
<li>Depois de remover os SCs (como mostrado na etapa 1.8), lave os fibroblastos restantes nos pratos com 1x PBS e, em seguida, adicione 1 mL de 0,25% (w/v) trypsin para digerir os fibroblastos por 2 min a 37 °C.</li>
		<li>Adicione DMEM suplementado com 10% de FBS para acabar com a digestão. Exploda os fibroblastos usando uma pipeta, e depois colete e centrifuge-os a 800 x g por 5 min.</li>
		<li>Descarte o supernasce, suspenda o precipitado com 2 mL de DMEM contendo 10% de FBS e, em seguida, inocular as células em placa de Petri de 60 mm não revestida. Os fibroblastos após a colheita por 30-45 min a 37 °C anexam ao fundo do prato. Descarte o supernatante (incluindo alguns números de SCs). Em seguida, adicione 3 mL de DMEM suplementado com 10% de FBS no prato e cultura dos fibroblastos a 37 °C por 2 dias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Passagem das células p1 até atingirem 90% de confluência. Em seguida, purificá-los por digestão diferencial e adesão diferencial novamente como descrito nas seções 1.8 e 1.9.</li>
	<li>Digerir os fibroblastos p2 e SCs após a colheita por 2 dias e, em seguida, coletar as células, contar e inocular em 1 x 105 números/bem em lâminas revestidas de PLL para imunocitoquímica (ICC).</li>
</ol>2. ICC para identificação da pureza celular
<ol><li>Cultuize as células por 24h a 37 °C e realize a coloração do ICC após digestão diferencial e adesão diferencial de fibroblastos motor e sensoriais e SCs.</li>
	<li>Lave os fibroblastos motor e sensorial e os SCs com 1x PBS e fixe-os em 200 μL/well de 4% de paraformaldeído (pH 7.4) por 18 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Bloqueie os SCs amostrais com tampão de bloqueio (0,1% Triton X-100 em 0,01 M PBS contendo 5% de soro de cabra) e bloqueie os fibroblastos amostrais com tampão de bloqueio (0,01 M PBS contendo 5% de soro de cabra) por 45 min a 37 °C depois de lavá-los com PBS três vezes.</li>
	<li>Remova o tampão de bloqueio e incuba com os seguintes anticorpos primários: anticorpo anti-CD90 monoclonal do rato (um marcador específico para fibroblastos) (1:1000) para fibroblastos e anticorpos anti-S100 do rato (um marcador específico para SCs) (1:400) para SCs a 4 °C durante a noite.</li>
	<li>Descarte os anticorpos primários, lave com PBS três vezes e incuba com os seguintes anticorpos secundários: Alexa Fluor 594 igG anti-rato de cabra (1:400) para fibroblastos e IgG anti-rato de cabra conjugado de 488 (1:400) para SCs à temperatura ambiente por 1,5 h.</li>
	<li>Lave as amostras três vezes com PBS e manche os núcleos com 5 μg/mL Hoechst 33342 de corante por 10 minutos à temperatura ambiente. Lave a amostra com 1x PBS três vezes e monte-as usando o meio de montagem (20 μL/slide) na lâmina de vidro.</li>
	<li>Tire as fotografias celulares pelo microscópio de varredura a laser confocal em três campos aleatórios para cada poço. Avalie o número total de núcleos e células CD90 positivas, células S100 positivas e, em seguida, calcule a porcentagem de células CD90 positivas e células S100 positivas, respectivamente. Realize a coloração em triplicado.</li>
</ol>3. Análise da citometria de fluxo (FCA) para identificação da pureza celular
<ol><li>Avalie a pureza dos fibroblastos motor e sensoriais e dos SCs, conforme descrito anteriormente pela FCA16. Brevemente, digerir os fibroblastos motor e sensorial P2 e SCs com trippsina de 0,25%, resuspensar as pelotas celulares e incubar-as em meio de fixação à temperatura ambiente por 15 minutos.</li>
	<li>Incubar as células com meio de permeabilização e sonda utilizando anticorpo anti-CD90 monoclonal do rato (0,1 μg/106 células, 200 μL) para fibroblastos e anticorpos anti-S100 do rato (1:400, 200 μL) para SCs à temperatura ambiente por 30 min, respectivamente.</li>
	<li>Incubar as células com IgG anti-rato de cabra conjugado de 488 por 30 minutos. Use o calibre FACS para realizar a citometria de fluxo e analise os dados usando o software Cell Quest.</li>
	<li>Incubar as células apenas com IgG anti-rato de cabra conjugada de 488 (fibroblastos Group) e mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Controle de isótipo (grupo SCs), que serve como controle negativo.</li>
</ol>4. Análise estatística
<ol><li>Apresentar todos os dados como meio ± SEM. Avaliar diferenças estatísticas nos dados por t-testenão pago usando GraphPad Prism 6.0. Definir significância estatística em p<0,05. Realize todos os ensaios em triplicado.</li>
</ol>

<ol><li>Stierli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+the+homeostasis+and+regeneration+of+peripheral+nerve+is+distinct+from+the+CNS+and+independent+of+a+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28The+Company+of+Biologists%29%22%5BJournal%5D)">The regulation of the homeostasis and regeneration of peripheral nerve is distinct from the CNS and independent of a stem cell population.</a> Development (The Company of Biologists). , (2018).</li>
<li>Schubert, T., Friede, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endoneurial+fibroblasts+in+myelin+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">The role of endoneurial fibroblasts in myelin degradation.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 40 (2), 134-154 (1981).</li>
<li>Dreesmann, L., Mittnacht, U., Lietz, M., Schlosshauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+fibroblast+impact+on+Schwann+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nerve fibroblast impact on Schwann cell behavior.</a> European Journal of Cell Biology. 88 (5), 285-300 (2009).</li>
<li>Lavdas, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+engineered+to+express+the+cell+adhesion+molecule+L1+accelerate+myelination+and+motor+recovery+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Schwann cells engineered to express the cell adhesion molecule L1 accelerate myelination and motor recovery after spinal cord injury.</a> Experimental Neurology. 221 (1), 206-216 (2010).</li>
<li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphB+signaling+directs+peripheral+nerve+regeneration+through+Sox2-dependent+Schwann+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting.</a> Cell. 143 (1), 145-155 (2010).</li>
<li>Benito, C., Davis, C. M., Gomez-Sanchez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+Controls+the+Long-Term+Survival+and+Phenotype+of+Repair+Schwann+Cells+during+Nerve+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">STAT3 Controls the Long-Term Survival and Phenotype of Repair Schwann Cells during Nerve Regeneration.</a> Journal of Neuroscience Research. 37 (16), 4255-4269 (2017).</li>
<li>Zhang, Z. J., Jiang, B. C., Gao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+neuron-glial+cell+interaction+and+pathogenesis+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Chemokines in neuron-glial cell interaction and pathogenesis of neuropathic pain.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (18), 3275-3291 (2017).</li>
<li>Hoke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+express+motor+and+sensory+phenotypes+that+regulate+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Schwann cells express motor and sensory phenotypes that regulate axon regeneration.</a> Journal of Neuroscience. 26 (38), 9646-9655 (2006).</li>
<li>Brushart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+phenotype+is+regulated+by+axon+modality+and+central-peripheral+location%2C+and+persists+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experiment+Neurology%22%5BJournal%5D)">Schwann cell phenotype is regulated by axon modality and central-peripheral location, and persists in vitro.</a> Experiment Neurology. 247, 272-281 (2013).</li>
<li>He, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Gene+Expression+in+Primary+Cultured+Sensory+and+Motor+Nerve+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential Gene Expression in Primary Cultured Sensory and Motor Nerve Fibroblasts.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 1016(2018).</li>
<li>Weinstein, D. E., Wu, R. Chapter 3, Unit 17: Isolation and purification of primary Schwann cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeinstein%2C+DE+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22">Current Protocols in Neuroscience</a>. , (2001).</li>
<li>Palomo Irigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Purification+of+Primary+Rodent+Schwann+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Purification of Primary Rodent Schwann Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1791, 81-93 (2018).</li>
<li>Cheng, L., Khan, M., Mudge, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitonin+gene-related+peptide+promotes+Schwann+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcitonin gene-related peptide promotes Schwann cell proliferation.</a> Journal of Cell Biology. 129 (3), 789-796 (1995).</li>
<li>Pannunzio, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+of+selecting+Schwann+cells+from+adult+mouse+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A new method of selecting Schwann cells from adult mouse sciatic nerve.</a> Journal of Neuroscience Methods. 149 (1), 74-81 (2005).</li>
<li>Shen, M., Tang, W., Cao, Z., Cao, X., Ding, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rat+Schwann+cells+based+on+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of rat Schwann cells based on cell sorting.</a> Molecular Medicine Reports. 16 (2), 1747-1752 (2017).</li>
<li>He, Q., Man, L., Ji, Y., Ding, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+in+the+biological+characteristics+between+primary+cultured+sensory+and+motor+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Comparison in the biological characteristics between primary cultured sensory and motor Schwann cells.</a> Neuroscience Letters. 521 (1), 57-61 (2012).</li>
<li>Weiss, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+and+transcriptomics+of+peripheral+nerve+tissue+and+cells+unravel+new+aspects+of+the+human+Schwann+cell+repair+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Proteomics and transcriptomics of peripheral nerve tissue and cells unravel new aspects of the human Schwann cell repair phenotype.</a> Glia. 64 (12), 2133-2153 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

As duas principais populações celulares de nervos periféricos incluíam SCs e fibroblastos. Os fibroblastos e SCs principalmente cultivados podem auxiliar com precisão na modelagem da fisiologia de fibroblastos e SCs durante o desenvolvimento e regeneração do nervo periférico. O estudo mostrou que as células nervosas ciáticas de ratos P7 continham cerca de 85% das SCs S100-positivas, 13% dos fibroblastos OX7 positivos e apenas 1,5% dos macrófagos OX42 positivos13. Embora o número de fibroblastos se...

No sistema nervoso periférico, as fibras nervosas consistem principalmente de axônios, células schwann (SCs) e fibroblastos, e também contém um pequeno número de macrófagos, células endoteliais microvasculares e células imunes1. Os SCs envolvem os axônios em uma proporção de 1:1 e são fechados por uma camada de tecido conjuntivo chamada endoneurium. Os axônios são então empacotados para formar grupos chamados fascicles, e cada fascículo é envolto em uma camada de tecido conjuntivo conhecida como perineúrio. Finalmente, toda a fibra nervosa é envolta em uma camada de tecido conjuntivo, que é denominada como epineurium. No endônio, toda a população celular é composta por 48% de SCs, e uma parte substancial das células remanescentes envolve fibroblastos2. Além disso, os fibroblastos são componentes importantes de todos os compartimentos nervosos, incluindo o epineurium, o perineúrio e o endônio3. Muitos estudos indicaram que as SCs e os fibroblastos desempenham um papel crucial no processo de regeneração após as lesões nervosas periféricas4,,5,6. Após a transeção do nervo periférico, os fibroblastos perineurial regulam a classificação celular através da via de sinalização efrinina-B/EphB2 entre SCs e fibroblastos, orientando ainda mais o recrescimento axonal através das feridas5. Os fibroblastos nervosos periféricos secretam a proteína tenascin-C e aumentam a migração de SCs durante a regeneração nervosa através da via de sinalização β1-integrin7. No entanto, os SCs e os fibroblastos utilizados nos estudos acima foram derivados do nervo ciático, que inclui nervos sensoriais e motores.
No sistema nervoso periférico, os nervos sensoriais (nervos aferentes) conduzem sinalização sensorial dos receptores para o sistema nervoso central (SNC), enquanto os nervos motores (nervos eferentes) conduzem sinais do SNC aos músculos. Estudos anteriores indicaram que as SCs expressam fenótipos motores e sensoriais distintos e secretam fatores neurotróficos para suportar a regeneração nervosa periférica8,,9. De acordo com um estudo recente, os fibroblastos também expressam diferentes fenótipos motores e sensoriais e afetam a migração das SCs10. Assim, a exploração das diferenças entre fibroblastos/SCs motores e nervosos sensoriais nos permite estudar os complicados mecanismos moleculares subjacentes da regeneração específica do nervo periférico.
Atualmente, existem muitas maneiras de purificar SCs e fibroblastos, incluindo a aplicação de agentes antimitóticos, citolise mediada por anticorpos11,,12, imunopanning sequencial13 e substrato de laminina14. No entanto, todos os métodos acima removem fibroblastos e preservam apenas os SCs. SCs e fibroblastos altamente purificados podem ser obtidos pela tecnologia de classificação de citometria de fluxo15,mas é uma técnica demorada e cara. Assim, neste estudo, foi desenvolvido um método simples de digestão diferencial e adesão diferencial para purificar e isolar fibroblastos sensoriais e motores e SCs, a fim de obter um grande número de fibroblastos e SCs mais rapidamente.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 594 IgG Anti-Rato para Cabras(H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11005</td><td>Diluição: 1:400</td></tr><tr><td>IgG(H+L)Anti-Rato para Cabras Affinipure conjugadas com CoraLite488 Proteintech</td><td></td> <td>SA00013-1</td><td>Diluição: 1:400</td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Software Cell Quest</td><td>Becton Dickinson Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução salina balanceada D-Hank</td><td>Gibco</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Olympus</td><td>SZ2-ILST</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099-141C</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F6886-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield Meio de montagem</td><td>Abcam</td><td>ab104135</td><td></td></tr><tr><td>Meio de fixação / meio de permeabilização</td><td>Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD</td><td>GAS005</td><td></td></tr><tr><td>Citometria de fluxo</td><td>Becton Dickinson Biosciences</td><td>FACS Calibur</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Controle de isotipo</td><td>Abcam</td><td>ab106163</td><td>Diluição: 1:400</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal de camundongo anti-CD90</td><td>Abcam</td><td>ab225</td><td>Diluição: 1:1000 para ICC, 0,1 &micro; g para células 106 para anticorpo</td></tr><tr><td>anti-S100 Flow Cyt Mouse</td><td>Abcam</td><td>ab212816</td><td>Diluição: 1:400</td></tr><tr><td>Polilisina (PLL)</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Proteína de Domínio EGF Humana Recombinante NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF R</td><td>& D Systems</td><td>396-HB-050</td><td></td></tr><tr><td>0,25% (p/v) tripsina</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr></tbody></table>

purificação de fibroblastos e células schwann de nervos sensoriais e motores in vitro

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

As principais células do sistema nervoso periférico são as células Schwann (SCs) e os fibroblastos. Ambas as células expressam claramente os fenótipos sensoriais e motores envolvidos em diferentes padrões de expressão genética de fator neurotrófico e outros processos biológicos, afetando a regeneração nervosa. O presente estudo estabeleceu um protocolo para obter SCs sensoriais e motores de ratos altamente purificados e mais rapidamente. A raiz ventral (nervo motor) e a raiz dorsal (nervo sensorial) de ratos neonatais (7 dias de idade) foram dissociadas e as células foram cultivadas por 4-5 dias, seguidas pelo isolamento de fibroblastos sensoriais e motores e SCs, combinando métodos diferenciais de digestão e adesão diferencial sequencialmente. Os resultados das análises de imunocytoquímica e citometria de fluxo mostraram que a pureza das SCs sensoriais e motoras e dos fibroblastos foi de >90%. Este protocolo pode ser usado para obter um grande número de fibroblastos/SCs sensoriais e motores mais rapidamente, contribuindo para a exploração da regeneração sensorial e do nervo motor.

Observação microscópica leve As SCs e os fibroblastos são as duas principais populações celulares obtidas na cultura celular primária a partir de tecidos nervosos. Após a inoculação por 1h, a maioria das células aderiu ao fundo do prato, e a morfologia celular mudou de redonda para oval. Após a colheita por 24 h, os SCs apresentaram uma morfologia bipolar ou tripolar e o comprimento destes variou de 100 a 200 μm. Após 48 h, ocorreu a agregação e proliferação de células...

Aqui, apresentamos um método para purificar fibroblastos e células Schwann de nervos sensoriais e motores in vitro.

Purificação de Fibroblastos e Células Schwann de nervos sensoriais e motores in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

Este protocolo pode ser usado para obter um grande número de sensores e o fibroblasto motor e células Schwann rapidamente. As células obtidas através desta mensagem podem ser utilizadas no estudo da regeneração nervosa e doenças do sistema nervoso. Mostramos que a demonstração pode representar o experimental para controlar melhor o tempo de passo digestivo diferencial e tornar os passos experimentais mais fáceis de entender.Para estourar use uma tesoura para fazer uma incisão de três centímetros, na pele das costas. Remova a coluna vertebral. Abra cuidadosamente o canal vertebral para expor a medula espinhal.Renda a medula espinhal em uma placa de Petri de 60 milímetros, com três a quatro mililitros de gelo d Hanks solução de sal equilibrado sob um microscópio dissecando, extirem a raiz ventral e a raiz dorsal. Coloque-os em solução de sal balanceada D Hanks. Depois de remover o HBSS, corte os nervos em pedaços de três a cinco milímetros, com uma tesoura.Adicione um mililitro de 0,25% de trippsina e transfira as peças nervosas para cinco tubos de centrífuga mililitro. Incubar a 37 graus Celsius por 18 a 20 minutos. Em seguida, para parar a digestão, adicione em três a quatro milili

purification-fibroblasts-schwann-cells-from-sensory-motor-nerves

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra um procedimento para isolar neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) de embriões de ratos e co-cultivá-los com precursores de células de Schwann para gerar células de Schwann maduras. Os DRGs isolados são processados para isolar neurônios e células gliais. As células isoladas são cultivadas para purificar os neurônios, que são então co-cultivados com células semelhantes a células de Schwann (SCLCs) em um meio de co-cultura. A interação com os neurônios DRG leva à maturação...

Isolamento de neurônios DRG e cocultura com precursores de células de Schwann para gerar células de Schwann

Este vídeo demonstra um protocolo para isolar e cultivar células de Schwann de tecidos dérmicos humanos. A derme humana contém vários tipos de células, incluindo fibroblastos e células de Schwann. Após o isolamento, as células são tratadas com um agente antimitótico para eliminar os fibroblastos em proliferação, resultando em uma cultura pura de células de Schwann.

Isolamento e cultura de células primárias de Schwann de uma derme humana

Este vídeo descreve o isolamento e a cultura de células de Schwann das raízes espinhais de camundongos. As células isoladas são então cultivadas em meios específicos. As células de Schwann são isoladas por digestão diferencial e aderência. Eles são posteriormente transferidos para lamínulas revestidas com matriz extracelular para fixação e proliferação.

Isolamento de células de Schwann de raízes espinhais de camundongos

Este vídeo demonstra o modelo de cocultura de um explante de gânglio da raiz dorsal e células de Schwann. Em condições de cocultura, o ácido ascórbico promove a diferenciação das células de Schwann em formas mielinizantes. As células mielinizantes de Schwann envolvem os axônios várias vezes para criar uma bainha de mielina, que é essencial para a função nervosa.

Co-cultura de um explante de gânglio da raiz dorsal com células de Schwann para mielinização de neurônios

Este vídeo demonstra um método para isolar células de Schwann das fibras do nervo ciático de camundongos.

Separação magnética de células de Schwann de nervos ciáticos de camundongos

Fonte: Han, J., et.al. Regulando o crescimento da célula de Schwann por campo elétrico pulsado de nanossegundos para regeneração nervosa periférica in vitro. J. Vis. Exp. (2024)Este vídeo demonstra a aplicação da técnica de campo elétrico pulsado de nanossegundos (nsPEF) para modular o crescimento da célula de Schwann (SC). Os pulsos elétricos rápidos induzem nanoporos transitórios nas membranas SC, facilitando o influxo de cálcio que ativa as vias de sinalização que conduzem a proliferação,...

Regulando o crescimento de células de Schwann in vitro usando a técnica de campo elétrico pulsado de nanossegundos

Este artigo descreve um sistema de cultura neuronal que pode ser usado para obter grandes quantidades de amostras axonais puras para análises bioquímicas e imunocitoquímicas. Esta técnica permitirá uma melhor compreensão da fisiologia axonal normal e das vias de sinalização que levam à neurodegeneração.

Produção e Isolamento de axônios de neurônios sensoriais para análise bioquímica Usando filtros porosos

As células do estroma da marrow (MSCs) com potencial neural existem dentro da medula óssea. Nosso protocolo enriquece essa população de células por meio de pré-condicionamento hipóxico e, posteriormente, as direciona para se tornar células maduras de Schwann.

Pré-condicionamento hipóxico de células progenitoras derivadas da medula como fonte para a geração de células maduras de Schwann

O estudo da cicatrização de feridas associadas à lesão musculoesquelético muitas vezes requer a avaliação de interações in vitro entre células schwann (SCs), queratinócitos e fibroblastos. Este protocolo descreve o isolamento, acultura e a caracterização dessas células primárias do prepúcio humano.

Isolamento, cultura e caracterização de células primárias de schwann, queratinócitos e fibroblastos de Foreskin Humano

No sistema de cocultura dos gânglios da raiz dorsal e células de Schwann, a mielinização do sistema nervoso periférico pode ser estudada. Este modelo oferece oportunidades experimentais para observar e quantificar a mielinização periférica e estudar os efeitos de compostos de interesse sobre a bainha de mielina.

Mielinização in vitro de axônios periféricos em cocultura de explantes de gânglios dorsais de rato e células de Schwann

Aqui, apresentamos um protocolo para aplicação de campo elétrico de pulso de nanossegundos (nsPEF) para estimular células de Schwann in vitro. A capacidade de síntese e secreção de fatores relevantes e alterações no comportamento celular validaram o sucesso da estimulação usando nsPEF. O estudo dá uma visão positiva do método de regeneração de nervos periféricos.

Regulando o crescimento de células de Schwann por campo elétrico pulsado de nanossegundos para regeneração de nervos periféricos in vitro

Aprenda a purificar fibroblastos e células de Schwann de nervos sensoriais e motores in vitro. Este método rápido e eficiente permite obter culturas com mais de 90% de pureza para estudos de regeneração nervosa e doenças do sistema nervoso.

Purificação de Fibroblastos e Células Schwann de nervos sensoriais e motores in Vitro

Explorar mais vídeos