Preparação da amostra TMT para envio de instalações proteômicas e análise de dados subsequentes

Os principais benefícios deste protocolo são que ele reduz os custos de rotulagem, melhora a extração de proteínas e gera dados de alta qualidade. As principais vantagens do nosso protocolo são a alta eficiência de rotulagem para os diferentes tipos de amostras, sua reprodutibilidade e a aquisição confiável de dados. Depois de isolar amostras de tecido muscular quadríceps de um rato eutanizado de acordo com um protocolo aprovado pela IACUC, pese 10 miligramas de tecido muscular e use pinças para separar as fibras musculares.

Para criar um liseto, transfira a amostra de tecido separado em um tubo de dois mililitros contendo 200 microliters de um milímetro de contas de sílica de zircônia e 500 microliters de tampão de lise CHAPS. Coloque as amostras em um disruptor de contas e realize duas corridas sequenciais de 45 segundos. Após o segundo ciclo, para liberar a proteína ligada ao DNA, sonicar a amostra 10 vezes por 10 segundos por sônica em uma amplitude de 50% com intervalos de 30 segundos no gelo.

Após a última sônicação, centrifugar o lise e transferir o supernante para um novo tubo de centrífuga. Para reduzir/alquilar o tratamento de reagentes, transfira 200 microgramas de proteína por condição em novos tubos de centrífuga e use tampão de lise CHAPS fresco para trazer o volume final em cada tubo até 100 microliters. Em seguida, adicione cinco microliters de TCEP a cada tubo e incubar as amostras a 55 graus Celsius por uma hora.

Ao final da incubação, dissolva nove miligramas de iodoacetamida em 132 microlitadores de 100 mililitros TEAB e proteja a solução de iodoacetamida de 375 milimiliar da luz. Em seguida, adicione cinco microliters de iodoacetamida a cada amostra e incubar por 30 minutos à temperatura ambiente protegido da luz. Para precipitação de metanol/clorofórmio, adicione 400 microliters de metanol a cada 100 microliters de proteína e brevemente vórtice das amostras.

Para incorporar os líquidos depositados nas laterais dos tubos de amostra, centrifugar brevemente as amostras e adicionar 100 microliters de clorofórmio a cada tubo. Após um breve vórtice, centrifufique rapidamente os tubos novamente para coletar o líquido nas laterais dos tubos e adicionar 300 microliters de água às amostras. Vórtice vigorosamente para obter soluções homogêneas e centrifugar as amostras por um minuto sob as mesmas condições centrífugas.

No final da centrífuga, transfira os tubos cuidadosamente para um rack sem perturbar as camadas e remova cuidadosamente o supernatante. Adicione 300 microliters de metanol às fases inter e inferior restantes e vórtice as amostras vigorosamente novamente. Centrifugar as amostras por dois minutos e aspirar cuidadosamente os supernantes.

Em seguida, aspire suavemente o máximo de líquido de cada amostra possível sob um fluxo de ar até que as pelotas estejam um pouco úmidas. Avalie a hidratação a cada dois minutos por cerca de 10 minutos. Se necessário, as pelotas podem ser armazenadas a menos 80 graus Celsius até um processamento adicional.

Para digerir a proteína, resuspenque a pelota precipitada em 100 microliters de tampão de lise TEAB e adicione 100 microliters de solução de armazenamento de trippsina ao fundo de um frasco de vidro de trippsina de 100 microgramas. Após cinco minutos à temperatura ambiente, adicione 2,5 microlitadores da solução de trippsina recém-preparada por 100 microgramas de proteína a cada amostra e incubar as amostras a 37 graus Celsius durante a noite. Para rotulagem de peptídeo, dissolva cada frasco de etiqueta TMT de 0,8 miligrama com 41 microliters de acetonitrilo anidro por tag e incubar os reagentes por cinco minutos à temperatura ambiente com vórtices ocasionais, mantendo os rótulos protegidos da luz.

Ao final da incubação, centrifufique brevemente os frascos e adicione cuidadosamente 41 microliters de reagente de etiqueta TMT a cada amostra de 100 microliteres para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente. Ao final da incubação, sacie as reações com a adição de oito microlitradores de 5% de hidroxilamina por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, divida as amostras em alíquotas iguais em novos tubos de centrífuga para armazenamento a menos 80 graus Celsius.

Nesta aquisição de dados representativos, foram analisados 39.653 peptídeos totais, dos quais 4.457 tinham igual ou superior a dois peptídeos únicos e 3.829 incluíam íons repórteres para todos os canais. Um corte de mudança de dobra foi usado para determinar a distribuição relativa de proteínas de doentes em comparação com células saudáveis com 296 proteínas de abundância significativamente menor e 108 proteínas de abundância significativamente maior observada. A análise panther mostrou uma lista categorizada de proteínas baseadas em abundância significativamente menor ou maior de células doentes com base em sua função molecular.

A análise de cordas das proteínas de abundância significativamente menor ou maior identificou ainda múltiplas interações e fortes associações entre proteínas. Métodos adicionais podem ser realizados para identificar interações proteína-proteína, classificar as interações por grupos e identificar as interações em uma variedade de caminhos. As técnicas de proteômica são ferramentas poderosas dentro dos campos de pesquisa biomédica para entender os mecanismos de desenvolvimento de doenças, fornecendo informações detalhadas sobre abundância de proteínas.