Name: Avaliando a Habilidade Fagocítica Específica da Idade dos Hemócitos de Melanogaster Drosophila Adulto usando um Ensaio de Faagocitose In Vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Aprenda a avaliar a fagocitose em hemócitos de Drosophila melanogaster jovens e envelhecidos usando um ensaio in vivo. Este método permite quantificar eventos fagocíticos em células individuais e detectar variações entre genótipos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde R03 AG061484-02 e do UmBC College of Natural and Mathematical Sciences Becton Dickinson Faculty Research Fund.

<ol><li>Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+DNA%2FRNA+methyltransferase+contributes+to+robust+host+defense+in+ageing+animals+by+regulating+sphingolipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in ageing animals by regulating sphingolipid metabolism.</a> The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 22 (2018).</li>
<li>DeVeale, B., Brummel, T., Seroude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+and+aging%3A+the+enemy+within%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Immunity and aging: the enemy within.</a> Aging Cell. 3 (4), 195-208 (2004).</li>
<li>Gomez, C. R., Nomellini, V., Faunce, D. E., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Innate immunity and aging.</a> Experimental Gerontology. 43 (8), 718-728 (2008).</li>
<li>Panda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+innate+immunosenescence%3A+causes+and+consequences+for+immunity+in+old+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human innate immunosenescence: causes and consequences for immunity in old age.</a> Trends in Immunology. 30 (7), 325-333 (2009).</li>
<li>Aw, D., Silva, A. B., Palmer, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosenescence%3A+emerging+challenges+for+an+ageing+population%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunosenescence: emerging challenges for an ageing population.</a> Immunology. 120 (4), 435-446 (2007).</li>
<li>Min, K. -J., Tatar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+molecular+mechanism+of+immunosenescence+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Unraveling the molecular mechanism of immunosenescence in Drosophila.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), 2472(2018).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+on+the+fly%3A+a+primer+on+the+Drosophila+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system.</a> Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).</li>
<li>Banerjee, U., Girard, J. R., Goins, L. M., Spratford, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+genetic+model+for+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a genetic model for hematopoiesis.</a> Genetics. 211 (2), 367-417 (2019).</li>
<li>Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+phagocytosis+and+identification+of+a+Drosophila+receptor+for+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli.</a> Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).</li>
<li>Garschall, K., Flatt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interplay+between+immunity+and+aging+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">The interplay between immunity and aging in Drosophila.</a> F1000Research. 7, (2018).</li>
<li>Brennan, C. A., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%3A+The+genetics+of+innate+immune+recognition+and+response%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Drosophila: The genetics of innate immune recognition and response.</a> Annual Review of Immunology. 22 (1), 457-483 (2004).</li>
<li>Rosales, C., Uribe-Querol, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+a+fundamental+process+in+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: a fundamental process in immunity.</a> BioMed Research International. 9042851, Research article (2017).</li>
<li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+going+through+the+acid+test%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (10), 781-795 (2008).</li>
<li>Stuart, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systems+biology+analysis+of+the+Drosophila+phagosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A systems biology analysis of the Drosophila phagosome.</a> Nature. 445 (7123), 95-101 (2007).</li>
<li>Mackenzie, D. K., Bussière, L. F., Tinsley, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence+of+the+cellular+immune+response+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Senescence of the cellular immune response in Drosophila melanogaster.</a> Experimental Gerontology. 46 (11), 853-859 (2011).</li>
<li>Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+ability+declines+with+age+in+adult+Drosophila+hemocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes.</a> Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).</li>
<li>Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+cellular+and+humoral+immune+responses+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila.</a> Current Biology. 10 (13), 781-784 (2000).</li>
<li>Garg, A., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Rab14+mediates+phagocytosis+in+the+immune+response+to+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).</li>
<li>Bloomington Drosophila Stock Center: Indiana University Bloomington. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/innformation/recipes/molassesfood.html">https://bdsc.indiana.edu/innformation/recipes/molassesfood.html</a> (2019).</li>
<li>Fellous, S., Lazzaro, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+food+quality+affects+adult+%28but+not+larval%29+immune+gene+expression+independent+of+effects+on+general+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Larval food quality affects adult (but not larval) immune gene expression independent of effects on general condition.</a> Molecular Ecology. 19 (7), 1462-1468 (2010).</li>
<li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemese%2C+a+hemocyte-specific+transmembrane+protein%2C+affects+the+cellular+immune+response+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2622-2627 (2003).</li>
<li>Goto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+haemocyte-specific+protein%2C+hemolectin%2C+similar+to+human+von+Willebrand+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">A Drosophila haemocyte-specific protein, hemolectin, similar to human von Willebrand factor.</a> Biochemical Journal. 359, Pt 1 99-108 (2001).</li>
<li>Cevik, D., Acker, M., Michalski, C., Jacobs, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericardin%2C+a+Drosophila+collagen%2C+facilitates+accumulation+of+hemocytes+at+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Pericardin, a Drosophila collagen, facilitates accumulation of hemocytes at the heart.</a> Developmental Biology. 454 (1), 52-65 (2019).</li>
<li>Ghosh, S., Mandal, S., Mandal, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+proliferation+of+adult+hemocytes+in+Drosophila+by+BrdU+incorporation+and+PH3+expression+in+response+to+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Wellcome+Open+Research%22%5BJournal%5D)">Detecting proliferation of adult hemocytes in Drosophila by BrdU incorporation and PH3 expression in response to bacterial infection.</a> Wellcome Open Research. 3, (2018).</li>
<li>Hao, Y., Yu, S., Luo, F., Jin, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jumu+is+required+for+circulating+hemocyte+differentiation+and+phagocytosis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">Jumu is required for circulating hemocyte differentiation and phagocytosis in Drosophila.</a> Cell Communication and Signaling. 16 (1), 95(2018).</li>
<li>Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+blood+cell+populations+of+the+Drosophila+melanogaster+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assaying blood cell populations of the Drosophila melanogaster larva.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).</li>
<li>Gyoergy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+allowing+independent+visualization+and+genetic+manipulation+of+Drosophila+melanogaster+macrophages+and+surrounding+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tools allowing independent visualization and genetic manipulation of Drosophila melanogaster macrophages and surrounding Tissues.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (3), 845-857 (2018).</li>
<li>Bosch, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+cells+of+adult+Drosophila+do+not+expand%2C+but+control+survival+after+bacterial+infection+by+induction+of+Drosocin+around+their+reservoir+at+the+respiratory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Blood cells of adult Drosophila do not expand, but control survival after bacterial infection by induction of Drosocin around their reservoir at the respiratory epithelia.</a> BioRxiv. 578864, (2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo descrito aqui é uma maneira confiável de quantificar diferentes aspectos da faagocytose, sob condições experimentais controladas. Notamos que só testamos este procedimento com partículas bacterianas gram negativas e os resultados podem diferir se partículas bacterianas gram positivas forem usadas. De fato, seria interessante comparar as respostas fagocíticas com bactérias gram negativas e gram positivas em diferentes condições experimentais. O uso de um nano-injetor permite um controle preciso sobre os volumes de injeção, garantindo que cada mosca seja injetada com o mesmo volume de partículas. Uma limitação ao protocolo vem de inconsistências nas preparações de partículas. As partículas se agregarão uma vez congeladas, de modo que pequenas variações nos volumes de diluição, ou falta de vórtice, podem afetar a concentração de partículas entre experimentos. Para minimizar possíveis variações nas concentrações de partículas entre as idades, é benéfico injetar moscas de 1 e 5 semanas no mesmo dia, usando a mesma solução de agulha e partículas. Outra desvantagem potencial é que durante as dissecções, o vaso dorsal e/ou cutícula podem ser facilmente danificados se os pinos não forem manuseados corretamente. Para evitar interromper o vaso dorsal, minimize o número de pinos utilizados por dissecção. A vantagem deste método de dissecção é que todas as etapas de fixação, lavagem e coloração podem ser realizadas na placa de dissecção. Como as cutículas estão presas, isso evita que as cutículas se percam entre os passos.
Em comparação com os métodos existentes18,,19,,25,,26,,27,,28,,29, o protocolo descrito tem suas vantagens e limitações. Ao dissecar o vaso dorsal, somos capazes de visualizar e quantificar hemócitos individuais neste local. Isso permite detectar variações sutis na atividade fagocítica entre grupos experimentais. Outros métodos visualizam partículas fluorescentes rotuladas através da coleta de hemócitos usando um ensaio bleed/scrape19,25,26,27, ou através de uma cutícula ventral intacta18,19,28,29; no entanto, hemócitos individuais não podem ser avaliados quando visualizados através da cutícula dorsal. A vantagem deste protocolo, quando comparado ao método Bleed/Scrape é que nosso método nos permite avaliar apenas os hemócitos associados ao vaso dorsal, e explica as células circulantes ou aquelas ao longo da parede do corpo, que podem ser funcionalmente diferentes. Dissecar o vaso dorsal também remove a necessidade de incluir uma segunda rodada de injeções com uma fluorescência quencher, como trypan azul19,26. Isso ocorre porque todas as partículas não vinculadas ou engolidas por uma célula serão lavadas durante as etapas de lavagem. Por outro lado, métodos alternativos podem ser mais fáceis de executar porque não requerem dissecções. Embora dissecar o vaso dorsal seja fácil de aprender, esta etapa adiciona um nível de complexidade que pode não ser viável em alguns projetos experimentais.
Embora o uso descrito deste ensaio de fagocitose in vivo seja para avaliar e quantificar eventos fagocíticos entre diferentes idades, este protocolo é altamente adaptável e pode ser usado para analisar diferentes aspectos da fagocitose entre genótipo, sexo ou tipo de tecido. Com a fagocitose sendo de importância central para a maioria dos animais multicelulares, entender como esse processo diminui com a idade pode levar a melhores tratamentos terapêuticos para a população envelhecida. Essa abordagem oferece potencial de longo prazo para elucidar aspectos das mudanças relacionadas à idade na resposta imune, com foco especial na fagocitose.

O sistema imunológico inato, que consiste em barreiras físicas e químicas à infecção, bem como componentes celulares, é conservado evolutivo entre organismos multicelulares1,,2. Como primeira linha de defesa, o sistema imunológico inato desempenha um papel crítico no combate a patógenos invasores em todos os animais1,,2,3. Os componentes da resposta imune inata incluem uma ampla gama de tipos de células que são classificadas com base na falta de especificidade e memória imunológica2,,3,,4. Em humanos, esses tipos de células incluem monócitos fácticos e macrófagos, neutrófilos e células assassinas naturais citotóxicas4,,5. Embora ter um sistema imunológico funcional seja imperativo para a sobrevivência do hospedeiro, é claro que a função das células imunes diminui com a idade, fenômeno conhecido como imunosenescência5,,6. Ser capaz de avaliar mudanças relacionadas à idade na resposta imune, incluindo diferentes aspectos do processo de fagocitose, poderia ajudar na nossa compreensão da imunosenescência. O procedimento que descrevemos aqui fornece uma abordagem eficaz e repetível para avaliar e quantificar eventos faócticos por hemócitos em Drosophila melanogaster.
A drosophila é um modelo ideal para estudar a resposta imune por muitas razões. Por um tempo, há um extenso conjunto de ferramentas genéticas disponíveis que tornam possível manipular facilmente a expressão genética de forma dependente de tecidos7. Essas ferramentas incluem uma coleção de mutantes, estoques de interferência de RNA, estoques GAL4/UAS e o Painel de Referência Genética Drosophila que contém 205 linhas de raça diferentes para as quais todas as sequências de genoma são catalogadas8. O curto ciclo de vida da Drosophila e o grande número de indivíduos produzidos permitem aos pesquisadores testar múltiplos indivíduos em um ambiente controlado, em um curto período de tempo. Isso melhora muito a capacidade de identificar diferenças sutis nas respostas imunes à infecção entre genótipos, entre sexos ou entre idades. É importante ressaltar que muitos componentes genéticos e funções da resposta imune inata, incluindo a fagocitose, são evolutivamente conservados entre drosophila e mamíferos1,2.
Em Drosophila, o processo de fagocitose que se segue à infecção é realizado por hemócitos fagocíticos chamados plasmatócitos, que equivalem aos macrófagosmamíferos 9. Os hemócitos são essenciais para reconhecer uma ampla gama de partículas e limpar patógenos microbianos9,,10,,11,12,13. Essas células expressam uma variedade de receptores que devem diferenciar-se do não-auto, e iniciar eventos de sinalização necessários para realizar o processo fagocítico10,,11,12,,13,,14,15. Uma vez que uma partícula é amarrada, ela começa a ser internalizada pela reorganização do citoesqueleto de actina e remodelação da membrana plasmática para expandir-se em torno da partícula, formando um copo fagocítico11,,12,,13,14. Durante esse processo, outro conjunto de sinais diz à célula para internalizar ainda mais a partícula, fechando o copo fagocítico, formando um fágora ligado à membrana11,,12,13,,14,15. O fágora passa então por um processo de maturação, associando-se com diferentes proteínas e fundindo-se com lisosomos, formando um fagolico ácido11,12,13,14,15. Neste ponto, as partículas podem ser degradadas e eliminadas de forma eficiente11,12,13,14,15. Estudos de drosophila revelaram que moscas mais velhas (4 semanas de idade) têm uma capacidade reduzida de limpar uma infecção em comparação com moscas mais jovens (1 semana de idade), provavelmente devido, pelo menos em parte, a um declínio em alguns aspectos da faagocitose16,17.
O método descrito aqui utiliza duas partículas E. coli com rótulos fluorescentes separados, uma com fluorohore padrão e outra sensível ao pH, para avaliar dois aspectos diferentes da fagocitose: o engolfamento inicial das partículas e a degradação das partículas no fagoliossomo. Neste ensaio, fluorescência fluoro-partícula é observável quando as partículas são amarradas e engolidas por hemócitos, enquanto partículas sensíveis ao pH fluorescem apenas nas baixas condições de pH do fagosome. Eventos fluorescentes podem então ser observados em hemócitos que se localizam ao longo do vaso dorsal. Focamos em hemócitos localizados no vaso dorsal, que fornecem um marco anatômico para localizar hemócitos que são conhecidos por contribuir para o despejo bacteriano, e para isolá-los consistentemente. No entanto, hemócitos em outras partes do corpo e hemoglifos também são importantes para a liberação. Embora não tenhamos estudado essa população celular, nosso procedimento geral pode ser aplicável para ensaios fagocíticos dessas células também. Uma vantagem de nossa abordagem é que podemos quantificar eventos fagocíticos dentro de hemócitos individuais, permitindo detectar variações sutis nos processos fagocíticos. Outros estudos que visualizam eventos fluorescentes através da cutícula18,19 não explicam as diferenças no número de hemócitos presentes, o que é especialmente importante considerar no nosso caso como a contagem total de hemócitos deve mudar com a idadede 17 anos.

<table><tbody><tr><td>0,10 mm de alfinetes de insetos</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>Aqui: os pinos são cortados ao meio, e a ponta afiada é usada</td></tr><tr><td>Seringas estéreis de 1 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td>Preenchido com óleo mineral para carregar agulha</td></tr><tr><td>15% Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>para meios de dissecção</td></tr><tr><td>16% Paraformaldeído</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>15710</td><td>EM-grade, 4% de trabalho, diluído em 1X PBS</td></tr><tr><td>1x solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Trasnfer Pipet</td><td>Falcon</td><td>357524</td><td></td></tr><tr><td>3.5" Capilares de Vidro</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td>1.14mm O.D X 3.5" comprimento X 0.53" I.D</td></tr><tr><td>35x10 mm Placas de Petri</td><td>Becton Dickinson</td><td>351008</td><td>Usado como placa de dissecação, preenchido até a metade com Sylgard</td></tr><tr><td>6x penicilina/estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>para meios de dissecção</td></tr><tr><td>70% Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de vórtice analógico</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de ponto biológico, Dumont No. 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol)</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td>Diluído 1:1000 em 1x cepa</td></tr><tr><td></td><td></td> PBST<td>Drosophila</td><td>w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8</td></tr><tr><td>E. coli (cepa K-12) BioParticles&trade;, Alexa Fluor&trade; 594 conjugado</td><td>Life Technologies</td><td>E23370</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de vidro</td><td>Premiere</td><td>D17026102</td><td></td></tr><tr><td>Solução de imagem de células vivas</td><td>Life Technologies</td><td>A14291DJ</td><td>preferido para preparação e diluição de partículas</td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Mpbio</td><td></td><td></td>194836</tr><tr><td>Nanoject II injetor automático de nanolitros</td> Frascos de Drosophila Super Bulk de Poliestireno <td>Estreito Drummond</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Genesee</td><td>32-116SB</td><td>Tamanho: 25 X 95 mm</td></tr><tr><td>Misturador de Nutating</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-043</td><td>Velocidade usada: 20 rpm</td></tr><tr><td>pHrodo&trade; E. coli vermelha BioPartículas&comércio; Conjugado para Phagocytosis</td><td>Life Technologies</td><td>P35361</td><td></td></tr><tr><td>Schneider's Drosophila cell culture media (1x)</td><td>Gibco</td><td>21720-024</td><td>Meios de dissecação, combinar: Schneiders, FBS, e caneta/estreptococos; esterilizar por filtro</td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>2mM (ou 20%) trabalhando</td></tr><tr><td>Tesoura de mola</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Ciências</td><td>24236-10</td> da <td>microscopia eletrônica</td> do elastómetro do silicone <td>Prepare de acordo com o protocolo fornecido</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td>para PBS + 0,1% tween</td></tr><tr><td>Extrator vertical da pipeta Modelo 700C</td><td>Instrumentos de David Kopf</td><td>812368</td><td>calefator: 55? Solenóide: 45</td></tr><tr><td>microscópio fluorescente Zeiss AxioImager.Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Here: Sistema de interferência estrutural Apotome com software de imagem Zeiss Zen</td></tr></tbody></table>

avaliando a habilidade fagocítica específica da idade dos hemócitos de melanogaster drosophila adulto usando um ensaio de faagocitose in vivo

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

A fagocitose é uma função essencial da resposta imune inata. Este processo é realizado por hemócitos fagocíticos cuja função primária é reconhecer uma ampla gama de partículas e destruir patógenos microbianos. À medida que os organismos envelhecem, esse processo começa a diminuir, mas pouco se sabe sobre os mecanismos subjacentes ou a base genética da imunosenescência. Aqui, uma injeção baseada em ensaio de fagocitose in vivo é utilizada para avaliar mudanças relacionadas à idade em diferentes aspectos da fagocitose, como ligação, engolamento e degradação de partículas internalizadas, quantificando eventos fagocícitos em hemócitos em Drosophila adulto. Drosophila melanogaster tornou-se um modelo ideal para investigar mudanças relacionadas à idade na função imunológica inata por muitas razões. Por um só, muitos componentes genéticos e funções da resposta imune inata, incluindo a fagocitose, são evolutivamente conservados entre drosophila e mamíferos. Por causa disso, os resultados obtidos com o uso deste protocolo provavelmente serão amplamente relevantes para a compreensão das mudanças relacionadas à idade na função imunológica em uma variedade de organismos. Além disso, observamos que este método fornece estimativas quantitativas da capacidade fagocítica hemocito, que poderia ser útil para uma variedade de tópicos de pesquisa, e não precisa se limitar a estudos de envelhecimento.

Para ilustrar os métodos de injeção descritos, a Figura 1A mostra o local de injeção em Drosophila melanogaster, bem como como o corante alimentar permite uma confirmação visual de que a mosca foi injetada(Figura 1B). A adição de corante alimentar também auxilia no reconhecimento de uma agulha entupida. As injeções podem ser realizadas no abdômen, mas mantêm o local de injeção consistente entre os experimentos. Isso ajudará a minimizar possíveis variações entre cada experimento.
Para visualizar as partículas fluorescentes rotuladas dentro de hemócitos residentes ao longo do vaso dorsal, dissecamos o vaso dorsal e anexamos cutícula abdominal. A Figura 2A-F descreve os métodos de dissecção.
Para avaliar a capacidade específica da idade das moscas jovens e idosas para realizar fagocitose, os hemócitos ao longo do vaso dorsal são visualizados usando um microscópio fluorescente. Para garantir que apenas as células ao longo do vaso dorsal sejam contadas, podem ser utilizados anticorpos ou genes marcados por GFP para certos marcadores de células sanguíneas ou colágeno específico do coração, como Hemese e Hemolectina, ou Pericardina(Figura 3),respectivamente, 22,,23,,24. Partículas E. coli fluorescentes são de 1 mm de comprimento, enquanto os hemócitos têm 10 mm de diâmetro17. Apenas são contabilizados aqueles eventos fluorescentes localizados dentro de um diâmetro de 10 mm centrados em um núcleo DAPI positivo(Figura 4). Para quantificar eventos fluorescentes, é utilizado o software ImageJ(Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig1.jpg"> Figura 1: Local de injeção e verificação visual. (A) O lado lateral do tórax é perfurado com uma agulha capilar puxada. (B) As injeções são verificadas visualmente adicionando corante de alimentos verdes à solução de partículas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig2.jpg"> Figura 2: Dissecção do vaso dorsal. (A) Os pinos são colocados no tórax e abdômen posterior (setas pretas). (B-C) Duas incisões horizontais (setas verdes) são feitas na extremidade posterior do abdômen(B)e na extremidade anterior(C). (D) Uma incisão vertical (arqueiro verde) é feita no meio do abdômen, conectando os dois cortes horizontais. (E) Os pinos opcionais (*) são usados para abrir a cavidade abdominal, expondo o tecido interno. (F) O tecido interno (cultura, intestino, útero, ovários, corpos gordos) é removido, expondo o vaso dorsal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig3.jpg"> Figura 3: Visão ventral de um vaso dorsal dissecado de uma fêmea de 5 semanas injetada com partículas sensíveis ao pH, manchadas com anticorpos direcionados contra Pericardin (A). A linha branca pontilhada descreve o lado lateral do vaso dorsal, com seta apontando para a região anterior. (B) Imagem ampliada de (A): aglomerados de hemócitos (seta azul) que estavam ativamente degradando bactérias, dentro da primeira câmara aórtica do vaso dorsal. (C) Imagem ampliada de (A) delineando a proteína de colágeno extracelular (ECM), pericardina (arqueiro verde), que mantém o vaso dorsal no lugar24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig4.jpg"> Figura 4: Vaso dorsal dissecado e hemócitos associados de uma mosca fêmea injetado com partículas sensíveis ao pH, ou fluoro-partículas. (A) O vaso dorsal e os hemócitos associados com partículas E. coli com rótulo de pH (vermelho) ou (E) fluoro-rotulados partículas E. coli (vermelho), isolados de uma mosca de uma semana de idade, após a recuperação por 60 minutos.(B,F) Inset ampliado de (A) e (E) (caixa branca), respectivamente, mostrando dois hemocitos individuais com eventos contados. (C) O vaso dorsal e hemócitos associados com partículas E. coli com rótulo de pH (vermelho), ou ( G) fluoro-rotulado partículas E. coli (vermelho), isolados de uma mosca de 5 semanas de idade, após a recuperação por 60 minutos. (D,H) Inset ampliado de (C) e (G) (caixa branca), respectivamente, mostrando dois hemocitos individuais com eventos contados. A linha branca pontilhada descreve o lado lateral do vaso dorsal, com seta apontando para a região anterior. Núcleos manchados com DAPI (azul). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig5.jpg"> Figura 5: Quantificando eventos fagocícitos dentro de um hemócito de 10 mm usando o contador celular em ImageJ. (A) Após a abertura de imagens no ImageJ, a ferramenta Cell Counter Notice pode ser usada para acompanhar eventos fagocíticos por célula. (B) Esta ferramenta atribuirá uma cor diferente a cada célula selecionada a ser contada, com cada ponto correspondente a um evento fluorescente dentro dessa célula. Pressionar 'alt+y' exibirá uma tabela mostrando o número de eventos contados por célula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo descreve um ensaio in vivo da fagocitose utilizado para avaliar e quantificar a capacidade dos hemócitos de melanogaster de Drosophila jovens e envelhecidos para bactérias fagocitose..

Avaliando a Habilidade Fagocítica Específica da Idade dos Hemócitos de Melanogaster Drosophila Adulto usando um Ensaio de Faagocitose In Vivo

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Nosso protocolo fornece uma abordagem eficaz e repetível para avaliar e quantificar eventos fagocíticos em hemócitos. A principal vantagem dessa técnica é que podemos quantificar eventos fagocíticos dentro de hemócitos individuais que nos permitem detectar variações nos processos fagocíticos entre genótipos em moscas individuais. Realizar dissecções pode ser um desafio, por isso, ao realizar essa técnica pela primeira vez, pratique dissecções o máximo possível antes de realizar o procedimento completo.Comece preparando agulhas de vidro para injeção. Encha uma seringa de um milímetro com óleo mineral e conecte a agulha hipodérmica de calibre 30 fornecida com o nano-injetor. Insira a agulha de calibre 30 na extremidade cega de uma agulha capilar puxada e encha-a com óleo mineral.Remova lentamente a agulha de calibre 30 certificando-se de que não se formem bolhas de ar. Remova o collet e coloque o o-anel O selado com o recuo voltado para cima. Coloque o anel O maior sobre o êmbolo metálico e recoloque a collet sem apertar.Insira o êmbolo metálico na extremidade contundente da agulha de vidro cheia de óleo e empurre-o suavemente para baixo, inserindo-o no anel O maior. Em seguida, aperte a collet até ficar em segurança. Depois de encher a agulha com partículas fluoro ou pH, injete as moscas na placa esternopleural do tórax.A injeção é bem sucedida se o corante verde está indo para a mosca. Coloque as moscas injetadas em um novo frasco de comida observando a hora em que a primeira e última mosca foram injetadas. Coloque o frasco de lado até que todas as moscas se recuperem para evitar que grudem na comida.Oriente o lado ventral da mosca sob um estereótipo dissetante. Em seguida, insira um pino de inseto no tórax e outro através da extremidade mais posterior do abdômen perto da genitália. Uma vez que todas as moscas tenham sido presas, use um pipet de transferência para adicionar mídia de dissecção suficiente para cobrir as moscas.Remova a cabeça com uma tesoura de cutícula e faça uma incisão horizontal diretamente acima do pino posterior no abdômen, depois outra na extremidade mais anterior do abdômen. Faça uma incisão vertical conectando as duas incisões horizontais que abrirão a cavidade abdominal. Use fórceps para remover os órgãos internos e tecido, certificando-se de evitar o vaso dorsal.Se necessário, use pinos adicionais para fixar as extremidades de corte da cutícula. Em seguida, remova o tórax com a tesoura da cutícula. Descarte a mídia de dissecção e substitua-a por um mililitro de 4%, protegendo as dissecções da luz o máximo possível.Fixar as dissecções por 15 minutos em temperatura ambiente enquanto balança a 20 rpm. Em seguida, remova o fixador e adicione um mililitro de 1X PBST. Se desejar, manche as dissecções com anticorpos.Depois de montar as cutículas em um slide de microscópio, use fórceps para orientá-los do lado ventral para cima, e certifique-se de que o vaso dorsal é visível. Moscas jovens e idosas foram avaliadas pela capacidade específica da idade de realizar fagocitose por imagem fluorescente de hemócitos ao longo do vaso dorsal. Um anticorpo contra pericártina foi usado para garantir que apenas células ao longo do vaso dorsal fossem contadas.Uma vez que partículas E.coli fluorescentes são um micrômetro de comprimento e hemócitos têm 10 micrômetros de diâmetro, apenas eventos fluorescentes dentro de um diâmetro de 10 micrômetros centrados em um núcleo DAPI positivo foram contados. O software ImageJ foi então usado para quantificar os eventos. Ao tentar este procedimento, é importante visualizar que a mosca foi realmente injetada e lembrar que o tempo é crítico.Completar injeções e dissecções em tempo hábil ajudará a minimizar erros experimentais e possíveis variações na taxa fagocítica. Essa técnica permitirá que os pesquisadores explorem uma variedade de tópicos de pesquisa, incluindo questões sobre imunidade celular, diferentes populações de células sanguíneas ou distinção da fagocitose da produção de AMP durante uma resposta imune bem sucedida.

assessing-age-specific-phagocytic-ability-adult-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Hemócitos Drosophila dispersam sobre a totalidade do embrião em desenvolvimento. Este protocolo demonstra como montar e imagem essas migrações usando embriões com hemócitos fluorescente etiquetado.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

A hemolinfa da Drosophila serve como sangue e fluido intersticial, circulando por todo o corpo durante os estágios larva e adulto. Este vídeo descreve um protocolo de coleta de hemolinfa larval para quantificar as células circulantes.

Ruptura da cutícula: um método para coletar hemolinfa de larvas de Drosophila

Este vídeo demonstra uma técnica de imunocoloração para visualizar o engolfamento de células apoptóticas nas células embrionárias homogeneizadas de Drosophila melanogaster. Este método fornece informações sobre a fisiologia celular, determinando a extensão do engolfamento celular apoptótico.

O ensaio de fagocitose: uma técnica de imunocoloração para visualizar o engolfamento de células apoptóticas nas células embrionárias de Drosophila melanogaster

Este vídeo demonstra um ensaio in vivo projetado para medir a fagocitose bacteriana em moscas Drosophila adultas. Após a injeção de bactérias marcadas com fluorescência no abdômen de moscas adultas, os hemócitos associados ao vaso dorsal se envolvem em fagocitose. A introdução do corante azul de tripano serve para extinguir a fluorescência emitida por bactérias extracelulares não fagocitadas. Este processo de têmpera melhora a identificação de bactérias fagocitadas quando observadas sob um...

Um ensaio in vivo para quantificar a fagocitose bacteriana em moscas Drosophila adultas

As células sanguíneas de Drosophila, ou hemócitos, circulam entre os locais residentes e a circulação.  Na larva, os hemócitos residentes (sésseis) localizam-se em microambientes indutivos, as bolsas hematopoiéticas, enquanto os hemócitos circulantes se movem livremente na hemolinfa. O objetivo deste protocolo é o isolamento e quantificação padronizados dessas duas populações de hemócitos comportamentalmente distintas, mas intercambiáveis.

Ensaiando populações de células do sangue<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

Sistemas hematopoiéticas de mamífero Drosophila e compartilham muitas características comuns, tornando Drosophila um modelo genético atraente para estudar hematopoiese. Aqui demonstramos dissecção e montagem do principal órgão hematopoiético larval para imuno-histoquímica. Descrevemos também métodos para ensaiar vários compartimentos hematopoiéticos larvais incluindo hemócitos circulantes e células de cristal sésseis.

Métodos para examinar a linfa Gland e Hemócitos em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Aqui descrevemos um ensaio de fagocitose usando as células embrionárias dispersas de Drosophila . Ele nos permite quantificar de forma fácil e precisa os níveis de fagocitose in vivo e identificar novas moléculas necessárias para a fagocitose das células apoptóticas.

Ensaio de fagocitose para células apoptóticas em Drosophila Embriões

Este método demonstra como visualizar a invasão do patógeno em células de inseto com modelos tridimensionais (3D). Hemócitos de larvas de Drosophila foram infectados com patógenos virais ou bacterianos, ou ex vivo ou no vivo. Hemócitos infectados foram, em seguida, fixa e manchados para a imagem latente com um microscópio confocal e subsequente reconstrução celular 3D.

Extração de hemócitos de larvas de Drosophila melanogaster para infecção microbiana e análise

Este protocolo descreve um ensaio in vivo de fagocitose no adulto Drosophila melanogaster para quantificar o fagócito reconhecimento e apuramento das infecções microbianas.

Avaliar a resposta imune celular de mosca da fruta, Drosophila melanogaster, usando um ensaio de fagocitose em Vivo

Este protocolo é projetado avaliar a viabilidade de Drosophila em cada estágio desenvolvente, do embrião ao adulto. O método pode ser utilizado para determinar e comparar a viabilidade de diferentes genótipos ou condições de crescimento.

Um método direto e simples para avaliar a viabilidade da Drosophila melanogasterdo embrião ao adulto

Aprenda a avaliar a fagocitose em hemócitos de Drosophila melanogaster jovens e envelhecidos usando um ensaio in vivo. Este método permite quantificar eventos fagocíticos em células individuais e detectar variações entre genótipos.

Avaliando a Habilidade Fagocítica Específica da Idade dos Hemócitos de Melanogaster Drosophila Adulto usando um Ensaio de Faagocitose In Vivo (Vídeo) | JoVE Journal

Avaliando a Habilidade Fagocítica Específica da Idade dos Hemócitos de Melanogaster Drosophila Adulto usando um Ensaio de Faagocitose In Vivo

Explorar mais vídeos