Name: Determinação da eficiência do inibidor químico contra o crescimento intracelular toxoplasma Gondii usando um ensaio de crescimento baseado em luciferase (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Aprenda a avaliar a eficácia de inibidores químicos contra Toxoplasma gondii usando ensaio baseado em luciferase. Este método permite monitorar o crescimento parasitário e calcular o tempo de duplicação em alta escala.

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Os autores gostariam de agradecer aos Drs. Sibley e Carruthers por compartilharem os anticorpos pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT e anti-TgCPL e TgActin. Este trabalho foi apoiado pelo fundo Clemson Startup (para Z.D.), Knights Templar Eye Foundation Pediatric Oftalmology Career-Starter Research Grant (para Z.D.), uma bolsa piloto de uma bolsa NIH COBRE P20GM109094 (para Z.D.), e NIH R01AI143707 (para Z.D.). Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou elaboração do manuscrito.

O toxoplasma gondii é categorizado no Grupo de Risco 2 e deve ser manuseado em um Nível de Biossegurança 2 (BSL-2). O protocolo foi revisado e aprovado pelo Comitê Institucional de Biossegurança da Universidade Clemson.
1. Ensaio de crescimento de toxoplasma baseado em luciferase
<ol><li>Fibroblastos de prepúcio (HFFs) 1 semana antes da inoculação do parasita para garantir que as células hospedeiras sejam totalmente confluentes. Realize um ensaio simulado em uma placa transparente para garantir que os parasitas permaneçam intracelulares durante todo o período de avaliação. NOTA: Aqui, o ensaio é conduzido em 96 microplacas de poço. De acordo com as necessidades experimentais, pode ser dimensionado até 384 ou 1536 microplacas de poço.</li>
	<li>Passe os parasitas do Toxoplasma em HFFs confluentes 2 dias antes do uso, transferindo ~0,3-0,4 mL de parasitas totalmente lised em um frasco T25. Incubar células hospedeiras infectadas a 37 °C com 5% de CO2 durante 2 dias.</li>
	<li>Seringa 5 mL de parasitas recém-lised através de uma agulha de segurança de 21 G 5x para liberar parasitas intracelulares, em seguida, passar através de um filtro de 3 μm para remover detritos celulares hospedeiros. Enxágüe os parasitas residuais do frasco usando 7 mL de fenol livre de fogo D10, depois passe pelo filtro novamente.</li>
	<li>Parasitas de centrífuga a 1000 x g por 10 min à temperatura ambiente (RT). Despeje o sobrenadante e resuspenda a pelota em 10 mL de mídia D10 sem fenol.</li>
	<li>Conte parasitas usando um hemocímetro para determinar a concentração.</li>
	<li>Diluir parasitas para 1 x 104 parasitas/mL para a cepa do tipo selvagem (WT). Para cepas de parasitas deficientes de crescimento, aumente a concentração em conformidade para observar um aumento significativo nos sinais de luciferase.</li>
	<li>Aspire a mídia cuidadosamente de 96 microplacas de poço pré-semeadas com HFFs e inocular 150 μL de ressuspensão de parasitas em poços em um formato de três colunas e cinco linhas, o que representa três réplicas técnicas e cinco pontos de tempo.</li>
	<li>Incubar a microplaca a 37 °C e 5% CO2 por 4 h.</li>
	<li>Aspire a mídia cuidadosamente dos poços para remover parasitas não invadidos, em seguida, encha os poços com mídia rt fenol vermelho-livre em cada linha (exceto para a primeira linha).</li>
	<li>Misture volumes iguais de PBS e 2x tampão de ensaio de luciferase e diluir o substrato da luciferase para 12,5 μM.</li>
	<li>Adicione 100 μL de substrato de luciferase diluída em cada poço da linha superior. Incubar as microplacas em RT por 10 min para permitir que as células se esimmentem completamente.</li>
	<li>Meça a atividade da luciferase usando um leitor de microplacas. As configurações do leitor de placas estão listadas na Tabela 1. Cada leitura representa o número inicial de parasitas invadidos a 4h após a infecção.</li>
	<li>Repita as etapas 1.9-1.12 para cada linha a cada 24 h por 4 dias sem alterar o meio. Essas leituras refletem o número total de parasitas replicados às 24h, 48h, 72h e 96h pós-infecção.</li>
	<li>Calcule as leituras médias em cada ponto de tempo e divida-as pelas leituras médias em 4h para determinar as mudanças de dobra no crescimento do parasita ao longo do tempo.</li>
	<li>Plote os dados usando o software de gráficos. Uma tabela representativa de leitura de crescimento e parcelas de RHΔku80:: Os parasitasda NLuc são mostrados na Figura 1A,B.</li>
	<li>Para calcular o tempo de duplicação, plote os valores de log2 de alterações dobradas nos pontos de tempo individuais ao longo do tempo de incubação. Use uma função de regressão linear para calcular a inclinação, o que representa o tempo de duplicação de cada cepa(Figura 1A,C).</li>
</ol>2. Avaliação da eficácia da inibição de compostos químicos contra o crescimento do Toxoplasma
NOTA: Aqui, a avaliação da inibição do LHVS no crescimento do Toxoplasma é apresentada como exemplo. Oito concentrações diferentes de LHVS são testadas, e três réplicas técnicas são realizadas para cada uma das três réplicas biológicas para ambos RHΔku80::NLuc e RHΔku80Δcpl::NLuc estirpes.
<ol><li>Antes da infecção por parasitas, as sementes hfFs para 96 microplacas de poço no formato de três linhas e nove colunas para uma réplica biológica por composto por cepa. As células hospedeiras poderão crescer por pelo menos 7 dias antes do uso.</li>
	<li>Pass RHΔku80::NLuc e RHΔku80Δcpl::Parasitas NLuc por 2 dias antes do uso. Siga as etapas 1.2-1.6 para purificação e quantificação de parasitas. Ressuspensão de parasitas em mídia fenol red-free em 1 x 104 parasitas/mL.</li>
	<li>Mídia aspirada de uma placa contendo HFFs confluentes e inocular cada poço com 150 μL de ressuspensão de parasitas. Incubar a microplaca a 37 °C e 5% CO2 por 4 h.</li>
	<li>Prepare lHVS em oito concentrações diferentes em um reservatório de 12 poços por diluição serial. Geralmente, as concentrações são diminuídas em três vezes de forma serial de diluição. NOTA: A menor concentração é reduzida em 6.561 vezes em relação à maior concentração. A mudança dobrada da diluição pode ser ajustada de acordo com diferentes propriedades de compostos individuais.</li>
	<li>A 4h pós-infecção, aspiram a mídia para remover parasitas não invadidos e encher cada poço das colunas 2-9 com 150 μL de mídia complementada com LHVS em diferentes concentrações. Deixe a primeira coluna cheia de meio regular para servir como um controle não tratado.</li>
	<li>Incubar a microplaca a 37 °C e 5% CO2 por mais 96 h.</li>
	<li>Realizar as etapas 1.9-1.11 e medir a atividade da luciferase de poços individuais.</li>
	<li>Média das atividades de luciferase de três réplicas técnicas de poços de cada concentração de LHVS individual.</li>
	<li>Divida a atividade média da luciferase para cada concentração de LHVS pela atividade média de luciferase derivada de parasitas não tratados para calcular a atividade normalizada da luciferase em percentagem.</li>
	<li>Plote as atividades normalizadas de luciferase contra as concentrações individuais de LHVS usando software de gráfico(Figura 2). A inibição da pirimetatina contra o crescimento de parasitas também é medida como um controle. Pirimetana é um antibiótico clínico usado para tratar toxoplasmose aguda inibindo o metabolismo do ácido fólico no Toxoplasma.</li>
	<li>Calcular os valores de IC50 para compostos individuais usando o método incorporado no software de gráfico, resposta normalizada versus [inibidor], sob o programa de regressão "dose-resposta-inibição". O IC50 é calculado utilizando a seguinte fórmula: Y = 100/(1 + X/IC50) Onde: Y representa atividades normalizadas de luciferase de células infectadas sob diferentes concentrações de inibidor, e X representa concentrações individuais de inibidor.</li>
</ol>3. Exclusão genética baseada em CRISPR-Cas9 em parasitas toxoplasma
<ol><li>Geração de um guia de expressão de construção plasmídea RNA (sgRNA) e Cas9 para excluir um gene de interesse<ol>
<li>Vá para <a href="http://www.ToxoDB.org/" target="_blank">www.ToxoDB.org</a> e recupere toda a seqüência de codificação genética, incluindo introns e éons, juntamente com 1,5 kb 5'-UTRs e 3'-UTRs (regiões não traduzidas). NOTA: Aqui, o TgCPL (TGGT1_321530) é alvo como um exemplo representativo.</li>
		<li>Copie a seqüência TgCPL recuperada no software de análise de seqüência (consulte Tabela de Materiais para o nome e a versão) e rotule as regiões de 5'e 3'-UTR.</li>
		<li>Selecione o ícone Ferramentas na barra de menu superior e selecione Clonagem | Encontre sites CRISPR.</li>
		<li>Escolha 3'(Cas9)' para a localização do site pam e selecione a pasta contendo a seqüência de genoma toxoplasma na seção de pontuação de especificidade. Deixe o resto das configurações como padrão.</li>
		<li>Escolha um sgRNA com os seguintes dois critérios: 1) mostrando uma pontuação de alta especificidade, geralmente &gt;98%, e 2) sem um G seguindo o NGG, uma seqüência de protospacer adjacente (PAM). O sgRNA selecionado geralmente está localizado em locais próximos ao início e param códons do gene de interesse.</li>
		<li>Copie a seqüência do sgRNA selecionado e cole-a no modelo de cartilha a seguir. <img src="/files/ftp_upload/60985/60985eq1.jpg"> A parte em vermelho representa a seqüência de sgRNA TgCPL selecionada. Pode ser substituído por diferentes sgRNAs para vários genes de interesse. NOTA: Se o sgRNA selecionado não começar com G, adicione G no início do sgRNA para ajudar a melhorar sua expressão.</li>
		<li>Realizar uma reação pcr para modificar o sgRNA de expressão plasmid pré-existente (Figura 3A) que tem como alvo toxoplasma uracil phosphoribosyltransferase (TgUPRT) gene23 usando uma pré-mistura pcr com as configurações fornecidas na Tabela 2.</li>
		<li>Execute o produto PCR em um gel de agarose para confirmar a amplificação bem sucedida. Espera-se que um produto PCR de 10 kb seja amplificado(Figura 3B).</li>
		<li>Extrair o produto PCR usando um kit de extração de gel de DNA e circularizá-lo usando um kit de mutagênese direcionado ao local. Consulte a Tabela 3 para obter a receita. Incubar a reação por 10-20 min no RT.</li>
		<li>Transforme o produto PCR circularizado em E. coli e escolha 10 clones para posterior verificação da incorporação do sgRNA projetado.</li>
		<li>Cresça dois clones e extraia plasmídeos. Corte os plasmídeos purificados com BamHI e EcoRV. Os plasmídeos candidatos renderão duas bandas a 2,4 kb e 7,2 kb(Figura 3C).</li>
		<li>Envie os plasmídeos para sequenciamento de Sanger usando primers reversos M13 para confirmar a substituição bem sucedida do TgUPRT sgRNA com o sgRNA projetado(Figura 3D).</li>
	</ol></li>
	<li>Geração de modelo de reparo para exclusão de genes via mecanismo HDR<ol>
<li>De acordo com os locais de segmentação do sgRNA selecionado, localize 50 bp de 5'-UTRs ou 3'-UTRs do gene-alvo para recombinação dependente de homologia (HDR, ver seção de discussão). A seleção das regiões segue os critérios listados abaixo, dependendo da localização das metas do sgRNA.<ol>
<li>Se o local do decote por Cas9 estiver localizado a montante a partir do códon inicial, selecione o seguinte: uma seqüência de DNA de 50 bps a montante do local do decote como a região do HDR esquerdo, e uma seqüência de DNA de 50 bp a jusante do códon stop como a região direita do HDR.</li>
			<li>Se o local do decote por Cas9 estiver entre os códons de início e parada, selecione o seguinte: uma seqüência de DNA de 50 bps a montante do códon inicial como a região hdr esquerda, e uma seqüência de DNA de 50 bp a jusante do códon stop como a região direita do HDR.</li>
			<li>Se o local do decote por Cas9 estiver localizado a jusante do códon de parada, selecione o seguinte: uma seqüência de DNA de 50 bps a montante do códon inicial como a região do HDR esquerdo, e uma seqüência de DNA de 50 bp a jusante do local do decote como a região direita do HDR. NOTA: Para o gene TgCPL, o local do decote está localizado entre os códons start e stop. Assim, os primers a seguir são projetados para amplificar o modelo de reparo usando pMDC64 como modelo, que codifica um de resistência à pirimetatina. As seqüências em anneal preto para o plasmídeo pMDC64 para amplificação PCR. As regiões rotuladas em vermelho são seqüências específicas de TgCPLpara recombinação homóloga. <img src="/files/ftp_upload/60985/60985eq2.jpg">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Realizar PCR usando um pré-mix PCR sob as condições pcr descritas na Tabela 4.</li>
		<li>Execute o produto PCR em um gel de agarose(Figura 3E),seguido de procedimentos de extração de gel e quantificação padrão de ácido nucleico. NOTA: Se a banda esperada não puder ser amplificada com sucesso, otimize as condições do PCR e/ou os pares de primer do switch.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfecção de toxoplasma<ol>
<li>Pass RHΔku80::Parasitas NLuc por 2 dias em um frasco T25 contendo HFFs confluentes. Um frasco T25 de parasitas totalmente lised é suficiente para duas a três transfecções.</li>
		<li>Os parasitas de purificação de seringas e filtros, conforme descrito na etapa 1.2. Ressuspensa os parasitas no tampão citomix e gire para baixo a 1.000 x g por 10 min no RT.</li>
		<li>Lave parasitas pelleted com 10 mL de tampão citomix e gire os parasitas a 1.000 x g por 10 min em RT.</li>
		<li>Despeje cuidadosamente o sobrenadante e resuspenda os parasitas no mesmo tampão em uma concentração de 1 x 108 parasitas/mL.</li>
		<li>Misture 2 μg de DNA do modelo de reparo com 20 μg dos plasmídeos de expressão sgRNA/Cas9 (razão de massa = 1:5, equivalente a uma razão molar de 1:3). Se o rendimento de amplificação do modelo de reparo for baixo, reduza a entrada de ambas as peças de DNA em conformidade. Um mínimo de 0,5 μg de modelo de reparo pode ser usado.</li>
		<li>Misture 400 μL de ressuspensão de parasitas, DNA e 5 μL de 200 mM ATP/500 mM de glutationa reduzida (GSH) em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Leve o volume total para 500 μL com tampão citomix, se necessário.</li>
		<li>Transfira a mistura de parasitas e DNA para uma cuvette de eletroporação (largura de 4 mm) e realize a eletroporação (tensão de 2 kV, resistência a 50 Ω) usando um aparelho de eletroporação.</li>
		<li>Transfira parasitas eletroportados para um frasco T25 contendo HFFs confluentes em meio D10 fresco. Aplique antibiótico apropriado para seleção de medicamentos após 24 horas.</li>
		<li>Mantenha a pressão seletiva da droga até que o crescimento dos parasitas transgênicos seja estável.</li>
		<li>Purifique o DNA genômico da população de nocaute e verifique a integração do de resistência à pirimetana no lócus TgCPL por PCR. Após verificação, prossiga para a seção 3.4. Caso contrário, realize outra rodada de transfecção de parasitas e seleção de medicamentos. A incapacidade de detectar a integração correta do de resistência à droga geralmente sugere que o gene alvo é essencial ou que o lócus genético não é acessível.</li>
	</ol></li>
	<li>Clonagem de parasitas nocauteados<ol>
<li>Semente duas microplacas de 96 poços com células HFF e incubar a 37 °C e 5% CO2 por 1 semana antes da clonagem de parasitas.</li>
		<li>Passe ~0,3-0,4 mL da população de parasitas transgênicos em um frasco T25 contendo HFFs confluentes e os plante por 2 dias. Considere passar mais parasitas se o mutante mostrar defeitos de crescimento. NOTA: Para obter o melhor rendimento e viabilidade, as células hospedeiras são fortemente infectadas pelos parasitas, e a maioria dos parasitas são mantidos no estágio intracelular.</li>
		<li>As células hospedeiras infectadas pela seringa e os parasitas recém-purificados com filtro purificam os recém-formados, conforme mencionado na etapa 1.3. Ressuspensa os parasitas no meio D10 e gire-os a 1.000 x g por 10 min no RT.</li>
		<li>Resuspender os parasitas pelleted em 10 mL de meio D10.</li>
		<li>Contagem de parasitas usando um hemocímetro para determinar a concentração de parasitas.</li>
		<li>Realizar uma diluição em duas etapas para levar a concentração a 10 parasitas/mL em meio D10 suplementado com o antibiótico apropriado. Normalmente, a ressuspensão inicial do parasita é diluída em 1.000 vezes, seguida de uma segunda diluição para 10 parasitas/mL.</li>
		<li>Mídia aspirada de 96 microplacas de poços contendo HFFs confluentes e inocular 150 μL de parasitas diluídos em cada poço.</li>
		<li>Incubar placas a 37 °C com 5% de CO2 durante 7 dias sem perturbação para permitir a formação da placa. O período de incubação pode ser maior se os parasitas transgênicos apresentarem defeitos de crescimento.</li>
		<li>Tela as placas usando um microscópio de contraste de fase e marque apenas os poços contendo uma única placa.</li>
		<li>Executar pcr colônia para identificar clones corretos.<ol>
<li>Use as pontas da pipeta para raspar o fundo de cada poço para levantar monocamadas HFF infectadas.</li>
			<li>Pipet 75 μL da resuspensão celular de cada um marcado bem em tubos de microcentrífuge de 1,5 mL.</li>
			<li>Tubos de centrífuga por 10 min em velocidade máxima em RT. Apiratee cuidadosamente o sobrenadante e resuspenda a pelota em 10,25 μL de tampão de líxio contendo tampão de diluição e aditivo de liberação de DNA fornecido no kit(Tabela de Materiais).</li>
			<li>Incubar as amostras por 4 min em RT, depois 2 min a 98 °C. Posteriormente, as amostras podem ser usadas para PCR ou armazenadas a -20 °C até o uso. Três conjuntos de reações pcr são usados para testar a integração do de resistência à droga e a perda do gene de interesse(Figura 4A). Consulte a Tabela 5 para configuração de reação pcr e tabela 6 para as configurações do termocicador.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Identifique os clones corretos e transfira quatro clones para frascos T25 contendo HFFs confluentes.</li>
		<li>Após clones individuais de células hospedeiras, purifique o DNA genômico para verificação posterior do PCR.</li>
		<li>Se um anticorpo reconhecendo a proteína de interesse estiver disponível, siga um procedimento padrão de imunoblotting para verificar a perda da proteína alvo nos nocautes corretos do Toxoplasma. Imagens representativas para a triagem de um mutante de exclusão TgCPLsão mostradas na Figura 4B,C.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

++Este protocolo descreve um protocolo baseado em luciferase para avaliar o crescimento do Toxoplasma intracelular e avaliar a eficácia da inibição de compostos químicos contra o crescimento de parasitas. Comparado com as estratégias existentes disponíveis para medir o crescimento do Toxoplasma intracelular, este método apresenta alta sensibilidade e especificidade. Enquanto monitora o crescimento de parasitas, recomenda-se um ensaio simulado em uma microplaca clara de 96 poços para confirmar que a cepa...

Toxoplasma gondii é um parasita intracelular altamente bem sucedido que infecta aproximadamente um terço da população humana. Sua alta taxa de transmissão é predominantemente devido às suas diversas rotas de transmissão, incluindo consumo de carne mal cozida, exposição a reservatórios de mamíferos e transmissão congênita durante o nascimento. T. gondii causa principalmente infecções oportunistas que podem levar à morbidade e mortalidade graves em indivíduos imunocomprometidos1,2,3,4,5,6. Os antibióticos atualmente utilizados no tratamento da toxoplasmose aguda são particularmente ineficientes no tratamento de infecções congênitas e latentes e causam reações severas em alguns indivíduos3,7,8. Assim, existe uma necessidade urgente de identificar novas terapêuticas. Entender as diferenças nos processos subcelulares dentro do Toxoplasma e seu hospedeiro ajudará a identificar potenciais alvos de drogas. Portanto, técnicas eficientes e convenientes de manipulação do genoma são necessárias para estudar os papéis dos genes individuais dentro do Toxoplasma. Além disso, o Toxoplasma pertence ao filo Apicomplexa, que inclui vários outros patógenos humanos significativos, como Plasmodium spp. e Cryptosporidium spp. Assim, o Toxoplasma pode ser usado como um organismo modelo para ajudar a estudar a biologia básica em outros parasitas apicomplexos.
Para identificar novos antibióticos contra patógenos microbianos, a triagem de alto desempenho de uma biblioteca de compostos químicos é inicialmente realizada para determinar sua eficácia na repressão do crescimento microbiano. Até agora, vários ensaios de crescimento baseados em microplacas foram desenvolvidos para medir o crescimento intracelular de T. gondii (ou seja, quantificação radioativa baseadaem 3 H-uracil9, detecção quantitativa de parasitas baseados em ELISA usando anticorpos t. gondii-específicos10,11, medição baseada em proteína de repórter usando β-galactosidase ou YFP expressante toxoplasma cepas12,13, e um ensaio de imagem de alto conteúdo recentemente desenvolvido14).
Todas essas estratégias individuais têm vantagens únicas; no entanto, certas limitações também restringem suas aplicações. Por exemplo, uma vez que o Toxoplasma só pode se replicar dentro de células animais nucleadas, a autofluorescência e a ligação não específica de anticorpos anti-T.gondii às células hospedeiras causam interferência em medidas baseadas em fluorescência. Além disso, o uso de isótopos radioativos requer conformidade especial de segurança e potenciais problemas de segurança. Alguns desses ensaios são mais adequados para avaliar o crescimento em um único ponto de tempo, em vez de um monitoramento contínuo do crescimento.
Apresentado aqui é um protocolo baseado em luciferase para a quantificação do crescimento intracelular do Toxoplasma. Em um estudo anterior, o gene da luciferase de NanoLuc foi clonado sob o promotor da tubbulina Toxoplasma, e esta construção de expressão de luciferase foi transfeccionada em parasitas do tipo selvagem (RHΔku80Δhxg) para criar um RHΔku80Δhxg::NLuc strain (referido como RHΔku80::NLuc a seguir)15. Essa cepa serviu como a cepa parental para determinação do crescimento intracelular e exclusão genética neste estudo. Utilizando o RHΔku80:: A cepade NLuc, o crescimento de parasitas em fibroblastos de prepúcio humano (HFFs) foi monitorado durante um período de 96 h pós-infecção para calcular o tempo de duplicação do parasita.
Além disso, a eficácia da inibição do LHVS contra o crescimento de parasitas pode ser determinada plotando as taxas de crescimento do Toxoplasma contra concentrações de LHVS seriais para identificar o valor ic50. A literatura anterior relatou que o TgCPL é um dos principais alvos de LHVS em parasitas e que o tratamento com LHVS diminui o desenvolvimento de infecções agudas e crônicas de Toxoplasma 16,,17,18,19. Além disso, RHΔku80::NLuc foi usado como a cepa parental para modificação do genoma para gerar uma cepa tgCPL-deficiente(RHΔku80Δcpl::NLuc), e a inibição do LHVS foi medida contra este mutante. Ao observar uma mudança de valores de IC50 para LHVS nos parasitas deficientes tgCPLem comparação com a cepa WT, foi validado que o TgCPL é alvo do LHVS in vivo.
Neste protocolo, RHΔku80::NLuc é usado como a cepa parental, que não tem um caminho de junção final não homólogo eficiente (NHEJ), facilitando assim a recombinação dupla mente dependente da homologia (HDR)20,21. Além disso, as regiões homólogas de 50 bp são flanqueadas em ambas as extremidades de um de resistência a drogas por PCR. O produto PCR serve como um modelo de reparo para remover todo o lócus genético via HDR usando ferramentas de edição de genoma baseadas em CRISPR-Cas9. Tais regiões homólogos curtas podem ser facilmente incorporadas em primers, fornecendo uma estratégia conveniente para a produção do modelo de reparo. Este protocolo pode ser modificado para realizar a exclusão genética universal e a marcação endógena genética.
Por exemplo, em nossa publicação mais recente, três genes protease, TgCPL, TgCPB (Toxoplasma cathepsin B-like protease) e TgSUB1 (Toxoplasma subtilisin-like protease 1), foram geneticamente ablados em TgCRT (Toxoplasma cloroquina-resistência transporte)-deficientes parasitas usando este método15. Além disso, tgAMN (um aminopeptidase putativo N [TgAMN, TGGT1_221310]) foi marcado endógenamente15. O laboratório de Lourido também relatou o uso de regiões homólogos curtas na faixa de 40-43 bp para a introdução de mutação genética direcionada ao local e marcação de genes endógenos no genoma de Toxoplasma usando um método semelhante22. Essas modificações de genoma bem sucedidas sugerem que uma região homóloga de 40-50 bp é suficiente para uma recombinação eficiente de DNA na cepa tgKU80-deficiente, o que simplifica muito a manipulação do genoma em Toxoplasma gondii.

<table><tbody><tr><td>Kit de extração de gel de agarose</td><td>New England BioLabs</td><td>T1020L</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0316S</td><td></td></tr><tr><td>Biotek Synergy H1 Leitor de microplacas multimodo híbrido</td><td>BioTek Instuments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células E. coli quimicamente competentes</td><td>New England BioLabs</td><td>C29871</td><td></td></tr><tr><td>CloneAmp HiFi PCR premix</td><td>Takara Bio</td><td>639298</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazine h</td><td>Prolume</td><td>301-10 hCTZ</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>New England BioLabs</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td>Phire Tissue Direct PCR Master Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>F170L</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid miniprep kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4054</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Kit de mutagênese dirigida ao local</td><td>New England BioLabs</td><td>E0554S</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software geneioso para design de sgRNA (versão: R11)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software GraphPad Prism (versão 8th)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SnapGene para clonagem molecular (versão: 4.2.11)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determinação da eficiência do inibidor químico contra o crescimento intracelular toxoplasma gondii usando um ensaio de crescimento baseado em luciferase

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Toxoplasma gondii é um patógeno protozoário que afeta amplamente a população humana. Os antibióticos atuais utilizados no tratamento da toxoplasmose clínica são limitados. Além disso, apresentam efeitos colaterais adversos em certos grupos de pessoas. Portanto, a descoberta de novas terapêuticas para toxoplasmose clínica é imperativa. O primeiro passo do novo desenvolvimento de antibióticos é identificar compostos químicos que ausitem alta eficácia na inibição do crescimento de parasitas usando uma estratégia de triagem de alto desempenho. Como um patógeno intracelular obrigatório, o Toxoplasma só pode se replicar dentro das células hospedeiras, o que proíbe o uso de medidas de absorvância óptica como um indicador rápido de crescimento. Apresentado aqui é um protocolo detalhado para um ensaio de crescimento baseado em luciferase. Como exemplo, este método é usado para calcular o tempo de duplicação de parasitas toxoplasma do tipo selvagem e medir a eficácia do crescimento intracelular de morfolinurea-leucil-leucyl-vinil sulfone (LHVS, um composto de protease cisteína) em relação à inibição do crescimento intracelular parasitário. Também é descrito um protocolo de exclusão genética baseado em CRISPR-Cas9 no Toxoplasma usando regiões homólogas de 50 bp para recombinação dependente de homologia (HDR). Ao quantificar as eficácias de inibição do LHVS em tipos selvagens e tgCPL (Toxoplasma cathepsin L-like protease)-deficientes, é mostrado que o LHVS inibe o crescimento de parasitas do tipo selvagem de forma mais eficiente do que o crescimento de Δcpl, sugerindo que o TgCPL é um alvo ao que o LHVS se liga no Toxoplasma. A alta sensibilidade e o fácil funcionamento deste ensaio de crescimento à base de luciferase tornam-no adequado para monitorar a proliferação do Toxoplasma e avaliar a eficácia da droga de forma de alta produtividade.

A Figura 1 representa um exemplo de uma curva de crescimento para o RHΔku80::Tensão NLuc e o cálculo derivado para o seu tempo de duplicação. Geralmente, o ensaio é realizado em três réplicas técnicas para cada uma das três réplicas biológicas para explicar as variações das leituras da atividade da luciferase. Para calcular a mudança de dobra normalizada do crescimento do parasita, cada leitura a 24-96 h pós-infecção foi dividida pela leitur...

Apresentado aqui é um protocolo para avaliar a eficácia da inibição de compostos químicos contra o crescimento intracelular in vitro de Toxoplasma gondii usando um ensaio de crescimento à base de luciferase. A técnica é usada para confirmar a especificidade da inibição pela exclusão genética do gene alvo correspondente. A inibição do LHVS contra a protease TgCPL é avaliada como um exemplo.

Determinação da eficiência do inibidor químico contra o crescimento intracelular toxoplasma Gondii usando um ensaio de crescimento baseado em luciferase

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...

Estas estratégias sensíveis podem ser usadas para avaliar a eficácia da inibição dos inibidores químicos e em combinação com a exclusão genética CRISPR-Cas9 para investigar os alvos da droga. Em vez de usar um ensaio de ponto final, o crescimento de parasitas pode ser monitorado ao longo do tempo para permitir o cálculo do tempo de duplicação do parasita usando uma proteína repórter sensível. Este ensaio pode potencialmente ser ampliado em 384 ou 1.536 microplacões de poço para o teste de múltiplos compostos ou para a triagem de bibliotecas de forma de alto rendimento.Esta estratégia pode ser modificada para quantificar o crescimento de outros patógenos microbianos intracelulares e suas respostas à droga de interesse. Para realizar um ensaio de crescimento de Toxoplasma baseado em luciferase, comece aspirando cuidadosamente o meio de culturas de microplatos pré-semeados de 96 poços de fibroblastos de prepúcio humano e inoculado 150 microliters de suspensão parasita B nos poços em um formato de linha de três colunas cinco. Após uma incubação de quatro horas na incubadora de cultura celular, aspire cuidadosamente o meio de cada poço para remover os parasitas não invadidos e encher os poços em cada um, mas na primeira linha com temperatura ambiente fenól vermelho livre.Em seguida, adicione 100 microlitadores de uma solução de substrato de luciferase de 12,5 micromolares em PBS em cada poço da linha superior e incubar as microplatas por 10 minutos à temperatura ambiente para permitir a lise celular completa. Ao final da incubação, meça a atividade da luciferase em um leitor de microplacos. Cada leitura representa o número inicial de parasitas invadidos em quatro horas após a infecção.Repita a análise a cada 24 horas pelos próximos quatro dias sem alterar o meio. Para calcular a mudança normalizada do crescimento do parasita, cada leitura pode ser dividida pela leitura inicial em quatro horas após a infecção. O registro 2 da mudança normalizada do crescimento do parasita pode então ser plotado contra cada ponto de tempo e submetido a uma função de regressão linear para obter a inclinação que representa o tempo de duplicação.Para avaliar a eficácia da inibição de um composto de juros sobre o crescimento do Toxoplasma, cultura de fibroblastos de prepúcio humano em microplatos de 96 poços por pelo menos sete dias antes de inocular cada poço de células com 150 microliters de parasitas como demonstrado por quatro horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Durante a incubação, prepare o composto de juros em oito concentrações diferentes em um reservatório de 12 poços por diluição serial. Diluir os compostos em um reservatório de 12 poços em uma diluição de um a três, pipetando cada mistura várias vezes com uma pipeta de um mililitro.Às quatro horas após a infecção, substitua o meio em cada poço das colunas dois a nove com 150 microliters de médio suplementados a cada diluição do composto, deixando a primeira coluna preenchida com meio regular para servir como controle não tratado. Em seguida, devolva as culturas celulares à incubadora de cultura celular por 96 horas e meça a atividade da luciferase para cada poço para determinar a porcentagem de inibição de crescimento nas culturas em cada concentração de composto. Para calcular a atividade luciferase normalizada como porcentagem, divida a atividade luciferase média para cada concentração composta pela atividade luciferase média derivada dos parasitas não tratados.Em seguida, use um programa de software gráfico apropriado para traçar as atividades de luciferase normalizadas contra o composto individual e calcular a concentração inibitória meia maximal para cada composto. Para gerar uma construção plasmida expressando RNA e Cas9 de guia único para excluir um gene de interesse, navegue até a página do Recurso de Genômica toxoplasma e recupere toda a sequência de codificação genética, incluindo os introns e exons, juntamente com a base de 1,5 quilobase cinco e três regiões não traduzidas principais. Copie a sequência TgCPL recuperada no software de análise de sequência e rotule as cinco e três regiões não traduzidas principais.Na página Recursos de Genômica do Toxoplasma, clique em Download, Arquivos de Dados e Current_Release. Na pasta T.gondii GT1, selecione FASTA. Da pasta de dados, baixe o arquivo de sequência de genoma de tensão Toxoplasma gondii GT1.Em seguida, crie uma pasta local chamada Genoma toxoplasma no software de análise de sequência de DNA e importe o arquivo de sequência de genomas toxoplasma para a pasta. Selecione Ferramentas, Clonagem e Encontre sites CRISPR e defina três principais cas9 prime para a localização do site pam. Selecione um RNA de guia único que demonstre uma pontuação de alta especificidade, geralmente superior a 98% e falta um G seguindo o NGG.O RNA de guia único selecionado geralmente está localizado em locais próximos ao início e para os códons do gene de interesse. Em seguida, use uma pré-mistura pcr com as configurações indicadas na tabela para executar uma reação pcr para modificar o plasmídeo pré-existente expressando RNA de guia único que tem como alvo o gene TgUPRT. Para a transfecção do Toxoplasma, misture dois microgramas de DNA de modelo reparado com 20 microgramas de plasmídeos de expressão RNA Cas9 de guia único e misture 400 microliters de ressuspensão, DNA e cinco microliters de 200 mililitros ATP 500 milimolar reduzido glutatione em um tubo de centrífusão de 1,5 mililitro.Adicione o tampão de citomix para trazer o volume total até 500 microliters conforme necessário e transfira a mistura de DNA parasita para uma lacuna de quatro milímetros com cuvette de eletroporação. Em seguida, eletroporar os parasitas a dois quilovolts e 50 ohms de resistência. Para clonar parasitas eliminatórios, primeiro realizar uma diluição em duas etapas dos parasitas para alcançar 10 parasitas por mililitro de médio D10 suplementado com a concentração de antibióticos apropriada.Em seguida, transfira 150 microlitadores dos parasitas purificados resuspendados para cada poço de uma microplata de 96 poços pré-semeadas com fibroblastos de prepúcio e incubar a microplacão a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por sete dias. Ao final da incubação, identifique os poços contendo uma única placa e transfira 75 microlitadores dos fibroblastos humanos infectados pelo Toxoplasma de cada poço da cultura de microplatos de 96 poços em tubos individuais de 1,5 mililitro. Colete as células por centrifugação e resuspenque as pelotas em 10,25 microliters de tampão de lise contendo tampão de diluição no aditivo de liberação de DNA.Em seguida, incubar as amostras por quatro minutos em temperatura ambiente e dois minutos a 98 graus Celsius antes de realizar pcr para testar a integração do de resistência à droga e perda do gene de interesse. As eficácias de inibição de LHVS e tipo selvagem em cepas delta CPL podem ser determinadas plotando suas atividades de luciferase contra diferentes concentrações inibidoras. Após o PCR, o plasmídeo mutado é linearizado e carregado em um gel de 1%agarose para a verificação de uma amplificação bem sucedida.Após a extração de gel e a transformação de E.coli, os clones contendo os plasmídeos esperados podem ser rastreados por restrição de digestão endonuclease no sequenciamento de DNA. Após a amplificação do modelo de reparo, a eletroforese do gel agarose pode ser usada para verificar o tamanho correto do produto PCR. Geralmente, sete a oito clones são selecionados para a triagem inicial para verificar a exclusão da sequência de codificação do gene de interesse, seguido pela detecção dos cinco e três braços primos para ajudar a minimalizar o número total de clones a serem rastreados.Uma verificação adicional pode ser completada por imunoblotação se algum anticorpo que reconheça a proteína alvo estiver disponível. Antes de obter medidas de atividade de luciferase, uma microplaca clara com uma infecção simulada deve ser verificada sob um microscópio para garantir que os parasitas não lisem totalmente as células hospedeiras.

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Neste vídeo, demonstramos o ensaio de luciferase para quantificar o crescimento do patógeno intracelular Toxoplasma gondii. Utilizando uma cepa de Toxoplasma que expressa a enzima luciferase após infectar as células hospedeiras, a atividade da luciferase é detectada na cultura de células infectadas para determinar a reprodução bem-sucedida do parasita.

Ensaio de crescimento baseado em luciferase para quantificar a reprodução intracelular do parasita

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Ensaio de luciferase para estudar a eficácia de produtos químicos antiparasitários contra parasitas

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Aqui, descrevemos a citotoxicidade celular e ensaios de infecciosidade redondas únicas que permitem a triagem rápida e exacta de compostos para determinar a sua citotoxicidade celular (CC 50) e os valores de IC50 contra a WT e resistentes de HIV-1 da droga.

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Um ensaio de alto rendimento e em tempo real foi desenvolvido para identificar simultaneamente (1) antimicrobianos penetrantes em células eucarióticas direcionados a um patógeno bacteriano intracelular e (2) avaliar a citotoxicidade de células eucarióticas. Uma variação da mesma tecnologia foi posteriormente combinada com a tecnologia de dispensação digital para permitir estudos fáceis, de alta resolução, dose-resposta e sinergia bidimensional e tridimensional.

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Nós desenvolvemos um sistema de rastreio de alto rendimento modular para descobrir novos compostos contra o Mycobacterium tuberculosis, direccionamento intracelular e em caldo de crescimento de bactérias, bem como a citotoxicidade contra a célula hospedeira de mamífero.

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Aqui, apresentamos um protocolo para medir a interação eIF4E-eIF4G em células vivas que permitiria ao usuário avaliar a perturbação induzida por drogas da dinâmica complexa eIF4F em formatos de triagem.

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Descrevemos um ensaio colorimétrico de alta produtividade medindo β-galactosidase atividade em três estágios do ciclo de vida de Trypanosoma cruzi, o agente causador da doença de Chagas. Este ensaio pode ser usado para identificar compostos trypanocidas de forma fácil, rápida e reprodutível.

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Aprenda a avaliar a eficácia de inibidores químicos contra Toxoplasma gondii usando ensaio baseado em luciferase. Este método permite monitorar o crescimento parasitário e calcular o tempo de duplicação em alta escala.

Determinação da eficiência do inibidor químico contra o crescimento intracelular toxoplasma Gondii usando um ensaio de crescimento baseado em luciferase (Vídeo) | JoVE Journal

Determinação da eficiência do inibidor químico contra o crescimento intracelular toxoplasma Gondii usando um ensaio de crescimento baseado em luciferase

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