Name: Avaliação histomorfométrica padronizada da osteoartrite em um modelo de rato cirúrgico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprenda análise histomorfométrica padronizada de osteoartrite em modelo cirúrgico de rato. Este método permite quantificar alterações em cartilagem e osso subcondral para avaliar eficácia terapêutica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gostaríamos de reconhecer a assistência da equipe do Departamento de Medicina Comparada e do núcleo molecular e histopatológico do Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Fontes de financiamento: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Arthritis Research Grant (F.K.).

Os ratos C57BL/6 de 12 semanas foram comprados da Jax Labs. Todos os ratos foram alojados em grupos de 3-5 ratos por gaiola micro-isolador em uma sala com um cronograma de luz/escuro de 12 horas. Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com o Guia do Instituto Nacional de Saúde (NIH) para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso animal da Universidade Estadual da Pensilvânia.
1. Modelo cirúrgico de osteoartrite pós-traumática (PTOA)
<ol><li>Anestesia camundongos usando uma combinação de cetamina (100 mg/kg)/xilazina (10 mg/kg) através de injeção intraperitoneal, administram buprenorfina (1 mg/kg) através de injeção intraperitoneal para alívio da dor e raspam o cabelo sobre o joelho. Verifique a falta de um reflexo do pedal antes de iniciar a cirurgia.</li>
	<li>Realizar a desestabilização da cirurgia do menisco medial (DMM) como descrito anteriormente22,23. NOTA: Consulte as referências de Glasson et al. e Singh et al. para obter informações mais detalhadas sobre o protocolo cirúrgico22,23.<ol>
<li>Faça uma incisão longitudinal de 3 mm da patela distal ao platô tibial proximal da articulação do joelho direito. Use uma sutura para deslocar o tendão patelar.</li>
		<li>Abra a cápsula articular medial para o tendão e mova a almofada de gordura infrapatelar para visualizar a região intercondylar, o menisco medial e o ligamento meniscotibial23.</li>
		<li>Transcção do ligamento meniscotibial medial para completar o DMM e desestabilizar a articulação22,23. Feche o local da incisão com grampos ou suturas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar cirurgias falsas após um procedimento semelhante, mas sem transsecção do ligamento meniscotibial medial. NOTA: Os camundongos foram randomizados para receber uma cirurgia de DMM ou falsa. De acordo com a literatura publicada anteriormente, os camundongos desenvolvem Um PTOA significativo 12 semanas após a cirurgia DMM22,23,24.</li>
</ol>2. Eutanásia do rato e coleta de amostras
<ol><li>Eutanásia do rato<ol>
<li>Doze semanas após o DMM, anestesiar camundongos usando uma combinação de cetamina (100 mg/kg)/xilazina (10 mg/kg) através de injeção intraperitoneal.</li>
		<li>Faça uma incisão midline através da pele ao longo do tórax e retraia a caixa torácica para expor o coração para fixação por perfusão27. NOTA: Consulte a referência gage et al. para obter informações adicionais sobre o protocolo para fixação adequada de roedores, bem como a representação em vídeo da montagem e procedimentos adequados do equipamento27.</li>
		<li>Configure o aparelho de perfusão de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
		<li>Eutanie o rato por perfucidade de soro fisiológico heparinizado através do ventrículo esquerdo até que o sangue seja limpo e o fígado fique pálido. Perfuja o mouse com formalina tamponada neutra de 10% até que a fixação completa do mouse seja alcançada. NOTA: Um mouse perfundido com sucesso ficará rígido. O tempo médio de perfusão usando o sistema de bomba automatizado é de 5 a 7 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coleta e preparação de amostras<ol>
<li>Isole os joelhos cortando o osso no meio do fêmur e na tíbia média e disseque o tecido muscular circundante.</li>
		<li>Continue a fixação armazenando as articulações do joelho em formalina tampão 10% neutra à temperatura ambiente por 24 h, depois a 4 °C por 6 dias.</li>
		<li>Descalcifique o osso armazenando a amostra no tampão de decalcificação EDTA por 1 semana a temperatura ambiente com leve agitação28. Altere a solução de buffer de decalcificação a cada 3 dias. NOTA: O tampão de descalcificação foi preparado dissolvendo 140 g de tetrasódio edta ultrapuro em uma solução de 850 mL de água destilada mais 15 mL de ácido acético glacial. O tampão foi equilibrado para 7,6 por adição de ácido acético glacial à solução. Ao atingir o pH = 7,6, o tampão foi trazido para 1 L de volume total com água destilada. O tampão de descalcificação foi preparado fresco e usado dentro de uma semana de preparação.</li>
		<li>Lave os joelhos com 50% de etanol, depois 70% de etanol por 15 min cada, depois processe para incorporação. NOTA: O processamento da transferência de fluidos foi realizado pelo Núcleo molecular e histopatológico do Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Consulte o núcleo de histologia da instituição para obter recomendações sobre o processamento ideal da amostra.</li>
		<li>Incorporar os joelhos do rato na parafina com o aspecto medial da articulação voltado para a superfície inferior do bloco de parafina. Aplique uma leve pressão no lado tibial da articulação durante a incorporação para garantir que as superfícies tibiais e femorais estejam o mais próximo possível do mesmo plano.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Secção de microtome e seleção de slides
<ol><li>Secção de microtomes<ol>
<li>Use os botões de ajuste do plano no suporte do bloco do microtome para garantir a adequada face do bloco de amostra.</li>
		<li>Enfrente o bloco de parafina para que o aspecto distal do fêmur, região proximal da tíbia, e chifres anteriores e posteriores do menisco medial apareçam no mesmo plano para coleta de seção(Figura Suplementar 1A). Comece a coletar seções em slides quando os chifres anteriores e posteriores do menisco medial começam a se separar um do outro.</li>
		<li>Certifique-se de que a tíbia, fêmur e menisci apareçam no mesmo plano comparando tamanhos de estrutura. A tíbia e o fêmur devem ser de tamanho comparável, com ambos os chifres meniscos semelhantes em tamanho e forma(Figura Suplementar 1A). Se uma estrutura parece muito grande em comparação com sua contraparte, isso indica que são necessários enfrentamentos adicionais. Importante, confirme que o espaço articular permanece intacto.</li>
		<li>Pegue as seções sagitais dos joelhos do mouse embutidos para fina através do compartimento articular medial em seções de 5 μm e colete as seções em slides. Coletar aproximadamente 30 seções por bloco de parafina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seleção de slides<ol>
<li>Selecione três seções representativas com 50 μm de distância para cada amostra a partir da quinta seção (ou seja, slides 5, 15 e 25). Slides selecionados serão usados para coloração subseqüente, pontuação OARSI e análise histomorfométrica. NOTA: A partir de um bloco com 30 seções totais, selecione slides desde o início (slides 5-10), médio (slides 15-20) e final (slides 25-30) do conjunto para representar claramente toda a amostra. Selecione slides de níveis semelhantes de profundidade entre as amostras.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Hematoxilina, Laranja Safranin e Coloração verde rápida
<ol><li>Deparafinaos os slides selecionados com três alterações de xileno. Hidrate os slides com duas variações de 100% de etanol, duas variações de 95% de etanol e uma variação de 70% de etanol.</li>
	<li>Manche as lâminas com hematoxilina por 7 min e depois lave com água corrente por 10 min. Manche com verde rápido por 3 min e enxágue em ácido acético glacial de 1,0% para 10 s. Manche com Safranin-O por 5 min e enxágue rapidamente mergulhando em 0,5% de ácido acético glacial.</li>
	<li>Enxágüe slides em duas mudanças de água destilada e deixe o ar secar.</li>
	<li>Desça slides em três mudanças de xileno por 5 min cada, em seguida, monte com mídia de montagem baseada em xileno e um deslizamento de cobertura. NOTA: A hematoxilina serve como mancha nuclear para identificar áreas de medula óssea. Safranin-O é usado para colorir cartilagem, proteoglicanos, mucina e grânulos de células de mastro. Fast Green é usado como contra-mancha para osso.</li>
</ol>5. Slide imaging
<ol><li>Imagem os slides manchados Safranin-O e Fast Green usando uma câmera disponível conectada a um microscópio e software de imagem baseado em computador.</li>
	<li>Abra o software de imagem (ver Tabela de Materiais) e organize a região de interesse da articulação do joelho (ROI) no centro da janela de imagem. Se utilizar um estágio de slide de microscópio rotacional, alinhe o slide de modo que a superfície da tíbia atravesse a largura do eixo horizontal da região de imagem.</li>
	<li>Defina o balanço de branco da câmera antes de começar a visualizar um conjunto de amostras(Figura Suplementar 2). Imagem do compartimento articular em ampliação de 4x e 10x, garantindo que tanto a superfície articular tibial quanto femoral e o osso subcondrato tibial estejam incluídos em cada um dos ROIs de imagem(Figura Suplementar 1A, B). Salvar imagens para cada um dos três níveis selecionados a serem usados para pontuação OARSI. NOTA: A definição do balanço de branco da câmera dependerá do software e dos sistemas de câmera que estão sendo usados. Geralmente, navegue até a guia da câmera ou menu principal de imagem e role para baixo para definir balanço de branco. Selecione Definir balanço de branco e um pequeno cursor ou ícone deve aparecer(Figura Suplementar 2A). Usando o cursor, selecione uma área dentro da imagem/amostra livre de manchas, como o espaço articular, para definir o balanço de branco.</li>
</ol>6. Sociedade Internacional de Pesquisa de Osteoartrite (OARSI) marcando15 pontos
<ol><li>Alesuamente os três slides selecionados safranin-o e fast green manchados de todas as amostras.</li>
	<li>Executar pontuação OARSI de forma cegacom três observadores. Resumidamente, exiba uma imagem de cada vez em uma ordem aleatória e permita que três observadores marquem cada imagem, correlacionando-se com um dos três níveis selecionados para cada amostra. NOTA: Consulte a tabela de pontuação OARSI para obter descrições detalhadas da escala de classificação15.</li>
	<li>Calcule a pontuação média de cada seção usando pontuações individuais de cada observador. Determine a pontuação média por amostra, tomando a pontuação média das três seções representativas.</li>
</ol>7. Análise histomorfométrica
NOTA: Imagens ao vivo da articulação do joelho são visualizadas em um monitor touchscreen usando uma câmera de microscópio, e uma caneta é usada para rastrear manualmente os ROIs. Algoritmos incorporados do software de histomormormetria quantificam os parâmetros especificados (ver Protocolo abaixo) nos ROIs definidos. É importante ressaltar que as mesmas seções manchadas safranin-O e fast green utilizadas na pontuação OARSI são usadas para análise histomorfométrica.
<ol><li>Preparação e medição de software<ol>
<li>Ligue o microscópio, a câmera, o computador e o monitor touchscreen. Clique no Ícone do Software para iniciar o programa de software. Coloque o slide no estágio do microscópio para visualização.</li>
		<li>Centralizar a amostra dentro da janela de medição. Certifique-se de que a grade de medição está configurada para a ampliação adequada para corresponder ao objetivo utilizado no microscópio(Figura Suplementar 3).</li>
		<li>Vá para a guia Arquivo na parte superior da tela e role para baixo para As Configurações de Leitura. Abra a janela Configurações e selecione o arquivo de configurações apropriada para os parâmetros a serem medidos.</li>
		<li>Selecione o parâmetro a ser medido a partir da lista no lado direito da tela(Figura Suplementar 3). Use o cursor de estilete ou mouse para rastrear imagens de acordo com as etapas descritas abaixo, a fim de medir os ROIs específicos do tecido. Quando concluído com cada medição, clique com o botão direito do mouse para finalizar a medição e continuar até o próximo parâmetro. NOTA: A lista de parâmetros a serem medidos é criada por meio de um arquivo de preferência distinto que é configurado em consulta com a empresa de software com o objetivo de medir os ROIs descritos. Consulte a discussão para obter mais detalhes sobre a configuração completa.</li>
		<li>Complete todas as medições e navegue até a guia Dados resumidos na parte inferior da tela do software(Figura Suplementar 3). Clique na janela da tela, clique na tecla Inserir no teclado ou copiar e cole os dados em uma planilha separada. NOTA: Realize a análise histomorfométrica de forma aleatória e cega. Após completar todas as medições de parâmetros para todas as amostras, organize os dados e média das medições das três lâminas de cada amostra.</li>
	</ol></li>
	<li>Medições das áreas de cartilagem total, calcificada e não calcificada NOTA: Use um software comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais)para executar essas etapas. Consulte a Figura Suplementar 1B,C para esclarecimento sobre as regiões da cartilagem, junções e regiões ósseas subcondradas discutidas ao longo desta seção.<ol>
<li>Desenhe uma linha através da borda superior da superfície da cartilagem tibial onde a cartilagem encontra o espaço articular. Desenhe uma segunda linha na junção condro-osséous onde a cartilagem calcificada encontra o osso subcondral (Figura 1B). Use a função Área do software para obter automaticamente a medição total da área da cartilagem.</li>
		<li>Desenhe uma linha ao longo da maré, uma linha de ocorrência natural que separa as regiões calcificadas e não calcificadas da cartilagem. Desenhe uma segunda linha na junção condro-osséous onde a cartilagem calcificada encontra o osso subcondral (Figura 1B). Use a função Área do software para obter automaticamente a medição da área de cartilagem calcificada.</li>
		<li>Calcular a área de cartilagem não calcificada subtraindo a área de cartilagem calcificada da área total da cartilagem (Figura 1B).</li>
	</ol></li>
	<li>Determinação do número de condrócito e fenótipo<ol>
<li>Crie funções de contagem separadas dentro das configurações do software de histomormormetria para distinguir a matriz produtora e a matriz de condrócitos não-produtores(Figura 1B).</li>
		<li>Determine o número de matrizes que produzem ou não produzem condrócitos usando o estilete para fazer um pequeno pontilhado sobre cada condrócito expressando o fenótipo especificado(Figura 1B). NOTA: Conte células de acordo com seu fenótipo como produção de matriz (ou seja, forte coloração de Safranin-O) ou não-produção de matriz (ou seja, muito fraca ou sem coloração de Safranin-O).</li>
	</ol></li>
	<li>Medição do perímetro de superfície articular tibial<ol>
<li>Meça o perímetro absoluto da superfície articular tibial traçando uma linha através da superfície da cartilagem tibial, definindo cuidadosamente fibrilações individuais(Figura 1C).</li>
		<li>Desenhe uma segunda linha ao longo da marca de maré para servir como um controle interno para o plano de cada seção (Figura 1C).</li>
		<li>Calcule o índice de fibrilação da superfície articular tibial dividindo o perímetro da superfície articular tibial pelo perímetro da maré. NOTA: Os perímetros de maré são geralmente iguais entre as amostras, de modo que a diferença nos perímetros articulares entre a farsa e o DMM foi geralmente pequena se o perímetro absoluto ou o índice de fibrilação foram usados.</li>
	</ol></li>
	<li>Medição das áreas de espaço subcondral de osso e medula<ol>
<li>Meça a área espacial da medula subcondral usando a função Área delineando regiões na região subcondral manchadas apenas com hematoxilina (ou seja, negativo para Verde Rápido) para determinar a área total da medula dentro do osso subcondrado. Desenhe linhas ao redor do perímetro dessas áreas para determinar a área total de todo o espaço da medula dentro do osso subcondrato tibial (Figura 2B).</li>
		<li>Meça a área subcondral total utilizando a função de área delineando a região entre a junção condro-osséous e a borda superior da placa de crescimento, estendendo-se lateralmente às regiões dos osteófitos anteriores e posteriores(Figura 2B).</li>
		<li>Calcular a área óssea subcondral subtraindo a área de espaço da medula óssea subcondral da área subcondral total (Figura 2B,C).</li>
	</ol></li>
	<li>Medição das áreas osteófitos anterior e posterior<ol>
<li>Para medir a área dos osteófitos, trace os osteófitos anteriores e posteriores da tíbia proximal utilizando a função Área (Figura 2B,E,F). NOTA: Osteófitos são projeções ósseas que se formam entre a cartilagem articular e a placa de crescimento, anterior ou posterior à região subcondral. As áreas de osteófitos nos lados anterior e posterior da tíbia são determinadas traçando a área anterior ou posterior ao osso subcondral. A junção entre os osteófitos e osso subcondral é claramente delineada por uma linha de células que se estende da cartilagem articular até a placa de crescimento. A junção entre o osteófito e o sinóvio é definida por uma transição entre tecido ósseo e fibroso.</li>
	</ol></li>
	<li>Medição da espessura sinovial<ol>
<li>Meça a espessura do femoral anterior usando a função Área desenhando uma linha do ponto de inserção interna do sinóvio anterior no fêmur em direção ao seu ponto de fixação no menisco(Figura 3B).</li>
		<li>Desenhe uma segunda linha da inserção externa do sinóvio no fêmur em direção ao seu apego ao menisco (Figura 3B).</li>
		<li>Calcule a espessura sinovial dividindo a área sinovial total pelo perímetro sinovial.</li>
	</ol></li>
</ol>8. Análise estatística
<ol><li>Coletar os parâmetros medidos e média dos resultados das três seções representativas para cada amostra. Analise os dados usando um teste t de student não emparelhado para comparar dois grupos ou ANOVA unidirecional para comparar três ou mais grupos.</li>
	<li>Exibir os dados como erro médio ± padrão de média. NOTA: A significância estatística foi alcançada em p ≤ 0,05.</li>
</ol>

<ol><li>Ma, V. Y., Chan, L., Carruthers, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence%2C+prevalence%2C+costs%2C+and+impact+on+disability+of+common+conditions+requiring+rehabilitation+in+the+United+States%3A+stroke%2C+spinal+cord+injury%2C+traumatic+brain+injury%2C+multiple+sclerosis%2C+osteoarthritis%2C+rheumatoid+arthritis%2C+limb+loss%2C+and+back+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Physical+Medicine+and+Rehabililation%22%5BJournal%5D)">Incidence, prevalence, costs, and impact on disability of common conditions requiring rehabilitation in the United States: stroke, spinal cord injury, traumatic brain injury, multiple sclerosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, limb loss, and back pain.</a> Archives of Physical Medicine and Rehabililation. 95 (5), 986-995 (2014).</li>
<li>Hopman, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+between+chronic+disease%2C+age+and+physical+and+mental+health+status%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chronic+Diseases+in+Canada%22%5BJournal%5D)">Associations between chronic disease, age and physical and mental health status.</a> Journal of Chronic Diseases in Canada. 29 (3), 108-116 (2009).</li>
<li>Lorenz, J., Grässel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLorenz%2C+J+%22Mouse+Genetics.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology</a>. Singh, S., Coppola, V. 1194, Humana Press. New York, NY. 401-419 (2004).</li>
<li>Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+science+of+articular+cartilage%3A+structure%2C+composition%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Sports+Health%22%5BJournal%5D)">The basic science of articular cartilage: structure, composition, and function.</a> Journal of Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).</li>
<li>Van der Kraan, P., Van den Berg, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocyte+hypertrophy+and+osteoarthritis%3A+role+in+initiation+and+progression+of+cartilage+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis: role in initiation and progression of cartilage degeneration.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 20 (3), 223-232 (2012).</li>
<li>Hodsman, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parathyroid+hormone+and+teriparatide+for+the+treatment+of+osteoporosis%3A+a+review+of+the+evidence+and+suggested+guidelines+for+its+use%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Parathyroid hormone and teriparatide for the treatment of osteoporosis: a review of the evidence and suggested guidelines for its use.</a> Endocrine Reviews. 26 (5), 688-703 (2005).</li>
<li>Pitsillides, A. A., Beier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+biology+in+osteoarthritis-lessons+from+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Cartilage biology in osteoarthritis-lessons from developmental biology.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (11), 654(2011).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone-cartilage+interface+crosstalk+in+osteoarthritis%3A+potential+pathways+and+future+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Bone-cartilage interface crosstalk in osteoarthritis: potential pathways and future therapeutic strategies.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 22 (8), 1077-1089 (2014).</li>
<li>Goldring, S. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+osteochondral+unit+during+osteoarthritis%3A+structure%2C+function+and+cartilage-bone+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Changes in the osteochondral unit during osteoarthritis: structure, function and cartilage-bone crosstalk.</a> Nature Reviews Rheumatology. 12 (11), 632(2016).</li>
<li>Martel-Pelletier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis.</a> Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 16072(2016).</li>
<li>Goldring, M. B., Otero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Inflammation in osteoarthritis.</a> Current Opinion in Rheumatology. 23 (5), 471(2011).</li>
<li>Sellam, J., Berenbaum, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+synovitis+in+pathophysiology+and+clinical+symptoms+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">The role of synovitis in pathophysiology and clinical symptoms of osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 6 (11), 625(2010).</li>
<li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis+severity+is+sex+dependent+in+a+surgical+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).</li>
<li>Katon, W., Lin, E. H., Kroenke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+of+depression+and+anxiety+with+medical+symptom+burden+in+patients+with+chronic+medical+illness%5BTitle%5D)+AND+%22General+Hospital+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The association of depression and anxiety with medical symptom burden in patients with chronic medical illness.</a> General Hospital Psychiatry. 29 (2), 147-155 (2007).</li>
<li>Glasson, S., Chambers, M., Van Den Berg, W., Little, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OARSI+histopathology+initiative-recommendations+for+histological+assessments+of+osteoarthritis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">The OARSI histopathology initiative-recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 18, 17-23 (2010).</li>
<li>Pastoureau, P., Leduc, S., Chomel, A., De Ceuninck, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+articular+cartilage+and+subchondral+bone+histology+in+the+meniscectomized+guinea+pig+model+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of articular cartilage and subchondral bone histology in the meniscectomized guinea pig model of osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 11 (6), 412-423 (2003).</li>
<li>O'Driscoll, S. W., Marx, R. G., Fitzsimmons, J. S., Beaton, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+automated+cartilage+histomorphometry%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Method for automated cartilage histomorphometry.</a> Tissue Engineering. 5 (1), 13-23 (1999).</li>
<li>Matsui, H., Shimizu, M., Tsuji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+and+subchondral+bone+interaction+in+osteoarthrosis+of+human+knee+joint%3A+a+histological+and+histomorphometric+study%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+Technique%22%5BJournal%5D)">Cartilage and subchondral bone interaction in osteoarthrosis of human knee joint: a histological and histomorphometric study.</a> Microscopy Research Technique. 37 (4), 333-342 (1997).</li>
<li>Hacker, S. A., Healey, R. M., Yoshioka, M., Coutts, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+methodology+for+the+quantitative+assessment+of+articular+cartilage+histomorphometry%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">A methodology for the quantitative assessment of articular cartilage histomorphometry.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 5 (5), 343-355 (1997).</li>
<li>Pastoureau, P., Chomel, A. Methods for Cartilage and Subchondral Bone Histomorphometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPastoureau%2C+P+%22Cartilage+and+Osteoarthritis.+Methods+in+Molecular+Medicine%22">Cartilage and Osteoarthritis. Methods in Molecular Medicine</a>. DeCeuninck, F., Sabatini, M., Pastoureau, P. 101, Humana Press. New York, NY. 79-91 (2004).</li>
<li>McNulty, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+histological+assessment+of+osteoarthritis+lesions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cartilage%22%5BJournal%5D)">A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in mice.</a> Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).</li>
<li>Glasson, S., Blanchet, T., Morris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+%28DMM%29+model+of+osteoarthritis+in+the+129%2FSvEv+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li>
<li>Singh, S. R., Coppola, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSingh%2C+SR+%22Mouse+Genetics%3A+Methods+and+Protocols%22">Mouse Genetics: Methods and Protocols</a>. , Humana Press. New York, NY. (2004).</li>
<li>Fang, H., Beier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+osteoarthritis%3A+modelling+risk+factors+and+assessing+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of osteoarthritis: modelling risk factors and assessing outcomes.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 413(2014).</li>
<li>Culley, K. L., et al. Mouse Models of Osteoarthritis: Surgical Model of Posttraumatic Osteoarthritis Induced by Destabilization of the Medial Meniscus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCulley%2C+KL+%22Osteoporosis+and+Osteoarthritis.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Osteoporosis and Osteoarthritis. Methods in Molecular Biology</a>. Westendorf, J., van Wijnen, A. 1226, Humana Press. New York, NY. 143-173 (2015).</li>
<li>Van der Kraan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+that+influence+outcome+in+experimental+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Factors that influence outcome in experimental osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25 (3), 369-375 (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Callis, G., Sterchi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decalcification+of+bone%3A+literature+review+and+practical+study+of+various+decalcifying+agents.+Methods%2C+and+their+effects+on+bone+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Decalcification of bone: literature review and practical study of various decalcifying agents. Methods, and their effects on bone histology.</a> Journal of Histotechnology. 21 (1), 49-58 (1998).</li>
<li>Lajeunesse, D., Massicotte, F., Pelletier, J. P., Martel-Pelletier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subchondral+bone+sclerosis+in+osteoarthritis%3A+not+just+an+innocent+bystander%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Subchondral bone sclerosis in osteoarthritis: not just an innocent bystander.</a> Modern Rheumatology. 13 (1), 0007-0014 (2003).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subchondral+bone+in+osteoarthritis%3A+insight+into+risk+factors+and+microstructural+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+Therapy%22%5BJournal%5D)">Subchondral bone in osteoarthritis: insight into risk factors and microstructural changes.</a> Arthritis Research Therapy. 15 (6), 223(2013).</li>
<li>Kapoor, M., Martel-Pelletier, J., Lajeunesse, D., Pelletier, J. P., Fahmi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+proinflammatory+cytokines+in+the+pathophysiology+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 33(2011).</li>
<li>Scanzello, C. R., Goldring, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+synovitis+in+osteoarthritis+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis.</a> Bone. 51 (2), 249-257 (2012).</li>
<li>Benito, M. J., Veale, D. J., FitzGerald, O., van den Berg, W. B., Bresnihan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+tissue+inflammation+in+early+and+late+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 64 (9), 1263-1267 (2005).</li>
<li>De Lange-Brokaar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+inflammation%2C+immune+cells+and+their+cytokines+in+osteoarthritis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Synovial inflammation, immune cells and their cytokines in osteoarthritis: a review.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 20 (12), 1454-1499 (2012).</li>
<li>Findlay, D. M., Kuliwaba, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone-cartilage+crosstalk%3A+a+conversation+for+understanding+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Research%22%5BJournal%5D)">Bone-cartilage crosstalk: a conversation for understanding osteoarthritis.</a> Bone Research. 4, 16028(2016).</li>
<li>Lories, R. J., Luyten, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone-cartilage+unit+in+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">The bone-cartilage unit in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43(2011).</li>
<li>Pritzker, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis+cartilage+histopathology%3A+grading+and+staging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging.</a> Journal of Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).</li>
<li>Hayami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+articular+cartilage+and+subchondral+bone+changes+in+the+rat+anterior+cruciate+ligament+transection+and+meniscectomized+models+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Characterization of articular cartilage and subchondral bone changes in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis.</a> Bone. 38 (2), 234-243 (2006).</li>
<li>Priemel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mineralization+defects+and+vitamin+D+deficiency%3A+Histomorphometric+analysis+of+iliac+crest+bone+biopsies+and+circulating+25-hydroxyvitamin+D+in+675+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">mineralization defects and vitamin D deficiency: Histomorphometric analysis of iliac crest bone biopsies and circulating 25-hydroxyvitamin D in 675 patients.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 25 (2), 305-312 (2010).</li>
<li>Yukata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+infusion+of+PTH+1%E2%80%9334+delayed+fracture+healing+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Continuous infusion of PTH 1–34 delayed fracture healing in mice.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13175(2018).</li>
<li>Kawano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIM+kinase+1+deficient+mice+have+reduced+bone+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">LIM kinase 1 deficient mice have reduced bone mass.</a> Bone. 52 (1), 70-82 (2013).</li>
<li>Zhang, L., Chang, M., Beck, C. A., Schwarz, E. M., Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+new+bone%2C+cartilage%2C+and+fibrosis+tissue+in+healing+murine+allografts+using+whole+slide+imaging+and+a+new+automated+histomorphometric+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of new bone, cartilage, and fibrosis tissue in healing murine allografts using whole slide imaging and a new automated histomorphometric algorithm.</a> Bone Research. 4, 15037(2016).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+an+osteoarthritis-like+phenotype+and+degradation+of+phosphorylated+Smad3+by+Smurf2+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Induction of an osteoarthritis-like phenotype and degradation of phosphorylated Smad3 by Smurf2 in transgenic mice.</a> Arthritis Rheumatism. 58 (10), 3132-3144 (2008).</li>
<li>Hordon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trabecular+architecture+in+women+and+men+of+similar+bone+mass+with+and+without+vertebral+fracture%3A+I.+Two-dimensional+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Trabecular architecture in women and men of similar bone mass with and without vertebral fracture: I. Two-dimensional histology.</a> Bone. 27 (2), 271-276 (2000).</li>
</ol>

Pesquisas recentes de osteoartrite melhoraram nossa compreensão do crosstalk entre os diferentes tecidos dentro da articulação e o papel que cada tecido desempenha na iniciação ou progressão da doença8,9,10,35,36. Assim, tornou-se óbvio que a avaliação da OA não deve se limitar à análise da cartilagem, mas também deve incluir a análise do osso subcondral e do ...

Uma das doenças articulares mais prevalentes nos Estados Unidos, a OA é caracterizada pela degeneração progressiva da cartilagem articular, principalmente nas articulações do quadril e do joelho, o que resulta em impactos significativos na mobilidade do paciente e na qualidade de vida1,2,3. Cartilagem articular é o tecido conjuntivo especializado das articulações diartrodiais projetadas para minimizar o atrito, facilitar o movimento e suportar a compressão articular4. A cartilagem articular é composta por dois componentes primários: condrócitos e matriz extracelular. Os condrócitos são células especializadas e metabolicamente ativas que desempenham um papel primordial no desenvolvimento, manutenção e reparo da matriz extracelular4. A hipertrofia condrócito (CH) é um dos principais sinais patológicos do desenvolvimento da OA. Caracteriza-se pelo aumento do tamanho celular, diminuição da produção de proteoglicano e aumento da produção de enzimas degradantes da matriz de cartilagem que eventualmente levam à degeneração da cartilagem5,6,7. Além disso, alterações patológicas no osso subcondral e no sinóvio da articulação desempenham um papel importante no desenvolvimento e progressão da OA8,,9,10,11,12. Até o momento, não existem terapias curativas existentes que inibam a degeneração da cartilagem1,2,3,13,14. Assim, há extensas pesquisas em andamento que visam compreender a patologia da OA e descobrir novas abordagens terapêuticas que são capazes de retardar ou até mesmo parar o OA. Assim, há uma necessidade crescente de uma abordagem quantitativa e reprodutível que permita uma avaliação precisa das alterações patológicas associadas à OA na cartilagem, sinóvio e osso subcondral da articulação.
Atualmente, a gravidade e a progressão do OA são avaliadas principalmente usando os sistemas de pontuação OARSI ou Mankin15. No entanto, esses sistemas de pontuação são apenas semiquantitativos e podem ser influenciados pela subjetividade do usuário. Mais importante, eles não conseguem avaliar com precisão mudanças sutis que ocorrem na articulação durante a doença ou em resposta à manipulação genética ou a uma intervenção terapêutica. Há relatos esporádicos na literatura descrevendo análises histomorfométricas da cartilagem, sinóvio ou osso subcondral16,,17,,18,,19,,20,21. No entanto, ainda falta um protocolo detalhado para análise histomorfométrica rigorosa e reprodutível de todos esses componentes articulares, criando uma necessidade não atendida no campo.
Para estudar alterações patológicas na OA usando análise histomorfométrica, utilizou-se um modelo cirúrgico de rato oa para induzir OA através da desestabilização do menisco medial (DMM). Entre os modelos estabelecidos de Murine OA, a DMM foi selecionada para o nosso estudo por envolver um mecanismo menos traumático de lesão22,,23,24,25,26. Em comparação com as cirurgias de lesão meniscal-ligamento (MLI) ou lesão do ligamento cruzado anterior (ACLI), a DMM promove uma progressão mais gradual da OA, semelhante ao desenvolvimento de OA em humanos22,24,25,26. Os camundongos foram eutanizados doze semanas após a cirurgia de DMM para avaliar alterações na cartilagem articular, osso subcondral e sinóvio.
O objetivo deste protocolo é estabelecer uma abordagem padronizada, rigorosa e quantitativa para avaliar as mudanças conjuntas que acompanham a OA.

<table><tbody><tr><td>10% tamponado formalina fosfato</td><td>fisher químico</td><td>SF100-20</td><td>Para fixação de amostra após a colheita</td></tr><tr><td>Ácido acético, glacial (certificado A.C.S.)</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38S-212</td><td>Para descalcificação Preparação de tampão e preparação de solução de ácido acético para coloração</td></tr><tr><td>Cintiq 27QHD Creative Pen Display</td><td>Wacom</td><td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td><td>Para análise histomorfométrica e imagem</td></tr><tr><td>Cintiq Ergo stand</td><td>Wacom</td><td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td><td>Para análise histomorfométrica e imagem</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético, sal tetrassódico di-hidratado, 99%</td><td>Acros Organics</td><td>AC446080010</td><td>Para preparação de tampão de descalcificação</td></tr><tr><td>Coloração verde rápida</td><td>SIGMA Life Sciences</td><td>F7258</td><td>Para coloração de amostras</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio Fisherbrand Superfrost Plus Fisher</td><td></td><td>12-550-15</td><td>Para coleta</td></tr> <tr><td>de seção de amostraHistoPrep Xylene</td><td>Fisherbrand</td><td>HC-700-1GAL</td><td>Para desfilerafinização e coloração de amostras</td></tr><tr><td>de Tecido Histosette II - Tampa e Base Combinadas</td><td>Fisher</td><td>15-182-701A</td><td>Para processamento e incorporação de amostras</td></tr><tr><td>Estação de Trabalho HP Z440</td><td>HP</td><td>Número do produto: Y5C77US#ABA</td><td>Para análise histomorfométrica e imagem</td></tr><tr><td>Manual Micrótomo Rotativo</td><td>Leica</td><td>RM 2235</td><td>Para Seccionamento de amostras</td></tr><tr><td>Canetas de marcação</td><td>Leica</td><td>3801880</td><td>Para rotulagem de amostras, e lâminas</td></tr><tr><td>OLYMPUS BX53 Microscópio</td><td>OLYMPUS</td><td>https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/</td> <td>Para análise histomorfométrica e imagem</td></tr><tr><td>OLYMPUS DP 73 Microscópio Câmera</td><td>OLYMPUS</td><td>https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/</td><td>Para análise histomorfométrica e imagem (descontinuado)</td></tr><tr><td>ORION STAR A211 medidor de pH</td><td>Thermo Scientific</td><td>STARA2110</td><td>Para descalcificação Preparação do tampão</td></tr><tr><td>Software</td><td>OsteoMeasure</td><td>OsteoMetrics https://www.osteometrics.com/index.htm</td><td>Para medição e análise histomorfométrica</td></tr><tr><td>Perfusão Dois Sistema automatizado de perfusão</td><td>por pressão Leica</td><td>Modelo # 39471005</td><td>Para mouse colheita de joelho</td></tr><tr><td>PRISM 7 Software</td><td>GraphPad</td><td>Acesso Institucional Conta</td><td>Análise Estatística</td></tr><tr><td>Coloração Safranin-O</td><td>SIGMA Life Sciences</td><td>S8884</td><td>Para coloração de amostras</td></tr><tr><td>ThinkBoneStage - Estágio de microscópio rotativo</td><td>Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (fornecedor)</td><td>http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php</td><td>Para análise histomorfométrica e imagem</td></tr><tr><td>Wacom Pro Pen Stylus</td><td>Wacom</td><td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td><td>Para análise histomorfométrica e imagem</td></tr><tr><td>Weigerts Hematoxilina de ferro A</td><td>Fisher</td><td>5029713</td><td>Para coloração de hematoxilina</td></tr><tr><td>Weigerts Hematoxilina de ferro B</td><td>Fisher</td><td>5029714</td><td>Para coloração de hematoxilina</td></tr></tbody></table>

avaliação histomorfométrica padronizada da osteoartrite em um modelo de rato cirúrgico

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

Uma das doenças articulares mais prevalentes nos Estados Unidos, a osteoartrite (OA) é caracterizada pela degeneração progressiva da cartilagem articular, principalmente nas articulações do quadril e do joelho, o que resulta em impactos significativos na mobilidade e qualidade de vida do paciente. Até o momento, não existem terapias curativas existentes para OA capazes de retardar ou inibir a degeneração da cartilagem. Atualmente, há um extenso corpo de pesquisas em andamento para entender a patologia da OA e descobrir novas abordagens terapêuticas ou agentes que podem reduzir eficientemente, parar ou até mesmo reverter o OA. Assim, é fundamental ter uma abordagem quantitativa e reprodutível para avaliar com precisão as alterações patológicas associadas à OA na cartilagem articular, no sinóvio e no osso subcondral. Atualmente, a gravidade e a progressão da OA são avaliadas principalmente usando os sistemas de pontuação Da Osteoarthritis Research Society International (OARSI) ou Mankin. Apesar da importância desses sistemas de pontuação, eles são semiquantitativos e podem ser influenciados pela subjetividade do usuário. Mais importante, não conseguem avaliar com precisão mudanças sutis, mas importantes, na cartilagem durante os estados precoces da doença ou fases de tratamento precoce. O protocolo que descrevemos aqui usa um sistema de software histomorfométrico computadorizado e semi-automatizado para estabelecer uma metodologia quantitativa padronizada, rigorosa e reprodutível para a avaliação de mudanças conjuntas na OA. Este protocolo apresenta uma poderosa adição aos sistemas existentes e permite uma detecção mais eficiente de alterações patológicas na articulação.

OA induzido por DMM resulta em degeneração da cartilagem articular e perda de condrócito A OA induzida pelo DMM resultou em um aumento da pontuação de OARSI em comparação com camundongos falsos, caracterizado distintamente pela erosão da superfície e perda de cartilagem(Figura 1A,D). O protocolo de histomormormetria detalhado aqui detectou várias alterações associadas à OA, incluindo uma diminuição na área total da cartilagem e na área de cartilagem não c...

O protocolo atual estabelece um método rigoroso e reprodutível para quantificação de alterações articulares morfológicas que acompanham a osteoartrite. A aplicação deste protocolo pode ser valiosa no monitoramento da progressão da doença e na avaliação de intervenções terapêuticas na osteoartrite.

Avaliação histomorfométrica padronizada da osteoartrite em um modelo de rato cirúrgico

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

Nosso protocolo aborda uma necessidade não atendida de um método robusto e reprodutível para análise quantitativa de mudanças articulares no desenvolvimento e progressão da osteoartrite. Nossa técnica traça parâmetros específicos e reprodutíveis para a análise quantitativa de alterações em múltiplos tecidos articulares na osteoartrite. Como essa técnica permite a análise quantitativa da osteoartrite, pode ser empregada para comparar os efeitos de tratamentos específicos em múltiplos tecidos articulares, a fim de avaliar sua eficácia terapêutica.Nosso protocolo também pode ser aplicado a outros modelos de osteoartrite ou áreas de pesquisa musculoesquelético em que a quantificação da cartilagem e osso é necessária. Embora o sistema seja simples e intuitivo, as sessões de treinamento ainda são necessárias para praticar a obtenção de medições de forma repetida para alcançar a reprodutibilidade. Vengadeshprabhu Karuppagounder, um estudioso de pós-doutorado do nosso laboratório, agora estará demonstrando nosso procedimento.Comece ligando o microscópio, câmera, computador e monitor de tela sensível ao toque. Selecione o objetivo 4X e clique no ícone de software para iniciar o programa de software. Coloque o slide no estágio do microscópio e centralizar a amostra dentro da janela de medição garantindo que a grade de medição seja definida para a ampliação adequada para corresponder ao objetivo, na medida em que tanto a superfície articular tibial quanto o osso subcondral tibial estão incluídos nas regiões de interesse da imagem.Em seguida, no menu Arquivo, selecione "Ler configurações". Na janela Configurações, selecione o arquivo de configurações apropriado para que os parâmetros sejam medidos. Para medir a área total da cartilagem, selecione a função Tib TC e rastreie ao longo da borda superior da superfície da cartilagem tibial onde a cartilagem encontra o espaço articular e ao longo da junção condro-osseosa onde a cartilagem calcificada encontra o osso subcondral.Para medir a área de cartilagem calcificada selecione a função Tib CC e trace uma linha ao longo da marca da maré, uma linha natural que separa as regiões calcificadas e não calcificadas da cartilagem, e ao longo da junção condro-ósseo onde a cartilagem calcificada encontra o osso subcondral. Para determinar a área de cartilagem não calcificada, subtraia a área de cartilagem calcificada da área total da cartilagem. Para determinar o número de condrocitos, crie funções de contagem separadas dentro das configurações do software histomorfometria para distinguir os condrocitos de produção de matriz e matriz que não produzem.Em seguida, use a caneta para fazer um pequeno ponto sobre cada condrocito expressando o fenótipo especificado para determinar o número de matrizs produzindo ou não produzindo condrocitos. Para medir o parâmetro total da superfície articular tibial, rastreie uma linha através da superfície da cartilagem tibial para definir cuidadosamente as fibrilações individuais. Em seguida, desenhe uma segunda linha ao longo da marca da maré para servir como um controle interno para o plano de cada seção e divida o parâmetro de superfície articular tibial pelo parâmetro da marca da maré para calcular o índice de fibrilação da superfície articular tibial.Para medir a área de espaço de medula subcondral, selecione a função Área da Medula. Em seguida, desenhe linhas ao redor do parâmetro dessas áreas para determinar a área total do espaço da medula óssea dentro do osso subcondral tibial. Para medir a área subcondral total, selecione a função óssea subcondral e delineie a região entre a junção condro-osseosa na borda superior da placa de crescimento que se estende lateralmente às regiões dos osteófitos anteriores e posteriores.Em seguida, subtraia a área de espaço de medula óssea subcondral da área subcondral total para calcular a área óssea subcondral. Para medir a área de osteofita, selecione a função de osteofitto anterior e rastreie o osteofitfise anterior da tíbia proximal. Em seguida, selecione o osteofite posterior e rastreie o osteofite posterior da tíbia proximal.Para medir a espessura sinovial femoral anterior, clique no Anterior Femur Synovium Meniscus e desenhe uma linha do ponto de inserção interna do sinolio anterior no fêmur em direção ao seu ponto de fixação no menisco e uma linha da inserção externa do sintédio no fêmur em direção ao seu apego ao menisco. Em seguida, divida a área sinovial total pelo parâmetro sinovial para calcular a espessura sinovial. A osteoartrite induzida por DMM resulta em um aumento da pontuação da Osteoartrite Research Society International em comparação com camundongos falsos.Distintamente caracterizado pela erosão superficial e cartilagem perdida. Este protocolo de histomorfometria pode ser usado para detectar várias alterações associadas à osteoartrite, incluindo uma diminuição na cartilagem total e áreas de cartilagem não calcificadas. Redução do número total de condrocitos e, importante, perda no número de condrócitos produtores matricial.Alterações na superfície articular, indicativas da gravidade da erosão, também são observadas, incluindo um aumento global do índice de fibrilação. A osteoartrite também inclui um aumento na área óssea subcondral e uma redução na área do espaço de medula óssea em camundongos DMM indicando esclerose óssea subcondral. As áreas de osteofito anterior e posterior também aumentaram em camundongos DMM, sugerindo uma remodelagem óssea subcondral contínua que atua como um mecanismo compensatório para lidar com mudanças no carregamento articular no local da lesão.A análise histomorfométrica do sinodolio mostra um aumento na espessura sinovial em camundongos DMM. Um resultado típico da osteoartrite associado à inflamação sinovial e à difusão de citocinas inflamatórias no espaço articular. Além disso, não é observada variabilidade significativa entre os histomorphométricos da área de cartilagem não calcificada no escore da Osteoartrite Research Society International.Após análise histomorfométrica, slides sequenciais e coloração de imunofluorescência podem ser usados para examinar alterações na expressão proteica entre as amostras.

standardized-histomorphometric-evaluation-osteoarthritis-surgical

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Nós descrevemos um protocolo para a desestabilização do menisco medial modelo (DMM) em camundongos, uma ferramenta eficaz para a osteoartrite (OA) de pesquisa. Além disso, temos demonstrado que a deficiência de exagerar desenvolvimento OA progranulincan e progressão usando esse modelo, indicando que progranulin desempenha um papel protetor na patogênese da OA.

Estabelecimento de um modelo induzida cirurgicamente em ratos para investigar o papel protetor do Progranulin em Osteoartrite

A osteoartrite (OA), ou doença degenerativa das articulações, é uma condição debilitante associada a dor que permanece apenas parcialmente controlada por analgésicos disponíveis. Os modelos animais estão sendo desenvolvidos para melhorar a nossa compreensão dos mecanismos da dor relacionada com a OA. Aqui nós descrevemos a metodologia para o modelo monoiodoacetate de dor OA no mouse.

O Modelo Monoiodoacetate da osteoartrite Dor no mouse

Apresentamos um método para avaliar a extensão espacial da lesão/morte celular na superfície articular das articulações murino intactas após a aplicação de cargas mecânicas controladas ou impactos. Esse método pode ser usado para investigar como osteoartrite, fatores genéticos e/ou regimes de carregamento diferentes afetam a vulnerabilidade dos condrócitos em situ .

Visualização em tempo real e análise do condrócito prejuízo devido ao carregamento mecânico em explantes de cartilagem murino totalmente intacta

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado e reprodutível de citometria de fluxo para identificar subconjuntos de monócito/macrófago e células T usando ensaios de coloração extra e intracelular dentro do baço de murina, medula óssea, linfonodos e tecido sinovial, utilizando um modelo cirúrgico estabelecido de osteoartrite de murina.

Análise de Citometria de Fluxo de Subconjuntos de Células Imunes dentro do Baço de Murina, Medula Óssea, Linfonodos e Tecido Sinovial em um Modelo de Osteoartrite

Este artigo de metodologia apresenta um protocolo de medição quantitativa assistido por software para quantificar a espessura óssea subcondral histológica nas articulações do joelho osteoartrrítico murina e articulações normais do joelho como controles. Este protocolo é altamente sensível ao espessamento sutil e é adequado para detectar alterações ósseas subcondriais osteoartríticas precoces.

Medição quantitativa assistida por software da espessura óssea subcondral osteoartrítica

O presente protocolo descreve os arranhões controlados da microlâmina na superfície da cartilagem articular após a desestabilização do joelho do camundongo pelo corte do ligamento miniscotibial medial. Este modelo animal apresenta uma forma acelerada de osteoartrite (OA) adequada para estudar a formação de osteófitos, osteosclerose e dor em estágio inicial.

Desestabilização do Menisco Medial e Cartilagem Scratch Murine Modelo de Osteoartrite Acelerada

O protocolo descreve como medir a hiperalgesia do joelho em camundongos. Mostramos exemplos em modelos de camundongos de dor aguda no joelho, bem como em modelos de osteoartrite (OA).

Avaliação da hiperalgesia do joelho em camundongos usando medição de aplicação de pressão

Aqui, descrevemos um método cirúrgico para seccionar o ligamento cruzado anterior (LCA) como um modelo confiável para induzir osteoartrite de joelho em roedores e metodologias para coleta de líquido sinovial do joelho, medição de edema de joelho e avaliação da gravidade da osteoartrite.

Transecção do ligamento cruzado anterior e lavagem do líquido sinovial em modelo de roedor para estudo da inflamação articular e osteoartrite pós-traumática

Nós desenvolvemos uma nova abordagem cirúrgica para administração intratraqueal de agentes bioactivos para o feto de rato. A via de entrega é mais eficiente na segmentação dos pulmões do rato fetal do que o normalmente usado injecção intra-amniótica. Este procedimento tem a data ainda não foi descrita em um modelo de rato.

Uma nova abordagem cirúrgica para administração intratraqueal de agentes bioativos em um modelo de camundongo Fetal

O modelo de corte transversal do nervo tibial é um modelo bem-tolerado, validado, e reprodutível de atrofia do músculo esquelético. O protocolo cirúrgico modelo é descrito e demonstrado em ratinhos C57Black6.

Secção do nervo tibial - um modelo padronizado para denervação induzida por atrofia muscular em ratos

Aprenda análise histomorfométrica padronizada de osteoartrite em modelo cirúrgico de rato. Este método permite quantificar alterações em cartilagem e osso subcondral para avaliar eficácia terapêutica.

Avaliação histomorfométrica padronizada da osteoartrite em um modelo de rato cirúrgico

Explorar mais vídeos