Name: Transporte Axonal de Organelas em Culturas de Neurônios Motores usando sistema de câmaras microfluidas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprenda a rastrear o transporte axonal em neurônios motores usando câmaras microfluidas de PDMS. Este método permite visualizar organelas em tempo real e investigar mecanismos relacionados a doenças neurodegenerativas como ELA.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Israel science (ISF, 561/11) e do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC, 309377).

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<li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+coculture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li>
<li>Maimon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mir126-5p+downregulation+facilitates+axon+degeneration+and+nmj+disruption+via+a+non-cell-autonomous+mechanism+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS.</a> Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).</li>
</ol>

Os autores não declaram conflito de interesses.

Neste protocolo, descrevemos um sistema para rastrear o transporte axonal de mitocôndrias e compartimentos ácidos nos neurônios motores. Esta plataforma in vitro simplificada permite o controle, o monitoramento e a manipulação precisas de compartimentos neuronais subcelulares, permitindo a análise experimental das funções locais dos neurônios motores. Este protocolo pode ser útil para o estudo de doenças de MN, como a ELA, para focar na compreensão do mecanismo subjacente da disfunção do transporte axonal na doença<sup c...

As Esms são células altamente polarizadas com axônios longos, alcançando até um metro de comprimento em humanos adultos. Esse fenômeno cria um desafio crítico para a manutenção da conectividade e função MN. Consequentemente, as MNs dependem do transporte adequado de informações, organelas e materiais ao longo dos axônios do corpo celular para a sinapse e para trás. Vários componentes celulares, como proteínas, RNA e organelas são transportados regularmente através dos axônses. Mitocôndrias são organelas importantes que são rotineiramente transportadas em MNs. Mitocôndrias são essenciais para a atividade e função adequada das Ems, responsáveis pelo fornecimento de ATP, tampão de cálcio e processos de sinalização1,2. O transporte axonal das mitocôndrias é um processo bem estudado3,4. Curiosamente, foram relatados defeitos no transporte mitocondrial envolvidos em diversas doenças neurodegenerativas e especificamente em doenças de MN5. Compartimentos ácidos servem como outro exemplo para organelas intrínsecas que se movem ao longo de axônios MN. Compartimentos ácidos incluem lisôsôssomos, endóssomos, aparelhos trans-Golgi e certas vesículas secretas6. Defeitos no transporte axonal de compartimentos ácidos foram encontrados em diversas doenças neurodegenerativastambém 7, e artigos recentes destacam sua importância nas doenças de MN8.
Para estudar com eficiência o transporte axonal, são utilizadas câmaras microfluidas que separam compartimentos somáticos e axonais9,,10. As duas vantagens significativas do sistema microfluido, e a compartimentação e o isolamento dos axônios, tornam-no ideal para o estudo dos processos subcelulares11. A separação espacial entre os corpos das células neuronais e os axôonos pode ser usada para manipular os ambientes extracelulares de diferentes compartimentos neuronais (por exemplo, axôns vs. soma). Ensaios bioquímicos, de crescimento/degeneração neuronais e imunofluorescência todos se beneficiam desta plataforma. Os MFCs também podem auxiliar no estudo da comunicação celular-célula, codificando neurônios com outros tipos de células, como músculos esqueléticos12,,13,14.
Aqui, descrevemos um protocolo simples, mas preciso, para monitorar mitocôndrias e o transporte de compartimentos ácidos em neurônios motores. Mostramos ainda o uso deste método comparando a porcentagem relativa de organelas móveis retrógradas e anterogradas, bem como a distribuição da velocidade de transporte.

<table><tbody><tr><td>35mm Fluodish - prato de fundo de vidro</td><td>World Precision Instruments WPI</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>50mm Fluodish - prato de fundo de vidro World</td><td>Precision Instruments WPI</td><td>FD5040-100</td><td></td></tr><tr><td>Andor iXon DU-897 EMCCD câmera</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ARA-C (Citosina &beta; -D-arabinofuranosídeo)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td>estoque de 2mM em filtrado DDW</td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Alomone Labs</td><td>B-250</td><td>Diluir para 10 &micro; g/mL em ddw filtrado com 0,01% BSA)</td></tr> <tr><td>Punção de biópsia 1,25 mm</td><td>World Precision Instruments WPI</td><td>504530</td><td>Para preparação de grande</td></tr><tr><td>MFC Punção de biópsia 6mm</td><td>World Precision Instruments WPI</td><td>504533</td><td>Para preparação de pequeno MFC</td></tr><tr><td>Punção de biópsia 7mm</td><td>World Precision Instruments WPI</td><td>504534</td><td>Para preparação de grande MFC</td></tr><tr><td>Bitplane Software Imaris - versão 8.4.1</td><td>Albumina</td> de Soro Bovino Imaris <td></td><td></td></tr><tr><td>(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A3311-100G</td><td>5% p/v em ddw</td></tr><tr><td>Clorotrimetilsilano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#386529-100ML</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Alomone Labs</td><td>C-240</td><td>Diluir para 10 &micro; g / mL em ddw filtrado com 0,01% BSA)</td></tr> <tr><td>Gradiente de Densidade Médio - Optiprep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonuclease I (DNAse) do pâncreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td>estoque 10mg / mL em neurobasal</td></tr><tr><td>Dow Corning Graxa de silicone de alto vácuo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554-1EA</td><td>Para preparação de molde epóxi</td></tr><tr><td>DPBS 10X</td><td>Thermo Fisher</td> <td># 14200-067</td><td>Diluir 1:10 em DDW</td></tr><tr><td>Pinça fina Dumont #55 0,05 &vezes; 0,02 mm</td><td>F.S.T</td><td></td><td></td></tr> 1125520 <tr><td>Endurecedor Epóxi</td><td>Trias Chem S.R.L</td><td>IPE 743</td><td>Para preparação de moldes epóxi</td></tr><tr><td>Resina Epóxi</td><td>Trias Chem S.R.L</td><td>RP 026UV</td><td>Para preparação de moldes epóxi</td></tr><tr><td>Software FIJI</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Alomone Labs</td><td>G-240</td><td>Diluir para 10 &micro; g/mL em ddw filtrado com 0,01% BSA)</td></tr><tr><td>Glutamax 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>#35050-038</td><td></td></tr><tr><td>HB9:GFP cepa de camundongos</td><td>Jackson Laboratories</td><td>005029</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10X</td><td>Thermo Fisher</td><td>#14185-045</td><td>Diluir 1:10 em ddw com adição de 1% P/S e</td></tr><tr><td>filtro iQ software</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iris tesoura, curva, 10 cm</td><td>AS Medizintechnik</td><td>11-441-10</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de íris, reta, 9 cm</td><td>AS Medizintechnik</td><td>11-440-09</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#L-2020</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15</td><td>Medium Thermo Fisher</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>Thermo Fisher</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Deep-Red FM</td><td>Thermo Fisher</td><td>M22426</td><td></td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Thermo Fisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti microscópio</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (P/S) Solução</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Ornitina (PLO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P8638</td><td>Diluir 1:1000 in flitered 1X PBS</td></tr><tr><td>Sylgard 184 kit de elastômero de silicone</td><td>DOW Corning Corporation</td><td>#3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina do pâncreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td>estoque 25 mg/mL em tesoura de</td></tr><tr><td>microdissecção de mola 1XPBS Vannas, lâmina de 3 mm</td><td>FST</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Yokogawa CSU X-1</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transporte axonal de organelas em culturas de neurônios motores usando sistema de câmaras microfluidas

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Neurônios motores (MNs) são células altamente polarizadas com axônios muito longos. O transporte axonal é um mecanismo crucial para a saúde da MN, contribuindo para o crescimento neuronal, desenvolvimento e sobrevivência. Descrevemos um método detalhado para o uso de câmaras microfluidas (MFCs) para o rastreamento do transporte axonal de organelas fluorescentemente rotuladas em axônios MN. Este método é rápido, relativamente barato, e permite o monitoramento de pistas intracelulares no espaço e no tempo. Descrevemos um protocolo passo a passo para: 1) Fabricação de MFCs polidimetilsiloxano (PDMS); 2) Revestimento de explantas medulares ventral e cultura dissociada de MN em MFCs; 3) Rotulagem de mitocôndrias e compartimentos ácidos seguidos de imaginação confocal viva; 4) Análise manual e semiautomatizada do transporte axonal. Por último, demonstramos uma diferença no transporte de mitocôndrias e compartimentos ácidos da medula espinhal bcólmila HB9::GFP da medula espinhal explante axôns como prova da validade do sistema. Ao todo, este protocolo fornece uma ferramenta eficiente para estudar o transporte axonal de vários componentes axonais, bem como um manual simplificado para o uso de MFC para ajudar a descobrir possibilidades experimentais espaciais.

Seguindo o protocolo descrito, as explantas da medula espinhal do rato foram cultivadas em MFC (Figura 4A). Explantas foram cultivadas por 7 dias, quando os axônses se cruzaram totalmente para o compartimento distal. Os corantes vermelhos profundos mitotracker e lisotracker foram adicionados aos compartimentos distal e proximal, a fim de rotular as mitocôndrias e compartimentos ácidos(Figura 4C)....

O transporte axonal é um mecanismo crucial para a saúde dos neurônios motores. Neste protocolo fornecemos um método detalhado para rastrear o transporte axonal de compartimentos ácidos e mitocôndrias em axônios de neurônios motores usando câmaras microfluidas.

Transporte Axonal de Organelas em Culturas de Neurônios Motores usando sistema de câmaras microfluidas

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

O transporte axonal é vital para a saúde neuronal e a viabilidade. Nosso protocolo descreve um método elegante para monitorar e analisar o transporte axonal. E pode ser adaptado para vários modelos de doenças neuronais.O uso de câmaras microfluidas permite um controle temporal espacial preciso, que é crucial para estudar biologia axonal. Anormalidades no transporte axonal estão implicadas com várias doenças neurodegenerativas, como a ELA. A plataforma microfluidica permite o estudo de mecanismos básicos, bem como testar terapias para reparar defeitos de transporte axonal.A plataforma de câmara microfluida pode ser facilmente adaptada para atender a diferentes aspectos da pesquisa axonal, incluindo crescimento axonal e degeneração de vários subtipos neurais. Este método é complexo e geralmente ensinado de forma prática. A demonstração visual aumentará a acessibilidade deste procedimento a qualquer cientista interessado em estudar o transporte axonal.Comece lançando PDMS em moldes primários. Use ar pressurizado para remover qualquer sujeira da plataforma de wafer, certificando-se de que os wafers pareçam suaves e claros antes de prosseguir. Em seguida, encha um recipiente com nitrogênio líquido e prepare uma seringa de 10 mililitros com uma agulha calibre 23.Em um capô de fumaça química, coloque o wafer contendo placa em um recipiente vedado, e encha a seringa com dois mililitros de nitrogênio líquido por cada wafer contendo placa. Abra uma garrafa de clorofoitilsilano. Fure a tampa de borracha com a seringa e injete o nitrogênio na garrafa.Sem puxar a agulha, vire a garrafa de cabeça para baixo e desenhe dois mililitros de clorofomilano para cada wafer contendo placa. Espalhe o clorofosilano no recipiente, mas não diretamente no wafer contendo a placa. Feche o recipiente.E incubar por cinco minutos por wafer. Em seguida, pese 47,05 gramas de base PDMS em um tubo de 50 mililitros, e adicione agente de cura PDMS a uma proporção de 16 a 1 base ao agente de cura para um total de 50 gramas. Misture o PDMS por 10 minutos em um rotador de baixa velocidade e despeje-o em cada wafer contendo placa à altura desejada.Coloque as placas dentro de um desiccator a vácuo por duas horas. Que removerá o ar preso dentro do PDMS, e formará um molde uniforme claro. Depois incubar as placas em um forno por três horas ou durante a noite a 70 Celsius.Para criar a câmara microfluidica ou MFC. Corte e remova os moldes PDMS da placa com um bisturi, certificando-se de não forçar os moldes porque eles são frágeis. Siga as instruções do manuscrito do texto para perfurar e cortar as câmaras, dependendo da configuração experimental.Para a cultura da explant medular, soque dois poços de sete milímetros no lado distal de um MFC grande, certificando-se de que eles se sobrepõem com as bordas do canal. No lado proximal, soque um poço de sete milímetros bem no meio do canal com sobreposição mínima, de modo que espaço suficiente seja deixado para as explantas. Faça dois furos adicionais de um milímetro nas duas bordas do canal proximal.E cortar o PDMS em câmaras simples. Em seguida, gire o MFC voltado para cima, e use uma agulha de calibre 20 para esculpir em três pequenas cavernas de explant no poço perfurado de sete milímetros. Para a cultura do neurônio motor dissociado, soque quatro poços de seis milímetros, nas bordas dos dois canais de um pequeno MFC e corte o PDMS em câmaras únicas.Para esterilizar o MFC, espalhe faixas de fita adesivas de 50 centímetros de comprimento no banco. Em seguida, pressione ambos os rostos da câmara na fita e puxe-a de volta. Coloque as câmaras limpas em uma nova placa e incuba-as em grau analítico, de 70% de etanol por 10 minutos em um agitador orbital.Descarte o etanol e seque as câmaras em uma capa de cultura de tecido ou em um forno a 70 graus Celsius. Em seguida, coloque a câmara no centro de uma vala de fundo de vidro de grau de cultura tecidual, e aplique uma pequena força nas bordas para ligar o PDMS ao fundo do prato. Incubar o prato por 10 minutos a 70 graus Celsius.Em seguida, pressione as câmaras para fortalecer a adesão. Incubar o prato sob UV por 10 minutos e, em seguida, proceder à codificação do MFC. Adicione 1,5 nanogramas por MILilitro OLP aos dois compartimentos.Certificando-se de que a OLP está passando pelos canais. Ao canalizar a mídia de revestimento diretamente na entrada do canal. Examine o MFC sob um microscópio leve, para verificar se há bolhas.Se as bolhas de ar estiverem bloqueando as micro ranhuras, coloque o MFC em um desiccator a vácuo por dois minutos. Remova o excesso de ar dos canais MFC. Em seguida, incuba-lo durante a noite com a OLP.Substitua a OLP por laminina e incuba o MFC por mais uma noite. Antes de emplacamento, lave o laminina com meio de cultura. Dissecar um rato grávida ICR E12.5 e separar os embriões do saco amniótico.Coloque o embrião no prato de silicone HBSS. Retire a cabeça e a cauda e vire-a para a barriga dele. Retire suavemente a pele superficial dos embriões para trás, expondo a medula espinhal.Separe a medula espinhal do corpo da cabeça à cauda, usando pinças suaves. Remova as meninges, depois remova os chifres dorsais e corte a medula espinhal em seções transversais de um milímetro de espessura. Descarte todos os meios do compartimento proximal do MFC.Pegue uma única explanta medular com uma pipeta, em um volume total de quatro microliters. E injetá-lo o mais perto possível da caverna. Retire qualquer excesso de líquido do poço proximal através das saídas laterais.Repita a etapa anterior mais duas vezes e certifique-se de que as explantas estejam incorporadas no canal proximal. Adicione lentamente 150 microliters de meio SCEX, ao poço proximal. Um dia depois do chapeamento.Substituiu o meio SCEX no compartimento proximal e adicionei o rico meio SCEX ao compartimento distal. Mantendo um gradiente de volume de pelo menos 15 microliters por poço entre os poços distal e proximal. Após quatro a seis dias, os axônios devem atravessar para o compartimento distal e estar prontos para imagens de transporte axonal.Para rotular as mitocôndrias e compartimentos ácidos, prepare o meio SCEX fresco com 100 nanomolar MitoTracker Deep Red FM e 100 nanomolar LysoTracker Red. E adicione-o às câmaras microfluídicas. Incuba-os por 30 a 60 minutos a 37 graus Celsius.Em seguida, lave três vezes com o meio SCEX quente. Prossiga com imagens ao vivo do transporte axonal. Adquirindo uma série de imagens de lapso de tempo de 100 em intervalos de três segundos.Com um total de cinco minutos por filme. Depois de sete dias em câmaras microfluídicas. Explantes da medula espinhal HB9 GFP embrionárias do rato.Estamos manchados com corantes MitoTracker Deep Red e LysoTracker Red. Para rotular as mitocôndrias e compartimentos ácidos. Axônios nas ranhuras distal foram imagens e a análise de kymógrafo foi usada para determinar a distribuição geral do movimento.Isso revelou um viés na direção retrógrada apenas em compartimentos ácidos da cidade, mas não no transporte mitocondrial. A densidade de partículas também foi quantificada, revelando um maior número de partículas mitocondriais em comparação com compartimentos ácidos nos axônios explant da medula espinhal HB9 GFP. Em seguida, a análise de transporte de partículas únicas foi realizada utilizando-se software semi-automatizado seguido de código interno.Esta análise revelou que componentes ácidos e mitocôndrias têm velocidades de partículas semelhantes. Mas apenas compartimentos ácidos mostram um viés em relação ao movimento retrógrado. Isolar a medula espinhal embrionária pode ser difícil no início.Pratique este procedimento várias vezes, certificando-se de usar a idade embrionária correta e as ferramentas de dissecção apropriadas. O uso de câmaras microfluidas muda a forma como estudamos a biologia axonal. Permite visualizar processos axonais localizados, que uma vez somos hipóteses de ocorrer apenas no corpo celular.

axonal-transport-organelles-motor-neuron-cultures-using-microfluidic

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Neurociência

Neste vídeo podemos demonstrar a técnica da litografia macia com polydimethyl siloxano (PDMS) que usamos para farbricate um dispositivo micro para os neurônios cultura.

Fabricação de um dispositivo micro para a compartimentação de Neuron Soma e axônios

Aqui, descrevemos a técnica de preparação e manutenção de câmaras compartimentada para os neurônios sensoriais cultura do gânglio da raiz dorsal.

Preparação e manutenção dos neurônios da raiz dorsal Gânglios em culturas Compartmented

Nós desenvolvemos um romance de vários compartimentos neurônio plataforma microssistema co-cultura para a investigação in vitro a interação do SNC axônio glia. A plataforma é capaz de realizar até seis experimentos independentes em paralelo e foi fabricado usando um recém-desenvolvido macro / micro método de fabricação híbrida.

Um compartimento Multi-glia do SNC Neuron-Co-cultura plataforma microfluídica

Este vídeo demonstra um método para rastrear o transporte axonal em neurônios motores usando um sistema de câmara microfluídica. Envolve a cultura de tecidos embrionários da medula espinhal de camundongos em poços revestidos de polímero com meio nutriente para induzir o crescimento axonal. O movimento de organelas coradas com corante fluorescente em imagens ao vivo confirma o transporte axonal bidirecional.

Rastreando o transporte axonal de organelas em neurônios motores usando um dispositivo microfluídico

Células Drosophila S2 e neurônios cultivados são grandes sistemas para a imagem latente de transporte organela motorizado in vivo. Aqui nós descrevemos protocolos detalhados para o cultivo de ambos os tipos de células, a sua imagem e análise de transporte.

Transporte Organelle em Cultivadas Drosophila Células: Linha celular S2 e primário neurônios.

Protocolos para único neurônio microfluídicos arraying e mascaramento de água para a padronização dos revestimentos de biomateriais plasma em-chip são descritos. Altamente interligados co-cultura pode ser preparado através de entradas de células mínima.

Preparação de Neuronal co-culturas com precisão única célula

O transporte intracelular de cargas, como vesículas ou organelas, é realizado por proteínas motoras moleculares que rastreiam microtúbulos polarizados. Este protocolo descreve a correlação da direcionalidade do transporte de partículas de carga individuais que se movem dentro dos neurônios, com a quantidade relativa e o tipo de proteínas motoras associadas.

Caracterizar a composição de motores moleculares sobre Movimentação axonal Carga Utilizando Análise &quot;Mapeamento Cargo&quot;

Este protocolo fornece um procedimento abrangente para fabricar organoide nervoso motor derivado de células iPS humanas através da montagem espontânea de um robusto feixe de axônios estendidos de um esferoide em um chip de cultura tecidual.

Geração organoide do nervo motor tridimensional

Descrevemos um método para gerar unidades motoras humanas em dispositivos microfluidos comercialmente disponíveis, co-culminando neurônios motores pluripotentes induzidos por células-tronco com miótubos primários derivados do mesoangioblast, resultando na formação de junções neuromusculares funcionalmente ativas.

Geração de Unidades Motoras Humanas com Junções Neuromusculares Funcionais em Dispositivos Microfluidos

O presente protocolo descreve a semeadura e coloração de mitocôndrias neuronais em câmaras microfluídicas. O gradiente de pressão fluídica nessas câmaras permite o tratamento seletivo de mitocôndrias em axônios para analisar suas propriedades em resposta a desafios farmacológicos sem afetar o compartimento do corpo celular.

Despolarização Seletiva Assistida por Microfluídica das Mitocôndrias Axonais

Aprenda a rastrear o transporte axonal em neurônios motores usando câmaras microfluidas de PDMS. Este método permite visualizar organelas em tempo real e investigar mecanismos relacionados a doenças neurodegenerativas como ELA.

Transporte Axonal de Organelas em Culturas de Neurônios Motores usando sistema de câmaras microfluidas

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