Name: Otimização da Cultura Organóide Renal e Organotípica para Vascularização, Desenvolvimento Estendido e Imagem Microscopia Aprimorada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Aprenda a cultivar organoides renais em membrana corioalantoica de embrião de galinha para melhorar a vascularização e permitir imagem de alta resolução. Este método aumenta a sobrevivência celular e o fluxo sanguíneo no glomérulo em desenvolvimento.

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Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Suomen Akatemia (Academia da Finlândia) (206038, 121647, 250900, 260056; Doação do Centro de Excelência 2012-2017 251314), Munuaissäätiö - Associação Finlandesa de Rim e Fígado, Sigrid Juseliuksen Säätiö, Victoriastiftelsen, Fundação Cultural Sueca na Finlândia, Novo Nordisk, Syöpäjärjestöt (Cancer Society of Finland), o Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia (FP7/2007-2013; subvenção FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608) e H2020 Marie Sklodowska-Curie Actions Innovative Training Network "RENALTRACT" Project ID 642937 Os autores agradecem a Paula Haipus, Johanna Kekolahti-Liias e Hannele Härkman pela assistência técnica.
As figuras 3, 4 e Filme 2 são reimpressas com permissão do Desenvolvimento.

Os cuidados e procedimentos dos animais estavam de acordo com a legislação nacional finlandesa para o uso de animais de laboratório, a Convenção Europeia para a proteção de animais vertebrados utilizados para fins experimentais e outros produtos científicos (ETS 123) e a Diretiva 86/609/CEE da UE.
1. Fabricação de minireservatórios para cultivo de rins embrionários de camundongos e organóides renais em CAM de frango e criação de experimentos de xenotransplante
<ol><li>Use pastilhas de cultura de células transwell projetadas para 6 placas de poço ou 12 poços. NOTA: Dependendo do experimento específico, podem ser utilizados minireservatórios grandes ou pequenos. É melhor usar pequenos minireservatórios para xenoenxertar até oito rins embrionários ou quando vários minireservatórios serão colocados no mesmo embrião de frango (por exemplo, experimentar e controlar amostras no mesmo CAM de frango).</li>
	<li>Corte as laterais das pastilhas usando uma multiferramenta rotativa com uma lâmina de serra circular ou uma serra de mão para criar um anel plástico de 2 mm de altura com uma membrana permeável presa a ele.</li>
	<li>Polir as bordas desses minireservatórios com um bisturi ou uma faca afiada.</li>
	<li>Esterilize os minireservatórios em 70% de etanol por pelo menos 1 h.</li>
	<li>Lave os minireservatórios em água dupla destilada autoclaved e deixe-os secar em um capô laminar.</li>
	<li>Enxágüe os minireservatórios em PBS e meio de cultura (DMEM de alta glicose/10% FBS/1% penicilina-estreptomicina).</li>
	<li>Coloque o reservatório em uma placa de Petri, em cima de uma gota (600 μL/400 μL) de meio de cultura com a membrana voltada para cima.</li>
	<li>Disponha rins embrionários ex vivos dissecados ou organóides renais uniformemente na membrana com a ajuda de uma pipeta ou de um tubo capilar de vidro. Evite deixar muito líquido ao redor dos rins.</li>
	<li>Deixe as amostras se prenderem à membrana por 2-24 h em uma incubadora de cultura celular a 37 °C e 5% CO2. NOTA: Até oito rins embrionários de camundongos e organóides embrionários E11.5 podem ser dispostos na pequena inserção. A grande inserção é recomendada se pedaços maiores de tecido embrionário serão usados para xenotransplante ou uma mistura de hidrogel celular em uma área maior do CAM.</li>
	<li>Pegue galinhas embrionárias ex ovo de 8 dias preparadas de acordo com métodos publicados anteriormente da incubadora de cultura celular12,13.</li>
	<li>Transfira os minireservatórios para o CAM para que os enxertos estejam voltados para a CAM, e a membrana os sobrepõe. Coloque os minireservatórios na periferia da CAM, para que não estejam cobrindo o embrião de frango. NOTA: Ao utilizar os minireservatórios menores fabricados a partir de pastilhas transwell para 12 placas de poço, até três minireservatórios podem ser colocados em uma CAM.</li>
	<li>Adicione 500 μL (6 inserções de poço) ou 300 μL (12 pastilhas de poço) do meio de cultura aos minireservatórios.</li>
	<li>Cultive as amostras em CAM de frango por um máximo de 9 dias. Substitua o meio de cultura nos minireservatórios diariamente. NOTA: A vascularização das amostras pode ser observada a partir das 24 h às 48 h após o transplante.</li>
</ol>2. Fabricação de placas personalizadas e criação de culturas FiZD
<ol><li>Furos de 20 mm de diâmetro na parte inferior de uma placa de 6 poços. NOTA: Para experimentos FiZD, use 6 placas de poço com uma profundidade de poço de 16 mm (especificada em Tabela de Materiais).</li>
	<li>Polir as bordas dos orifícios (especialmente na parte superior) usando uma broca elétrica com uma broca de contra-pia, um bisturi ou uma faca afiada.</li>
	<li>Esterilize as placas em 70% de etanol por pelo menos 1 h.</li>
	<li>Lave as placas em água duplamente destilada e deixe-as secar em condições estéreis.</li>
	<li>Lave completamente as tampas de vidro de 22 mm x 22 mm com 70% de etanol ou limpe-as de acordo com o protocolo publicado por Saarela et al.11.</li>
	<li>Cole as tampas para o lado superior dos orifícios em 6 placas de poço usando uma cola de tecido não tóxica. Aplique cola ao redor do orifício e coloque delicadamente o deslizamento de cobertura para cobri-lo. Deixe a cola secar.</li>
	<li>Inspecione as placas sob um microscópio eretore e remova o excesso de cola seca da superfície das tampas, se necessário. NOTA: Verifique se não há cola acima do deslizamento de cobertura para garantir a compressão das amostras.</li>
	<li>Misture contas de poliestireno (tamanho de partícula de 70 μm) com um volume igual de hidrogel. Um volume de 50-100 μL por poço é suficiente. NOTA: Mantenha a mistura de contas de hidrogel e poliestireno no gelo.</li>
	<li>Coloque uma inserção transwell um microscópio dissecando com a membrana para cima.</li>
	<li>Organize as amostras (por exemplo, rins embrionários ex vivos ou organóides renais) uniformemente na membrana.</li>
	<li>Adicione cuidadosamente a mistura de talo hidrogel/poliestireno ao lado das amostras para evitar danos a tecidos frágeis.</li>
	<li>Gire a inserção transwell para que a membrana com as amostras montadas sobre ela esteja voltada para baixo.</li>
	<li>Coloque suavemente a inserção em um poço da placa de 6 poços modificada e pressione-a suavemente para baixo para que as amostras sejam compactadas ao nível das contas. NOTA: Acompanhe o progresso da compressão usando um microscópio.</li>
	<li>Mantenha a inserção ligeiramente pressionada para o poço com uma mão e fixe-a na placa derretendo plástico com um ferro de soldar em três pontos na periferia da pastilha.</li>
	<li>Quando a inserção estiver fixada na placa, adicione 2 mL de meio de cultura (DMEM/10% FBS/1% penicilina-estreptomicina) ao poço e continue montando os poços restantes na placa da mesma forma.</li>
	<li>Transfira a placa acabada para uma incubadora no estágio de um microscópio invertido para imagens de lapso de tempo.</li>
	<li>Realize imagens de lapso de tempo das amostras usando configurações experimentais apropriadas. NOTA: A mudança do meio de cultura nos poços da placa durante experimentos de lapso de tempo não é necessária, mas pode ser facilmente feita através dos orifícios nas laterais da pastilha.</li>
</ol>

<ol><li>Saxen, L., Wartiovaara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+contact+and+cell+adhesion+during+tissue+organization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell contact and cell adhesion during tissue organization.</a> International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).</li>
<li>Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchungen+%C3%BCber+die+tubulogenese+der+niere%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+F%C3%BCr+Naturforschung%22%5BJournal%5D)">Untersuchungen über die tubulogenese der niere.</a> Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).</li>
<li>Saxen, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaxen%2C+L+%22Organogenesis+of+the+Kidney.+1st+ed%22">Organogenesis of the Kidney. 1st ed</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (1987).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 536 (7615), 238(2016).</li>
<li>Halt, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD146%2B+cells+are+essential+for+kidney+vasculature+development%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">CD146+ cells are essential for kidney vasculature development.</a> Kidney International. 90, 311-324 (2016).</li>
<li>van den Berg, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+Subcapsular+Transplantation+of+PSC-Derived+Kidney+Organoids+Induces+Neo-vasculogenesis+and+Significant+Glomerular+and+Tubular+Maturation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).</li>
<li>Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+vascularization+of+the+metanephric+kidney+grafted+on+the+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane.</a> Developmental Biology. 96 (2), 427-435 (1983).</li>
<li>Sariola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incomplete+fusion+of+the+epithelial+and+endothelial+basement+membranes+in+interspecies+hybrid+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli.</a> Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).</li>
<li>Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+the+glomerular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The origin of the glomerular endothelium.</a> Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).</li>
<li>Short, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Quantification+of+Tissue+Dynamics+in+the+Developing+Mouse+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney.</a> Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).</li>
<li>Saarela, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+fixed+z-direction+%28FiZD%29+kidney+primordia+and+an+organoid+culture+system+for+time-lapse+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging.</a> Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).</li>
<li>Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex-ovo+Chicken+Embryo+Culture+System+Suitable+for+Imaging+and+Microsurgery+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, e2154(2010).</li>
<li>Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+ex+ovo-cultivation+of+developing+chicken+embryos+for+human+stem+cell+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts.</a> Stem Cells International. 2013, 960958(2013).</li>
<li>Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt4+coordinates+directional+cell+migration+and+extension+of+the+M%C3%BCllerian+duct+essential+for+ontogenesis+of+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract.</a> Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).</li>
<li>Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie-1-directed+expression+of+Cre+recombinase+in+endothelial+cells+of+embryoid+bodies+and+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice.</a> Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).</li>
<li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).</li>
<li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Dois protocolos detalhados são apresentados que refinam o método clássico de cultura organotípica renal, e permitem a vascularização, o desenvolvimento prolongado e a imagem 4D ideal (ou seja, imagem 3D e tempo) de imagens ex vivos embrionárias e organóides. Esta seção destaca as etapas críticas nos métodos e discute a solução de problemas.
A diferença significativa entre outros métodos de cultura CAM e este método de cultura cam de frango melhorado é o uso de minireservatórios feitos medida n...

A cultura organotípica dos rins embrionários tornou-se um importante modelo para estudar a nefrogênese décadas atrás1,2,3. Organóides renais representam um sistema de modelo avançado para estudar o desenvolvimento de rins saudáveis e doentes4. A principal desvantagem para ambos os métodos, no entanto, é que nenhum dos métodos recapitula a função principal do rim: filtração sanguínea. Neffros e vasculatura renal desenvolvem-se em organóides renais e culturas organotípicas de forma semelhante ao estágio inicial no desenvolvimento vivo; no entanto, os glomeruli formados in vitro permanecemavasculares 5. A vascularização de rins embrionários ex vivos e organóides renais foi previamente demonstrada em experimentos de transplante apenas em condições in vivo. Por exemplo, o transplante de organóides renais derivados de células-tronco pluripotentes humanas sob uma cápsula de rim de camundongos permite o desenvolvimento dos néfrons no organóide para um estágio funcional6.
Uma abordagem intermediária entre culturas puramente in vitro e métodos de transplante in vivo é o xenotransplante para a CAM de embriões aviários. A vascularização da primordia renal do rato intacta foi demonstrada anteriormente usando este sistema7,8. No entanto, também foi demonstrado que a vasculatura renal no rim murina xenotransplantado foi derivada do endotélio hospedeiro, não do enxerto9. Esta observação reduziu significativamente o potencial de modelos quiméricos (aviários-mamíferos) de rim embrionário para estudar o desenvolvimento da vasculatura renal, porque as condições experimentais não eram permissivas para a sobrevivência de células endoteliais derivadas de doadores.
Apresentado na primeira parte deste protocolo é um método aprimorado para o cultivo de rins embrionários de camundongos em CAM de ovos aviários, combinando condições microambientais de cultura organotípica e xenotransplante. A principal melhoria dos métodos anteriores é que, em vez de colocar os rins embrionários do rato e organóides renais diretamente no CAM, a área de implantação é sobreposta com minireservatórios permeáveis cheios de meio de cultura que fornecem o tecido transplantado com nutrientes e protegê-lo da secagem. A taxa de sucesso dos experimentos aumenta significativamente e as condições para o desenvolvimento da vasculatura derivada de doadores melhoram. A aplicação deste método às culturas xenotransplanteresulta no desenvolvimento da vasculatura glomerular composta por células endógenas endógenas dos rins doadores.
A análise detalhada da morfogênese celular é outra importante aplicação de modelos de cultura renal. Os métodos previamente relatados de aquisição de imagens de lapso de tempo de culturas renais são suficientes apenas para análise da morfologia geral e padronização do rim embrionário, mas não para o rastreamento de células individuais10. Recentemente, foi descrito um novo método Fixo de Direção Z (FiZD) destinado à imagem confocal de lapso de tempo 3D de alta resolução de organóides renais e culturas organotípicas11. Neste método, os organóides e órgãos embrionários são suavemente comprimidos entre uma tampa de vidro e uma membrana permeável de uma inserção transwell em uma placa projetada medida até que a espessura da amostra atinja 70 μm, proporcionando condições ópticas ideais para a imagem. Na segunda parte dos métodos, é descrito um protocolo detalhado para a fabricação de uma placa projetada medida e a configuração de experimentos FiZD para imagens organóides de longo prazo.

<table><tbody><tr><td>Broca de pá ajustável</td><td>Bosch</td><td>2609255277</td><td>Para fazer furos de 20 mm de diâmetro</td></tr><tr><td>Torneiro de ovos automático</td><td>OLBA B.V., Holanda</td><td>AT-42</td><td>Para incubação de ovos antes da configuração ex ovo.</td></tr><tr><td>Incubadora de Células</td><td>Panasonic</td><td>13090543</td><td>Temperatura ajustada em 37&deg; C, 90% de umidade, 5% de CO2</td></tr><tr><td>Cell Incubadora</td><td>de cultura CAM de frango SANYO</td><td>10070347</td><td>. Temperatura ajustada em 37&deg; C, 90% de umidade, 5% de CO2</td></tr><tr><td>Cellstar Placa de 6 poços</td><td>Greiner</td><td>M9062</td><td>Profundidade de 16 mm dos poços para combinar com as inserções Lâmina de</td></tr><tr><td>serra circular para ferramenta rotativa Dremel</td> Microscópio confocal <td>Dremel</td><td>SC690</td><td></td></tr><tr><td>Placa</td><td>de poços múltiplos transwell Zeiss</td><td>LSM780</td><td></td></tr><tr><td>Corning com inserções de membrana de policarbonato permeável</td><td>Corning</td><td>10301031</td><td>Para placas de 6 poços. 40 &micro; m tamanho do poro</td></tr><tr><td>Countersink Broca</td><td>Craftomat, Bauhaus</td><td>22377902</td><td>Para polimento (20,5 mm, 1/4 ", HSS)</td></tr> <tr><td>Tubo capilar de vidro descartável</td><td>Blaubrand</td><td>7087 33</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi descartável</td><td>Swann-Morton</td><td>0501</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de perfuração</td><td>Bosch</td><td>GSR 18 V-EC </td> Incubadora de ovos de alta glicose Sigma D777 da Eagle modificada profissional <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Dulbecco</td></tr><tr><td>Compact S84</td><td>Grumbach, Alemanha</td><td>8012</td><td>Para incubação de ovos antes da configuração ex ovo. Temperatura ajustada em 38&deg; C com umidade relativa acima de 60%</td></tr><tr><td>Etanol (70%)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ovos Fertilizados</td><td>Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finlândia</td><td></td><td>Hy-Line White e Nick</td></tr><tr><td>Chick Fetal Bovine Serum</td><td>HyClone</td><td>SH3007003HI Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps DUMONT #5</td><td>Dumont</td><td>#5SF</td><td></td></tr><tr><td>Glass Coverwashs</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td>Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0##</td><td>22x22 mm</td></tr><tr><td>Cola Histoacryl</td><td>Braun</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora em palco</td><td>Okolab</td><td></td><td>Boldline, feito sob medida</td></tr><tr><td>PBS -/-</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS +/+</td><td>Biowest</td><td>X0520-500</td><td>Lavar os mini reservatórios.</td></tr><tr><td>Penicilina e Estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Contas de Poliestireno</td><td>Corpuscular</td><td>1000263-10</td><td>70 &micro; m de diâmetro</td></tr><tr><td>Sistema de Ferramentas Multi Rotativas</td><td>Dremel</td><td>4000</td><td></td></tr><tr><td>Ferro de Solda</td><td>Weller</td><td>TCP S</td><td>Capilar de vidro aquecido também pode ser usado</td></tr><tr><td>Inserções de Cultura de Células de 12 poços Thincert Com 0.4 &micro; Membrana de Poliestireno m-pore</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665641</td><td></td></tr><tr><td>Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 &micro; Membrana de poliestireno m-pore</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657610</td><td></td></tr></tbody></table>

otimização da cultura organóide renal e organotípica para vascularização, desenvolvimento estendido e imagem microscopia aprimorada

Optimization of Renal Organoid and Organotypic Culture for Vascularization, Extended Development, and Improved Microscopy Imaging

Culturas organotípicas de rim embrionário, e especialmente organóides renais derivados de células-tronco pluripotentes, são excelentes ferramentas para acompanhar processos de desenvolvimento e modelar doenças renais. No entanto, os modelos são limitados pela falta de vascularização e funcionalidade. Para lidar com isso, foi desenvolvido um protocolo aprimorado para o método de xenoenxerto de células e tecidos para a membrana corioallantoica (CAM) de um embrião aviário para obter vascularização e restauração do fluxo sanguíneo. Os enxertos são sobrepostos com minireservatórios feitos medida que fixam as amostras no CAM e fornecem-lhes meio de cultura que protege os enxertos da secagem. O método de cultura aprimorado permite que os xenoenxertos cresçam por até 9 dias. O manuscrito também descreve como fornecer condições ideais para imagens confocais de longo prazo de organóides renais e culturas organotípicas usando o método Fixa Z-Direction (FiZD) publicado anteriormente. Este método comprime suavemente um órgão embrionário ou organóide entre um deslizamento de vidro e membrana em uma grande quantidade de meio e fornece excelentes condições para a imagem por até 12 dias. Juntos, esses métodos permitem a vascularização e o fluxo sanguíneo para organóides renais e culturas renais organotípicas com melhor imagem confocal. Os métodos descritos aqui são altamente benéficos para o estudo de funções fundamentais e aplicadas de rins ex vivo. Ambos os métodos são aplicáveis a vários tipos de tecidos e organóides.

O protocolo de cultura CAM aqui apresentado possibilitou a vascularização altamente eficiente de organóides renais e rins embrionários como resultado do xenotransplante no cam de frango (Figura 1, Filme 1). Minireservatórios contendo meio saqueador forneceram nutrientes ao tecido doador e o protegeram da secagem durante o período anterior à vascularização adequada. Este método forneceu condições permissivas para o crescimento de células endoteliais derivadas de doadores. Por...

Este trabalho descreve dois métodos para estudar o desenvolvimento de órgãos, uma melhor configuração de xenotransplante na membrana corioallantoica (CAM) a partir de embriões aviários que permite a vascularização de órgãos e organóides embrionários cultivados e uma nova direção fixa z método de cultura de órgãos com condições experimentais modificadas que permite imagens confocais de lapso de tempo de alta resolução.

Otimização da Cultura Organóide Renal e Organotípica para Vascularização, Desenvolvimento Estendido e Imagem Microscopia Aprimorada

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental ...

A cultura de órgãos renais e organelas derivadas de células-tronco programadas fornecem excelentes maneiras de estudar mecanismos por trás do desenvolvimento renal e doenças. No entanto, o sistema atual de cultura de órgãos não fornece fluxo sanguíneo para o rim. Devido a isso, a razão pela qual os modelos atuais estão incompletos e não conseguem recapitular a função principal do rim, que é a filtragem sanguínea.Nesta publicação, apresentamos um protocolo aprimorado para cultivo e visualização de rins embriões e organoides na membrana corioallantóica do embrião de frango. Em nossa nova configuração experimental, sobrepomos os rudimentos renais transplantados na CAM com reservatórios permeáveis que estão cheios de meio de cultura. Este protocolo aumenta significativamente a sobrevivência dos rudimentos renais e também das células endoteliais intrínsecas.O método permite o fluxo sanguíneo para o glomerulus em desenvolvimento. Recentemente publicamos também um novo método de cultura de órgão de direção fixa que oferece imagens de lapso de tempo 3D confocal de alta resolução. O método forneceu condições ideais para imagens confocal de longo prazo dos organoides e rudimentos de órgãos.Na abordagem, compactamos suavemente o tecido entre um deslizamento de tampa de vidro e uma membrana permeável. Aqui mostramos como as placas projetadas sob medida são feitas e como os experimentos culturais são configuradas. Assim, nesta publicação apresentamos uma técnica de cultura de tubos de organela renal aprimorada.Este método oferece uma melhor maneira de modelar a organela gênese e realizar imagens de alta resolução para estudar rins embrionários e organoides renais ex vivo. Dependendo do seu experimento, faça contrassos de células de transferência projetadas para placas de seis ou 12 poços. Corte as laterais da pastilha usando uma ferramenta Dremel para criar um anel plástico de dois milímetros de altura com uma membrana permeável ligada a ele.Polir as bordas do anel de swarf com um bisturi ou uma faca afiada. Esterilize os mini reservatórios em 70% de etanol por pelo menos uma hora. Em seguida, lave os mini reservatórios em autoclave por água destilada e seque-os em um capô laminar.Enxágüe os mini reservatórios em PBS e meio de cultura. Coloque o reservatório em uma placa de petri em cima do nosso meio de cultura com a membrana voltada para cima. Disponha rins embrionários ex vivo dissecados ou organoides renais na membrana.Evite deixar muito líquido ao redor das amostras e deixe-as presas de duas a 24 horas em uma incubadora de cultura celular. O transplante exenal é feito à membrana corioallantóica de um frango ex-embrionário ex-ovo de oito dias de idade. Transfira os mini reservatórios para que a membrana esteja cobrindo o enxerto.Coloque-os na periferia da CAM para que não estejam cobrindo o embrião. Em seguida, adicione o meio de cultura aos mini reservatórios. Cultive as amostras em CAM de frango por nove dias como máximo.Substitua o meio de cultura nos mini reservatórios diariamente. A vascularização das amostras já pode ser observada de 24 a 48 horas após o transplante. Para fazer as placas personalizadas projetadas de seis poços para a cultura fixa.Você precisa começar perfurando furos de 20 milímetros na parte inferior da placa usando uma máquina de perfuração com uma broca adequada. Em seguida, polir as bordas dos orifícios na parte superior da placa. Por fim, esterilize as placas em 70% de etanol por pelo menos uma hora.Em seguida, lave as placas em autoclave por água destilada e seque-as na capa lemiar. Lave a tampa de 22x22 milímetros em 70% de etanol e deixe-os secar completamente. Cole o deslizamento da tampa em cima de um orifício na parte inferior de um poço usando cola de tecido.Após a secagem, inspecione as placas sob microscópio estéril e remova o excesso de cola. Primeiro, misture uma alíquota de contas de poliestireno com um volume igual de hidrogênio. Coloque a inserção transfill sob um microscópio dissecando com membrana voltada para cima e organize os rins na membrana.Adicione uma gota de mistura de contas de hidro gel ao lado dos rins cuidadosamente. Vire a inserção transfill para que a membrana e os rins estejam voltados para baixo. Em seguida, coloque cuidadosamente a inserção em nosso poço de placa de seis poços projetada sob medida.Empurre a pastilha muito suavemente para dentro do poço. Siga o grau de achatamento do microscópio até que o rim esteja no nível das contas. Mantenha a inserção ligeiramente pressionada no poço com uma mão e fixe-a na placa derretendo plástico em três pontos na periferia da pastilha com um ferro de solda.Adicione dois mililitros de cultura no poço através de uma abertura ao lado. Ao iniciar uma imagem de lapso de tempo, transfira a placa para a incubadora no estágio de um microscópio invertido. Nosso protocolo de captura cam modificado permite vascularização altamente eficiente de organoides renais e rins embrionários.Muitos reservatórios que contêm cultura média fornecem tecido de doadores e o protege da secagem durante o período inicial de tempo em andamento do vascularizaton. Este filme mostra o fluxo de células sanguíneas de frango em um centro renal de rato embrionário enxertado em cam de frango e cultivado por sete dias. Este painel de figuras mostra que nosso método de cultura CAM melhorado fornece condições permissivas para as células endoteliais derivadas renais.As figuras A e B mostram que os rins embrionários cultivados por cinco dias em dias de cultura de intervalo foram enxertados no CAM de frango por cinco dias. A coloração com o anticorpo CD-31 específico do camundongo mostra que a rede celular endotelial do centro renal enxertado na CAM é mais extensa do que no controle do lado esquerdo. Na figura C vemos que os vasos sanguíneos do rato manchados com anticorpo CD-31 específico do rato e isso é o mais com vasos sanguíneos de frango.As figuras D e E mostram criosecções de rins embrionários de camundongos cultivados na cultura de viagem ou cam de frango por cinco dias e manchados com CD-31 e Hoechst. A vasculatura glomeruli é mais madura em rins cultivados em CAM de frango do que em culturas de controle. A Figura F mostra um rim embrionário de rato cultivado na CAM de um frango GFP transgênico por sete dias.As células endoteliais do rato estão manchadas com anticorpo CD-31 e podemos observar que a vasculatura nos rins de camundongos xenotransplantados é principalmente, mas não exclusivamente derivada do rato. A nova cultura de direção fixa permite a cultivo de rins embrionários e organoides em uma distância fixa restrita. Em uma cultura de viagem tradicional, os órgãos cultivados são colocados em um filtro que é mantido em uma interface média de ar por uma grade metálica.Este método permite boas condições para o desenvolvimento e crescimento, mas não é ideal para imagens. Na cultura de direção fixa, o órgão cultivado é pressionado entre um fundo de vidro do prato e uma membrana e a espessura dele é controlada pelas contas de poliestireno que trabalham como espaçadores aqui. Os órgãos em desenvolvimento podem ser imagens através do vidro da tampa dando a visão melhorada do órgão.Este painel de figuras mostra que os rins embrionários e organoides renais podem ser cultivados no método de cultura de direção fixa. Imagens de campo brilhante de rins embrionários e organoides renais no sétimo dia mostram desenvolvimento normal. Na figura C, a expressão GFB foi ativada nos nefrões em desenvolvimento de um organoide renal pela Figura D mostra um rim com trauma uma mancha no broto etértrico e seis duas manchas marcando as células precursoras do nefron.As figuras E e F apresentam o rim do rato cultivado por 12 dias. O trauma e a coloração de nefron mostram o broto euretérico e podocites. O filme também apresenta um rim embrionário de MTMG, origem cree de Taiwan, onde o credo de Taiwan induz a expressão GFB em células endoteliais.Podemos ver que as células endoteliais renais estão presentes no rim embrionário em desenvolvimento e a rede endotelial também pode se desenvolver no método de cultura. No painel à direita, você pode ver como as células endoteliais migram para a fissura vascular de um nefron estágio em forma de S. Aqui apresentamos o protocolo aprimorado para xenotransplante de organoides renais e rins embrionários para cam de frango.Este protocolo aumenta significativamente a sobrevivência dos rudimentos renais e também suas células endoteliais intrínsecas. O método permite o fluxo sanguíneo para o glomerulus em desenvolvimento. O outro protocolo aqui apresentado é o método de cultura de órgãos de direção fixa que melhora a qualidade da imagem e ajuda a estudar a organela gênese no nível único celular.As imagens de alta resolução são adequadas para segmentação celular automatizada e estudo baseado em computador do comportamento celular em organoides renais e culturas renais.

optimization-renal-organoid-organotypic-culture-for-vascularization

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo descreve um método para estudar o desenvolvimento de órgãos usando uma configuração aprimorada de xenotransplante na membrana corioalantóide (CAM) de embriões de aves. Este método permite o desenvolvimento de órgãos embrionários e organoides cultivados totalmente vascularizados.

Cultura organotípica renal em CAM de galinha: uma técnica para transplante de explantes renais murinos em CAM de galinha para induzir a formação de arquitetura vascular renal

O método de cultura tridimensional descrito neste protocolo recapitula o desenvolvimento do pâncreas dispersos progenitores rato pâncreas embrionárias, incluindo a sua expansão substancial, a diferenciação ea morfogênese em um órgão ramificada. Este método é passível de imagiologia, interferência funcional e a manipulação do nicho.

In Vitro Pâncreas Organogenesis de dispersos rato embrionárias Progenitores

Toda a estrutura 3D e o conteúdo celular dos organoides, bem como sua semelhança fenotípica com o tecido original podem ser capturados usando o protocolo de imagem 3D de resolução unicelular descrito aqui. Este protocolo pode ser aplicado a uma ampla gama de organoides variando em origem, tamanho e forma.

Resolução unicelular imagens tridimensionais de organoides intactos

Este protocolo demonstra métodos para permitir a cultura in vitro estendida de xenoenxertos derivados do paciente (PDX). Um passo aumenta a viabilidade geral das culturas de cluster multicelulares em hidrogéis 3D, através da remoção direta de células únicas não viáveis. Um passo secundário demonstra as melhores práticas para a cultura PDX em uma plataforma microfluida perfumada.

Viabilidade aprimorada para culturas de hidrogel 3D Ex vivo de xenoenxertos derivados do paciente em uma plataforma microfluida perfusada

Aqui descrevemos um protocolo para gerar organoides renais a partir de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). Este protocolo gera organoides renais dentro de duas semanas. Os organoides renais resultantes podem ser cultivados em frascos rotadores em larga escala ou placas de agitação magnética multi-bem para abordagens paralelas de teste de drogas.

Um método simplificado para gerar organoides renais a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Este trabalho apresenta um protocolo de fabricação para um novo tipo de substrato de cultura com centenas de microrecipientes por mm2, no qual organoides podem ser cultivados e observados por microscopia de alta resolução. Os protocolos de semeadura celular e imunocoloração também são detalhados.

Uma plataforma de alto rendimento para cultura e imagem 3D de organoides

Apresentamos aqui um protocolo detalhado para o transplante de organoides renais na cavidade celômica de embriões de galinha. Este método induz a vascularização e maior maturação dos organoides em 8 dias e pode ser usado para estudar esses processos de maneira eficiente.

Vascularização Eficiente de Organoides Renais através do Transplante Intracelomico em Embriões de Galinha

Este protocolo apresenta um método abrangente e eficiente para a produção de organoides renais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) utilizando condições de cultura em suspensão. A ênfase primária deste estudo reside na determinação da densidade celular inicial e da concentração do agonista WNT, beneficiando assim os investigadores interessados na pesquisa de organoides renais.

Geração de Organoides Renais em Suspensão a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas

Aqui, apresentamos um protocolo para enxertar organoides cerebrais humanos em múltiplos estágios de maturação na membrana corioalantóide (CAM) de pintinhos. Os organoides cerebrais foram cultivados seguindo protocolos padronizados não guiados.

Modelagem Inicial de Nicho Neurovascular Organoide Cerebral Humano Não Guiado na Membrana Corioalantóide Permissiva do Embrião de Pinto

Este protocolo apresenta um método para geração de organoides vasculares utilizando células-tronco pluripotentes humanas.

Geração de Organoides Vasculares a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Aprenda a cultivar organoides renais em membrana corioalantoica de embrião de galinha para melhorar a vascularização e permitir imagem de alta resolução. Este método aumenta a sobrevivência celular e o fluxo sanguíneo no glomérulo em desenvolvimento.

Otimização da Cultura Organóide Renal e Organotípica para Vascularização, Desenvolvimento Estendido e Imagem Microscopia Aprimorada (Vídeo) | JoVE Journal

Otimização da Cultura Organóide Renal e Organotípica para Vascularização, Desenvolvimento Estendido e Imagem Microscopia Aprimorada

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