Um modelo esferóide 3D para glioblastoma
9 de abril de 2020
Aqui, descrevemos um ensaio de invasão fácil de usar para glioblastoma. Este ensaio é adequado para células-tronco de glioblastoma. Uma macro Fiji para fácil quantificação de invasão, migração e proliferação também é descrita.
Culturas celulares bidimensionais não imitam adequadamente o crescimento do tumor in vivo. Para melhorar, procedimentos 3D foram desenvolvidos usando eferóides. Nosso ensaio glioblastoma spheroid 3D é particularmente adequado para investigar a invasão de tumores cerebrais no ambiente saudável do tumor cerebral.
Modelos de cultura tridimensional podem ser usados para recapitular uma arquitetura multicelular, heterogeneidade e estado metabólico de tumores permitindo uma avaliação mais rigorosa dos efeitos medicamentosos. Certifique-se de não tocar na parte inferior do poço ou remover completamente o supernasce, manter o gel no gelo e adicionar as células ao gel rapidamente. Para gerar esferoides tumorais de tamanho uniforme, primeiro lave a cultura celular tumoral de interesse com cinco mililitros de PBS e trate as células com 0,5 a um mililitro de enzima dissociação.
Após cinco minutos a 37 graus Celsius, pare a reação com quatro a 4,5 mililitros de PBS e transfira as células separadas para um tubo cônico de 15 mililitros contendo 10 mililitros de meio de crescimento completo. Após a contagem, resuspenque as células em uma vez 10 a 10 a sexta células por oito mililitros de meio de crescimento completo complementados com dois mililitros de concentração de 2% de metilcelulose e transfira a suspensão para um recipiente de sistema estéril. Em seguida, adicione 100 microliters de células a cada poço de uma placa inferior redonda de 96 poços e coloque a placa em uma incubadora de dióxido de carbono de 37 graus Celsius 5% por três a quatro dias.
Para realizar um ensaio de invasão, quando as células tumorais formaram esferoides de tamanho uniforme, transfira cada estrutura celular para um tubo de 500 microliteres e lave os esferoides uma vez com 200 microliters de PBS. Após a segunda lavagem, transfira cuidadosamente os esferoides em 100 microliters de matriz de colágeno recém-preparada e adicione cada suspensão esferoide no centro de cada poço de uma placa de fundo plano de 96 poços. Após uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius, adicione 100 microliters de meio de crescimento completo em cima do gel em cada poço.
Certifique-se de colocar todos os esferoides no centro de cada poço para a melhor imagem da invasão celular tumoral. Para realizar um ensaio de migração, quando as células tumorais formaram esferoides de tamanho uniforme, cubra uma placa de seis poços com 0,2 miligramas por mililitro de Matrigel em meio de crescimento por 30 minutos a 37 graus Celsius. No final da incubação, remova o Matrigel e adicione dois mililitros de meio de crescimento completo a cada poço.
Transfira os esferoides da placa inferior redonda em volumes de 50 microliteres em poços individuais da placa de seis poços e coloque a placa na incubadora de cultura celular por 24 horas. No dia seguinte, manche os esferoides com 10 nanogramas por mililitro de Hoechst por 30 minutos a 37 graus Celsius. Para aquisição de imagens após um ensaio de invasão ou migração, coloque a placa no palco de um microscópio confocal Brightfield equipado com uma câmera de vídeo e obtenha imagens durante o período experimental apropriado.
Para analisar as imagens de forma semi-automatizada, importe as imagens para Fiji e clique em Plugins, Macros, Interactive Interpreter. Copie e cole o laço roxo adaptado. Mantenha as frases roxas e adicione as frases verdes de interesse conforme necessário.
Em seguida, para medir a área de cada esferoide, clique em Analisar e Medir. Para medir a hipóxia em áreas distintas da estrutura esférica, a coloração de anidraidese carbônica IX pode ser usada para determinar a atividade hipóxica. Nesta análise representativa, foram observadas mais células positivas de anidrase carbônica IX no centro esferoide.
Células hipóxicas localizadas no núcleo esferoide tendem a ser mais glicólticas do que as células ao redor do núcleo. Mitocôndrias podem ser imagens por microscopia eletrônica para análise posterior. O diâmetro esferoide está diretamente correlacionado com a densidade das células que compõem a estrutura celular 3D e as macros fiji podem ser usadas para quantificar a proliferação, invasão ou migração das células dentro de cada esferoide ou migração das células dentro de cada esferoide.
Aumentos no núcleo esferoide refletem a estimulação da proliferação celular. Após a inibição do complexo I da cadeia respiratória mitocondrial, a grande maioria da produção de ATP nas mitocôndrias está comprometida reduzindo a proliferação em 20% após 72 horas. O tratamento do cloreto de hidrogênio aumenta a invasão do tipo colágeno I durante um período de 24 horas, mas reduz a área migratória dos esferoides 1,5 vezes em comparação com o controle de esferoides não tratados.
Conforme avaliado por imagens ao vivo, os esferoides demonstram alta dinâmica interna e se movem rapidamente. O tamanho dos esferoides deve ser relativamente uniforme e devem ser tomados cuidados para manipular os esferoides para o centro dos poços para obter os melhores resultados de imagem. Este método também pode ser usado para investigar a proliferação de células tumorais, migração e morte, bem como a expressão de matriz extracelular, receptores celulares ou proteínas intracelulares de interesse.
Os esferoides também podem ser encapsulados e o efeito do aumento da tensão da superfície celular pode ser investigado após a remoção das cápsulas.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um ensaio de invasão baseado em esferoides tridimensionais de glioblastoma, projetado para células semelhantes a células-tronco de glioblastoma. O ensaio permite investigar a invasão tumoral em tecido cerebral saudável, fornecendo um modelo mais preciso das condições in vivo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Oncologia
- Biologia Celular
Antecedentes
- Culturas celulares tradicionais em 2D não imitam efetivamente o crescimento tumoral in vivo.
- Modelos de cultura 3D podem replicar a arquitetura multicelular e a heterogeneidade tumoral.
- Esses modelos permitem uma melhor avaliação dos efeitos de fármacos sobre tumores.
- Glioblastoma é um tumor cerebral altamente agressivo com mau prognóstico.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um ensaio de fácil utilização para estudar a invasão de glioblastoma.
- Fornecer um método para quantificar invasão, migração e proliferação.
- Aprimorar a compreensão do comportamento do glioblastoma em um ambiente fisiologicamente mais relevante.
Métodos Utilizados
- Utilização de culturas de esferoides tridimensionais para células de glioblastoma.
- Implementação de uma macro do Fiji para quantificação.
- Manuseio cuidadoso de géis e células para manter a integridade do ensaio.
- Remoção de resíduos e tratamento das células com enzimas de dissociação para formação de esferoides.
Resultados Principais
- O ensaio mimetizou com sucesso a invasão de glioblastoma em tecido cerebral saudável.
- Os métodos de quantificação forneceram dados confiáveis sobre o comportamento celular.
- Os cultivos tridimensionais demonstraram uma avaliação aprimorada da resposta a fármacos.
- Esferoides de tamanho uniforme foram gerados para resultados consistentes.
Conclusões
- O ensaio desenvolvido é uma ferramenta valiosa para a pesquisa de glioblastoma.
- Oferece insights sobre os mecanismos de invasão tumoral.
- A metodologia pode ser adaptada para diversas condições experimentais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este modelo de esferoide de glioblastoma tridimensional preenche uma lacuna crítica na oncologia pré-clínica ao fornecer um sistema fisiologicamente relevante para estudar a invasão tumoral e a resposta a medicamentos. Ele permite uma avaliação mais preditiva de candidatos terapêuticos em comparação com culturas tradicionais em 2D, apoiando a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas em pipelines de neuro-oncologia. O ensaio melhora a continuidade translacional ao integrar descobertas in vitro com interações semelhantes ao microambiente tumoral in vivo.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação dos mecanismos de invasão tumoral e a clarificação de vias em uma arquitetura multicelular tridimensional.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio de leituras quantificáveis da invasão e migração de esferoides.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança nas hipóteses de alvo ao modelar os efeitos de fármacos em um sistema relevante para a doença que recapitula a heterogeneidade tumoral.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece esferoides padronizados e uniformemente dimensionados para triagem reprodutível de compostos e avaliação de resposta à dose.
- Valor Operacional: Permite fluxos de trabalho compatíveis com alto rendimento utilizando placas de 96 poços e análise de imagem semi-automatizada por meio de macros do Fiji.
- Prontidão do Ensaio: Gera saídas quantitativas sobre proliferação, invasão e migração que apoiam a validação do ensaio e a reprodutibilidade entre laboratórios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Modela a formação do núcleo hipóxico e gradientes metabólicos observados em tumores de pacientes, aumentando a relevância dos biomarcadores.
- Valor Operacional: Facilita estudos de cocultivo estromal ou modulação da MEC para investigar interações entre tumor e estroma em um ambiente controlado.
- Continuidade Tradutiva: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco, vinculando dados de invasão in vitro a perfis de eficácia e segurança pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a otimização do composto líder, fornecendo um sistema relevante para a doença para triagem mecanicista e avaliação fenotípica antes de estudos in vivo.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre fatores de invasão e interações estromais em um modelo tridimensional de glioblastoma.
- Triagem: Permite avaliação padronizada e reprodutível dos efeitos de compostos sobre o tamanho de esferoides, área de invasão e capacidade de migração.
- Análise: Fornece métricas quantificáveis por meio de análise de imagem (por exemplo, diâmetro do esferoide, núcleo hipóxico, frente de invasão) para comparar condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se ao trabalho pré-clínico ao modelar características do microambiente tumoral, como hipóxia e remodelamento da MEC.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para glioblastoma e potencialmente outros tipos de tumores do SNC, reduzindo o desenvolvimento redundante de modelos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas vias de invasão tumoral.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e escalabilidade por meio de protocolos padronizados de formação de esferoides e de imagem.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de avançar/não avançar ao fornecer dados mais precoces e biologicamente preditivos sobre a eficácia do composto.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização baseada em risco de candidatos com base em fenótipos de invasão e proliferação em um modelo de doença tridimensional.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em cultura celular tridimensional, técnica estéril e microscopia confocal para manipulação e imagem consistentes de esferoides.
- Depende do acesso à matriz de colágeno, Matrigel, enzimas de dissociação e metilcelulose 2% para a formação de esferoides e ensaios de invasão.
- Necessita de fluxos de trabalho padronizados de análise de imagens (por exemplo, macros do Fiji) para garantir consistência quantitativa entre diferentes usuários e locais.
- Exige controle rigoroso de temperatura e tempo durante a preparação do gel e a incorporação dos esferoides para manter a integridade do ensaio.
- É limitado pela necessidade de tamanho uniforme dos esferoides e pela evitação do contato com o fundo do poço, para assegurar medidas confiáveis de invasão e migração.
