Name: Um modelo esferóide 3D para glioblastoma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Aprenda a desenvolver um ensaio de invasão baseado em esferoides 3D para células-tronco de glioblastoma. Este método permite quantificar invasão, migração e proliferação tumoral em um ambiente fisiologicamente relevante.

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Este trabalho foi apoiado pela Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon é bolsista do Hospital Universitário de Toulouse (CHU Toulouse).

O consentimento por escrito informado foi obtido de todos os pacientes (do Hospital Haukeland, Bergen, Noruega, de acordo com as regulamentações do comitê de ética local). Nosso protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana da nossa instituição.
1. Geração de esferóides tumorais de tamanho uniforme
NOTA: As células-tronco são cultivadas em meio neurobasal complementado com suplemento B27, heparina, FGF-2, penicilina e estreptomicina, conforme descrito nos artigos anteriores12. Essas células formam espontaneamente esferóides na cultura.
<ol><li>Lave as células tumorais com soro torário tamponado de 5 mL (PBS) e incubar as células com enzima de dissociação de 0,5-1 mL (ver Tabela de Materiais) por 5 minutos a 37 °C.</li>
	<li>Lave com PBS de 4-4,5 mL e adicione 10 mL do meio de crescimento completo (meio neurobasal completo, cNBM).</li>
	<li>Conte as células usando uma técnica de contagem automática com trypan azul e um slide de câmara de contagem de células.</li>
	<li>Para gerar 100 esferóides com 104 células por esferoide (de acordo com o tamanho preferencial), misture 106 células em 8 mL de NBM com 2 mL de 2% de metilcelulose.</li>
	<li>Transfira a suspensão para um recipiente de sistema estéril e dispense 100 μL/poço com uma pipeta multicanal em uma placa inferior redonda de 96.</li>
	<li>Incubar a placa a 37 °C, 5% CO2 e 95% de umidade. Esferóides de tamanho igual formarão e poderão ser usados após 3-4 dias.</li>
</ol>2. Experimentos tridimensionais
<ol><li>Proliferação<ol>
<li>Preparação<ol>
<li>Suspender inibidores (por exemplo, rotenona como na Figura 4A) e produtos químicos em 100 μL de médio e adicionar aos 100 μL de meio em cada poço (ou seja, um esferoide por poço).</li>
			<li>Incubar a placa a 37 °C, 5% CO2e 95% de umidade.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aquisição e análise de imagens<ol>
<li>Tire fotos com um microscópio de vídeo em brightfield para criar uma série de condições em T0 e os seguintes tempos esperados.</li>
			<li>Use Fiji para analisar imagens manualmente ou de forma semiautomatizada. Para fazê-lo manualmente, desenhe um círculo em torno do núcleo esferóide com a ferramenta de seleção à mão livre e meça a área de cada esferóide. Para analisar as imagens de forma semiautomatizada, use a macro mostrada no Documento Complementar 1 apenas com área //Núcleo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Invasão<ol>
<li>Preparação<ol>
<li>Prepare a matriz de colágeno em um tubo no gelo com colágeno tipo I a 1 mg/mL de concentração final, 1x PBS, 0,023xVde colágeno,1 M de hidróxido de sódio e H2O. Estéreo Incubar a solução no gelo por 30 min.</li>
			<li>Coletar esferóides da placa do poço de fundo redondo em tubos de 500 μL e lavar 2x com 200 μL 1x PBS.</li>
			<li>Pipa os esferóides cuidadosamente em 100 μL da matriz de colágeno e inserir no centro de um poço em 96 placas normais de poço.</li>
			<li>Incubar o gel de colágeno por 30 min a 37 °C e, em seguida, adicionar cNBM em cima do gel. Inibidores ou ativadores (por exemplo, cloreto de hidrogênio como mostrado na Figura 4B, 4C) podem ser adicionados ao meio nesta etapa.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aquisição e análise de imagens<ol>
<li>Tire fotos sequencialmente com um microscópio de vídeo no modo brightfield 24 h após a inclusão de colágeno.</li>
			<li>Use Fiji para analisar imagens manualmente ou de forma semiautomatizada. Para fazê-lo manualmente, desenhe ao redor do núcleo e da área total do esferóide com a ferramenta de seleção à mão livre e meça a área invasiva de cada esferóide subtraia a área total com a área central. Para analisar as imagens de forma semiautomatizada, utilize a macro conforme indicado no Documento Complementar 1 para determinar a área invasiva.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Migração<ol>
<li>Preparação<ol>
<li>Cubra uma placa de 6 poços com Matrigel (0,2 mg/mL) em NBM por 30 min a 37 °C, depois retire o Matrigel e adicione 2 mL de cNBM.</li>
			<li>Transfira os esferóides para 50 μL de cNBM da placa do poço de fundo redondo para a placa de 6 poços.</li>
			<li>Incubar a placa a 37 °C e esperar 30 min para que os esferóides aderem.</li>
			<li>Após 24 h de incubação, manche com 10 ng/mL de Hoechst e incubação de 30 min a 37 °C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aquisição e análise de imagens<ol>
<li>Obter imagens usando um microscópio de vídeo em brightfield. Um laser de 405 nm é usado para visualização da coloração de Hoechst.</li>
			<li>Use o software Fiji para analisar imagens e executar a macro conforme indicado no Documento Complementar 1. NOTA: Tocar na parte inferior do poço ou remover completamente o sobrenadante danifica os esferóides. Para o manuseio de gel tipo colágeno I, mantenha o gel no gelo para evitar a polimerização do colágeno, não adicione um componente ácido porque a mudança no pH afetará a compactação do gel, e as células de pipeta rapidamente no colágeno para evitar a morte celular e a degradação do gel.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Fiji Macro
NOTA: Fiji é um programa de análise de imagens desenvolvido em domínio público que permite o desenvolvimento de macros para acelerar a análise de imagens. A análise manual também é possível, mas este é um processo lento e pode introduzir vieses. As imagens podem ser importadas por arrastar e soltar no software e quantificadas com o plugin ROI Manager Tools. O procedimento utilizado neste estudo é descrito abaixo:
<ol><li>Abra a janela de macro: Plugins | Macros | Intérprete Interativo.</li>
	<li>Copie e cole o seguinte laço roxo adaptado. Mantenha as frases roxas e adicione as frases verdes de interesse (Documento Complementar 1).</li>
	<li>Para analisar toda a série, ajuste os parâmetros em vermelho para uma quantificação específica e execute a macro usando Macros | Executar macro ou pressionar Ctrl+R.</li>
	<li>Verifique e, se necessário, adapte manualmente a região de interesse (ROI).</li>
</ol>4. Microscopia eletrônica de esferóides
NOTA: A maioria das etapas a seguir deve ser feita em uma coifa química.
<ol><li>Etapa de fixação<ol>
<li>Recolhado o esferóide com uma ponta de pipeta cortada, coloque-o em um tubo de 1,5 mL e lave 1x com tampão de fosfato de 0,1 M (PB).</li>
		<li>Fixar o esferóide durante a noite a 4 °C em 2% de glutaraldeído/2% de paraformaldeído (PFA) em 0,1 M PB.</li>
		<li>Substitua a solução de fixação por uma solução de 1% de PFA em 0,1 M PB seguida de preparação da amostra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação da amostra<ol>
<li>Transfira os esferóides para um coador e coloque-os em um copo de vidro, a fim de evitar danos esferóides.</li>
		<li>Lave cuidadosamente 3x com 0,1 M PB.</li>
		<li>Incubar com ósmio por 2 h no escuro. Diluir o ósmio para 4% em 1% de tampão PB de 0,1 M.</li>
		<li>Lave cuidadosamente 3x com 0,1 M PB.<ol>
<li>Desidratar da seguinte forma: mergulhe em 50% de etanol por 10 min, 70% de etanol por 10 min, 2x 90% de etanol por 15 min, 2x 100% de etanol por 20 min e 2x de acetona por 30 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Incubar as amostras em uma mistura de acetona/resina 50/50 por 2 h. Durante esta etapa, prepare a resina EPON (Embed-812: 11,25 g; DDSA: 9 g; NMA: 4,5 g).</li>
		<li>Descarte a mistura acetona/resina, substitua por resina recém-preparada e incuba durante a noite.</li>
		<li>Substitua a resina por uma nova e incuba entre 2-6 h.</li>
		<li>Adicione os esferóides na resina em um molde a 60 °C por 48-72 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Pelissier, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+dysfunction+in+mechanotransduction+impairs+differentiation+of+human+mammary+epithelial+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors.</a> Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).</li>
<li>Ishiguro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+spheroids%3A+Relevance+to+cancer+stem+cells+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications.</a> Cancer Science. 108, 283-289 (2017).</li>
<li>Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+environment+interactions+in+tumor+microregions%3A+the+multicell+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model.</a> Science. 240, 177-184 (1988).</li>
<li>Desoize, B., Jardillier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+resistance%3A+a+paradigm+for+clinical+resistance%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance?</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).</li>
<li>Corbet, C., Feron, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+acidosis%3A+from+the+passenger+to+the+driver%27s+seat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour acidosis: from the passenger to the driver's seat.</a> Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).</li>
<li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cancer+Cell+Spheroid+Assay+to+Assess+Invasion+in+a+3D+Setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53409(2015).</li>
<li>Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+Spheroid+Model+as+a+More+Physiological+System+for+Cancer-Associated+Fibroblasts+Differentiation+and+Invasion+In+Vitro+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e60122(2019).</li>
<li>Boye, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CXCR3%2FLRP1+cross-talk+in+the+invasion+of+primary+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors.</a> Nature Communications. 8, 1571(2017).</li>
<li>Dejeans, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+control+of+glioma+cells+adhesion+and+migration+through+IRE1alpha-mediated+cleavage+of+SPARC+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA.</a> Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).</li>
<li>Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+SPARC+expression+promotes+U87+glioblastoma+invasion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).</li>
<li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+complex+role+of+thrombospondin-1+in+glioblastoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development.</a> Nature Communications. 10, 1146(2019).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tube+travel%3A+the+role+of+proteases+in+individual+and+collective+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion.</a> Cancer Research. 68, 7247-7249 (2008).</li>
<li>Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP+proteolytic+activity+regulates+cancer+invasiveness+by+modulating+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins.</a> Scientific Reports. 7, 14219(2017).</li>
<li>Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+migration+and+invasion+uncoupled%3A+increased+migration+is+not+an+inexorable+consequence+of+epithelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition.</a> Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).</li>
<li>de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Experimenter%27s+Guide+to+Glioblastoma+Invasion+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">An Experimenter's Guide to Glioblastoma Invasion Pathways.</a> Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).</li>
<li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+invasive+proteome+of+glioblastoma+revealed+by+laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology+Advances%22%5BJournal%5D)">The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection.</a> Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029(2019).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os ensaios esferóides tumorais são bem adaptados para estudar características tumorais, incluindo proliferação, invasão e migração, bem como morte celular e resposta a medicamentos. As células cancerígenas invadem a matriz 3D formando um microtumor invasivo, como visto na Figura 4B,C. Durante o processo invasivo, as matrizes de metaloproteinases matriciais (MMP) digerem matrizes ao redor das células tumorais13, e os inibidores de MMP (por exemplo, GM6...

Na maioria dos estudos usando linhas celulares primárias ou comercialmente disponíveis, os ensaios são realizados em células cultivadas em superfícies plásticas como culturas de monocamada. Gerenciar a cultura celular em 2D representa desvantagens, pois não imita um ambiente celular in vivo 3D. Em culturas 2D, toda a superfície celular está diretamente em contato com o meio, alterando o crescimento celular e modificando a disponibilidade de medicamentos. Além disso, a superfície plástica não fisiológica desencadeia a diferenciação celular1. Modelos de cultura tridimensional foram desenvolvidos para superar essas dificuldades. Eles têm a vantagem de imitar a arquitetura multicelular e a heterogeneidade dos tumores2, e, portanto, poderiam ser considerados um modelo mais relevante para tumores sólidos3. A morfologia complexa dos esferóides contribui para avaliar melhor a penetração e resistência da droga4. A heterogeneidade tumoral no esferóide impacta a difusão de oxigênio e nutrientes, e a resposta aos agentes farmacológicos (Figura 1A). A difusão de oxigênio é alterada quando o tamanho esferoide atinge 300 μm, induzindo um ambiente hipóxico no centro do esferóide(Figura 1A,C). Os metabólitos também são menos penetrantes através das camadas celulares e as reações metabólicas compensatórias ocorrem5. Quando o diâmetro do esferóide aumenta, núcleos necrosados podem ser observados, imitando ainda mais características encontradas em muitos cânceres sólidos, incluindo o agressivo glioblastoma de câncer cerebral (GBM)6.
Vários ensaios de invasão 2D ou 3D para glioblastoma foram relatados na literatura7,8. Ensaios bidimensionais são principalmente para estudar a invasão em um plano horizontal em uma fina camada de matriz ou em um ensaio de câmara de Boyden9. Ensaios tridimensionais foram descritos com culturas esferóides 3D usando linhas celulares glioblastoma clássicas10. Variantes mais complexas são representadas pela invasão de organóides cerebrais por esferóides tumorais em culturas de confronto11. No entanto, ainda é importante desenvolver um ensaio fácil de usar e reprodutível disponível para qualquer laboratório. Desenvolvemos um protocolo para gerar células-tronco de glioblastoma a partir de amostras de pacientes. A quantificação desses ensaios é facilmente gerenciável e requer apenas software on-line de acesso aberto. Resumidamente, os pedaços do tumor são cortados em pequenos pedaços e digeridos enzimticamente. As células únicas derivadas da digestão são cultivadas em meio neurobasal. Após 4-7 dias, estruturas esferóides formam-se espontaneamente. Após a implantação intracraniana em modelos de camundongos, formam tumores exibindo um núcleo necrosado cercado por células pseudo-palisading12. Isso se assemelha muito às características encontradas em pacientes GBM.
Neste artigo, descrevemos nosso protocolo de produção de esferóides a partir de um determinado número de células para garantir a reprodutibilidade. Duas matrizes complementares podem ser utilizadas para este fim: Matrigel e colágeno tipo I. Matrigel é enriquecido em fatores de crescimento e imita a membrana basal mamífera necessária para o apego celular e migração. Por outro lado, o colágeno tipo I, um elemento estrutural do estroma, é a matriz extracelular fibriária mais comum e é usado em ensaios de invasão celular. Aqui, ilustramos nosso modelo esferóide GBM realizando ensaios de migração e proliferação. A análise foi feita não apenas em pontos de tempo fixo, mas também por monitoramento da expansão esferóide e movimento celular por imagem ao vivo. Além disso, a microscopia eletrônica foi feita para visualizar detalhes morfológicos.

<table><tbody><tr><td>Placa de fundo redondo de 96 poços</td><td>Falcon</td><td>08-772-212</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td>Armazenado a 4 &deg; C, enzima de dissociação de esfera</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587</td><td>Armazenado a -20 &deg; C, descongele antes de usar</td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Básico de Fibroblastos</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Armazenado a -20 &deg; C, descongele antes</td></tr><tr><td>de usar Lâminas de Câmara de Contagem de Células Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 10X</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53-500</td><td>Armazenado a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Fiji software</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Usado para analisar imagens</td></tr><tr><td>Frasco 75 cm2</td><td>Falcon</td><td>10497302</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Armazenado a -20 &deg; C, diluído a uma concentração final de 0,2 mg/mL em frio NBM</td></tr><tr><td>Metilcelulose</td><td>Sigma</td><td>M0512</td><td>Diluído em NBM para uma concentração final de 2%</td></tr><tr><td>NBM</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>Armazenado a 4 &graus; C</td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Armazenado a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Penicilina - Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Armazenado a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Trypan azul 0,4%</td> <td>ThermoFisher</td><td>T10282</td><td>Usado para contagem de células</td></tr><tr><td>Tipo I colágeno</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>armazenado a 4 &deg; O</td></tr></tbody></table>

um modelo esferóide 3d para glioblastoma

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Culturas celulares bidimensionais (2D) não imitam o crescimento do tumor in vivo de forma satisfatória. Assim, foram desenvolvidos modelos esferóides de cultura tridimensional (3D). Esses modelos podem ser particularmente importantes no campo da neuro-oncologia. De fato, tumores cerebrais têm a tendência de invadir o ambiente cerebral saudável. Descrevemos aqui em um ensaio 3D baseado em glioblastoma baseado em esferóide sheroide que desenvolvemos para estudar a invasão de tumores. Fornecemos todos os detalhes técnicos e ferramentas analíticas para realizar este ensaio com sucesso.

Os esferóides foram preparados conforme descrito na seção de protocolos e observações foram feitas sobre migração, invasão, proliferação e microscopia. Para medir a hipóxia em áreas distintas da estrutura esférica, utilizou-se a coloração da anidraIX carboxica para determinar a atividade hipóxica(Figura 1A-C). Mais células CAIX positivas foram observadas no centro esferóide (Figura 1A-C). Células...

Aqui, descrevemos um ensaio de invasão fácil de usar para glioblastoma. Este ensaio é adequado para células-tronco de glioblastoma. Uma macro Fiji para fácil quantificação de invasão, migração e proliferação também é descrita.

Um modelo esferóide 3D para glioblastoma

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

Culturas celulares bidimensionais não imitam adequadamente o crescimento do tumor in vivo. Para melhorar, procedimentos 3D foram desenvolvidos usando eferóides. Nosso ensaio glioblastoma spheroid 3D é particularmente adequado para investigar a invasão de tumores cerebrais no ambiente saudável do tumor cerebral.Modelos de cultura tridimensional podem ser usados para recapitular uma arquitetura multicelular, heterogeneidade e estado metabólico de tumores permitindo uma avaliação mais rigorosa dos efeitos medicamentosos. Certifique-se de não tocar na parte inferior do poço ou remover completamente o supernasce, manter o gel no gelo e adicionar as células ao gel rapidamente. Para gerar esferoides tumorais de tamanho uniforme, primeiro lave a cultura celular tumoral de interesse com cinco mililitros de PBS e trate as células com 0,5 a um mililitro de enzima dissociação.Após cinco minutos a 37 graus Celsius, pare a reação com quatro a 4,5 mililitros de PBS e transfira as células separadas para um tubo cônico de 15 mililitros contendo 10 mililitros de meio de crescimento completo. Após a contagem, resuspenque as células em uma vez 10 a 10 a sexta células por oito mililitros de meio de cre

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo demonstra como as gliomasferas, derivadas de tumores cerebrais, são separadas em células únicas e encapsuladas em um hidrogel à base de ácido hialurônico. Esse processo promove interações célula-célula, formando um modelo de glioblastoma tridimensional estruturado.

Um hidrogel à base de ácido hialurônico para cultura tridimensional de células de glioblastoma

Fonte: Guyon, J., et al. Um modelo esferóide 3D para glioblastoma. J. Vis. Exp. (2020)O vídeo demonstra a geração de um modelo esferóide tridimensional de invasão de células tumorais. Os esferóides são formados a partir de células tumorais cerebrais humanas e incorporados em uma matriz de colágeno. As células tumorais na periferia esferóide adotam um fenótipo invasivo, secretando proteases para degradar o colágeno e avançando para invadir a matriz circundante.

Geração de um modelo esferóide tridimensional de invasão de células tumorais

Protocolo para propagação de amostras cirúrgicas de glioma de alto grau dissociadas em meio neuroesfera livre de soro para selecionar para células com fenótipo de células-tronco cancerosas. Para espécimes que não crescem como neurosferas, um protocolo alternativo é sugerido. Uma técnica de incorporação de parafina para manter a arquitetura da neurosfera 3D para imunocytoquímica é descrita.

Otimização da cultura celular glioma de alto grau a partir de espécimes cirúrgicos para uso em modelos animais clinicamente relevantes e imunoquímica 3D

A invasão dos tecidos normais circundantes é uma característica definidora dos tumores malignos. Fornecemos aqui um ensaio simples e semi-automatizado de microplacas de invasão em uma biomatriz 3D natural que foi exemplificada com vários modelos de cânceres humanos avançados.

Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay

Aqui, descrevemos um modelo ortotópico pré-clínico em camundongos para GBM, estabelecido por injeção intracraniana de células derivadas de tumores modelo de camundongos geneticamente modificados. Este modelo exibe as características da doença do GBM humano. Para estudos translacionais, o tumor cerebral de camundongo é rastreado por ressonância magnética in vivo e histopatologia.

Modelos Ortotópicos Translacionais de Glioblastoma Multiforme

Embriões de pintinhos são usados para estudar tumores cerebrais de glioblastoma humano (GBM) em co-culturas de ovo e de fatias cerebrais ex vivo . O comportamento das células GBM pode ser registrado por microscopia de lapso de tempo em co-culturas ex vivo , e ambas as preparações podem ser analisadas no desfecho experimental por análise confocal 3D detalhada.

Uso do Cérebro de Embriões de Pintinhos como Modelo para Análises In Vivo e Ex Vivo do Comportamento Celular de Glioblastoma Humano

Aqui, apresentamos um protocolo que permite a fabricação rápida, robusta e barata de esferoides tumorais seguida de encapsulamento em hidrogel. É amplamente aplicável, pois não requer equipamentos especializados. Seria particularmente útil para explorar interações matriz-esferóide e construir modelos in vitro de fisiologia ou patologia tecidual.

Fabricação e encapsulamento de esferoides tumorais em hidrogéis de polietilenoglicol para estudo de interações esferóide-matriz

Apresentamos um método para replicar o microambiente tumoral de glioma na frente invasiva que incorpora fluxo de fluido intersticial. Este modelo é um hidrogel de hialuronano-colágeno I em um inserto de cultura de tecidos onde uma cabeça de pressão de fluido pode ser aplicada. A invasão pode ser quantificada e as células podem ser isoladas ou lisadas.

Um modelo fotopolimerizável de ácido hialurônico-colágeno do microambiente de glioma invasivo com fluxo intersticial

Aqui, estabelecemos uma plataforma de perfil metabólico integrando esferóides de glioma tridimensionais (3D) e normalização baseada em imagem por meio de análise de fluxo extracelular. Essa abordagem permite uma avaliação mais precisa das respostas metabólicas do tumor aos tratamentos medicamentosos e fornece informações sobre os possíveis mecanismos de resistência.

Avanços no perfil metabólico de esferoides tridimensionais de tumores cerebrais para triagem de drogas

Apresentamos um modelo de migração de glioblastoma 3D usando gliomasferas magnéticas derivadas de pacientes geradas a partir de tumores recém-diagnosticados e recorrentes. Esta plataforma permite visualização da dinâmica de migração específica do paciente e avaliação da eficácia terapêutica. O ensaio pode ser multiplexado após a migração para avaliar a localização e os padrões de expressão da proteína.

Ensaio de Migração de Glioblastoma 3D Reproduzível com Localização Magnética de Esferoides Mediadas por Nanopartículas sob Condições Hipóxicas

Aprenda a desenvolver um ensaio de invasão baseado em esferoides 3D para células-tronco de glioblastoma. Este método permite quantificar invasão, migração e proliferação tumoral em um ambiente fisiologicamente relevante.

Um modelo esferóide 3D para glioblastoma

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