Triagem para Fitoestrogênios usando um receptor de estrogênio baseado em células β Reporter Assay

Usamos este ensaio para avaliar se os alimentos vegetais contêm fitoesteróides, que podem afetar os processos fisiológicos em animais, bem como o comportamento e o sucesso reprodutivo. Este ensaio fornece um método simples e confiável para determinar se as plantas produzem compostos estrogênicos com atividade biológica. Este método foi desenvolvido inicialmente para rastrear medicamentos com atividade de xenoestrogênio para aplicações na medicina.

Por exemplo, inibir a proliferação celular. Estamos usando-o para fornecer informações sobre a ecologia e evolução dos primatas. É importante ter prática de trabalho com técnica asséptica em um ambiente limpo antes de tentar este ensaio, pois é muito sensível à contaminação.

Comece liofilizando os itens vegetais frescos com o liofilizador e, em seguida, triture-os finamente usando um moinho com uma tela de malha de 0,85 milímetros. Armazene as amostras moídas em sacos no escuro até a extração. Para extrair quaisquer fitoesteróides potenciais nas plantas, adicione uma amostra seca a um frasco de tamanho apropriado e, em seguida, a metanol de qualidade HPLC.

Cubra a solução de metanol da planta com papel alumínio e coloque-a para girar a 100 RPM por três dias em um agitador orbital. Após três dias, use papel de filtro para decantar o sobrenadante e colocá-lo em um sistema de filtragem por gotejamento. Seque o extrato vegetal com um evaporador rotativo até engrossar, mas despeje em um balão redondo de fundo de 300 mililitros.

Deitar a amostra num balão de 50 mililitros e lavar o balão grande com uma pequena quantidade de metanol, depois continuar a secar a amostra no balão pequeno até que o metanol tenha evaporado completamente. Quando terminar, pesar o resíduo da amostra com uma balança analítica e registar a massa. Dissolva o extrato da planta em DMSO na concentração de 0,1 grama de extrato para dois mililitros de DMSO e vortex até homogeneizar.

O DMSO não é tóxico por si só, mas é um veículo que permite que outras substâncias atravessem as membranas. Como não sabemos se nossas plantas contêm produtos químicos tóxicos, todas são tratadas como se fossem perigosas. Não permita que a solução toque a pele, substitua as luvas se estiver contaminada e use sapatos grossos e fechados e jalecos.

Armazene a amostra a quatro graus Celsius em frascos de vidro âmbar até que esteja pronta para uso. Vortex as amostras e, em seguida, adicione quatro microlitros de cada amostra a 496 microlitros de meio de triagem composto para produzir uma solução de 0,8% de DMSO. Desinfete a superfície externa de um tubo de meio de recuperação de células pré-aquecido com 70% de etanol e transfira 10 mililitros do meio para um tubo de células repórter congeladas para descongelá-las.

Feche o tubo das células repórter e coloque-o em banho-maria a 37 graus Celsius por cinco a 10 minutos. Depois de recuperar as células do banho-maria, inverta suavemente o tubo várias vezes para quebrar os agregados de células e produzir uma suspensão homogênea, depois limpe a superfície do tubo com etanol a 70%. Use uma pipeta multicanal para dispensar 100 microlitros da suspensão da célula repórter em cada poço de uma placa de 96 poços e, em seguida, dispense 100 microlitros de amostras em triplicado nos poços apropriados.

Incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 22 a 24 horas. Pouco antes do final da incubação da placa, remova o substrato de detecção e o tampão de detecção da geladeira e coloque-os em uma área com pouca luz até que estejam equilibrados à temperatura ambiente e, em seguida, inverta suavemente cada tubo para misturar as soluções. Imediatamente antes da conclusão da incubação da placa, despeje todo o conteúdo do tampão de detecção no tubo do substrato de detecção para criar o reagente de detecção de luciferase.

Misture o tubo delicadamente para não produzir espuma. Descarte o conteúdo da placa de amostra em um recipiente de lixo inadequado e bata suavemente em uma toalha de papel absorvente limpa para remover as últimas gotículas dos poços. Adicione 100 microlitros do reagente de detecção de luciferase a cada poço e deixe a placa de ensaio descansar em temperatura ambiente por 15 minutos, depois quantifique a luminescência usando um luminômetro de leitura de placa de 96 poços.

22 extratos de frutas e vegetais comumente encontrados em dietas humanas foram rastreados quanto à presença de compostos estrogênicos. A atividade estrogênica é apresentada de maneira qualitativa ordinal de alta, média, baixa ou nenhuma atividade. A soja orgânica e não orgânica apresentou altos níveis de atividade, enquanto todos os outros itens de frutas e hortaliças não registraram atividade.

A comparação dos resultados da soja com a curva padrão também mostra que eles têm altos níveis de atividade estrogênica nessa concentração. O extrato de soja, uma fonte potente conhecida de isoflavonas, daidzeína e genisteína, foi usado para determinar a diluição produzindo um sinal de 50% ao máximo. Este extrato requer 422 vezes mais diluição para produzir metade do sinal do nosso protocolo de diluição padrão.

As amostras identificadas com atividade podem ser enviadas para análise por espectrometria de massa para identificar os produtos químicos ativos. Usando um método antagonista, também podemos determinar se o alimento vegetal contém produtos químicos que reduzem a ligação e a atividade dos estrogênios endógenos. Essa técnica nos permite aprofundar nossa compreensão de como os alimentos estrogênicos são prevalentes nas dietas dos primatas, bem como como o consumo de fitoestrogênios afeta a fisiologia e o comportamento quando o ensaio é combinado com análises de hormônios fecais e dados de campo.