Name: Triagem para Fitoestrogênios usando um receptor de estrogênio baseado em células β Reporter Assay (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Aprenda a triar fitoestrogênios em alimentos vegetais usando um ensaio reporter com receptor de estrogênio β. Este método simples e confiável ajuda pesquisadores a estudar impactos dietéticos em primatas.

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Os autores agradecem a Dale Leitman pelo treinamento inicial no uso de ensaios transitórios de transfecção para determinar a atividade estrogênica de alimentos vegetais primatas. Graças a Bradford Westrich e C. Eric Johnson por ajudar a montar equipamentos de laboratório e treinar alunos em métodos de extração. Finalmente, obrigado à Universidade de Indiana por financiar esta pesquisa.

1. Preparação de materiais vegetais
<ol><li>Congelar itens de plantas secas que foram coletados frescos usando um liofilizador.<ol>
<li>Para proteger as amostras da luz, cubra câmaras com papel alumínio durante o processo de secagem.</li>
		<li>Para garantir que as amostras estejam completamente secas, lyophilize até que as câmaras não sintam mais frio para tocar e os materiais vegetais não percam mais massa quando pesados.</li>
		<li>Armazene plantas secas em sacos de resíduos estéreis e baixos na ausência de luz até a moagem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Triture finamente amostras usando um moinho de moagem com tela de malha de 0,85 mm.<ol>
<li>Guarde as amostras de terra nos sacos na ausência de luz até a extração.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Extração de metabólitos secundários de plantas
<ol><li>Para extrair os metabólitos secundários da planta, utilize uma razão de 1 g de amostra seca para 10 mL de metanol de grau HPLC.<ol>
<li>Pesar a amostra sobre um equilíbrio analítico e adicioná-lo a um frasco de Erlenmeyer de tamanho adequado (125 – 250 mL). Em seguida, adicione o volume apropriado de metanol. Regisso da massa de amostra extraída.</li>
		<li>Cubra a solução de metanol vegetal com papel alumínio e, em seguida, gire a velocidade de 100 rpm à temperatura ambiente (RT) por 3 dias em um agitador orbital, permitindo que os compostos potencialmente estrogênicos se dissolvam no metanol.</li>
		<li>Decante o supernatante em um sistema de filtragem por gotejamento usando papel filtro (125 mm).</li>
		<li>Usando um evaporador rotativo, seque o extrato da planta até que a amostra esteja espessa, mas derramada, em um frasco de fundo redondo de 300 mL. Despeje a amostra em um frasco de fundo redondo de 50 mL, enxaguando o frasco grande com uma pequena quantidade de metanol. Continue a secar a amostra no pequeno frasco até que o metanol esteja completamente evaporado.</li>
		<li>Pesar o resíduo amostral usando um equilíbrio analítico. Registrar massa de resíduos.</li>
		<li>Dissolva o extrato vegetal em sulfóxido de dimetila (DMSO) a uma concentração de 0,1 g de extrato a 2 mL de DMSO. Vórtice até homogeneizar.</li>
		<li>Armazene a solução de extrato de planta-DMSO a 4 °C em frascos de vidro âmbar até o ensaio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>ATENÇÃO: As plantas podem produzir produtos químicos biologicamente ativos desconhecidos, e o DMSO é um veículo que pode transportá-los através de membranas celulares. Use equipamentos de proteção individual e cuidados adequados ao manusear essas amostras.
3. Receptor de estrogênio humano β ensaio de transfecção12
NOTA: É necessária técnica asséptica e uma capa de fluxo laminar para o primeiro dia do protocolo de ensaio.
<ol><li>Prepare diluições de 17β-Estradiol para a curva padrão.<ol>
<li>Transfira o Meio de Triagem Média e Composto de Recuperação celular (CSM) do armazenamento do congelador e descongele em um banho de água de 37 °C.</li>
		<li>Rotular tubos de microcentrifusagem Intermediários 1 e 2 (INT1, INT2) e 1-8.</li>
		<li>Preencha INT1 com 995 μL de CSM, INT2 com 615 μL de CSM, tubo 1 com 900 μL de CSM e tubos 2-8 com 600 μL de CSM. Reserve o tubo 8.</li>
		<li>Transfira 5 μL de 100 μM 17β-Estradiol Para INT1. Descarte a ponta. Vórtice.</li>
		<li>Antes de cada transferência, enxágue a pipeta 3 vezes e, em seguida, transfira 10 μL de INT1 para INT2. Descarte a ponta.</li>
		<li>Enxágüe a pipeta 3 vezes e, em seguida, transfira 100 μL de INT2 para o tubo 1. Descarte a ponta. Transfira 300 μL do tubo 1 para o tubo 2. Repita para os tubos 3 a 7. Descarte 300 μL do tubo 7 em recipiente de resíduos. O tubo 8 é um Zero e não recebe estradiol. As concentrações finais das normas emplacardas são: 400, 133,3, 44,44, 14.815, 4.938, 1.646, 0,5487 e 0 pM estradiol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare compostos amostrais.<ol>
<li>Amostras de vórtice.</li>
		<li>Pegue 4 μL de cada amostra de planta em DMSO e adicione a 496 μL de CSM para produzir uma solução DMSO de 0,8%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Descongele rapidamente células repórteres.<ol>
<li>Recupere o tubo do meio de recuperação celular do banho de água de 37 °C. Desinfete a superfície externa usando 70% de etanol.</li>
		<li>Recuperar células repórteres a partir de -80 °C de armazenamento e descongelar transferindo 10 mL do CRM pré-aquecido para o tubo de células congeladas.</li>
		<li>Feche o tubo de Células Repórteres e transfira para um banho de água de 37°C por 5-10 min.</li>
		<li>Recupere o tubo de suspensão celular repórter do banho de água. Inverter o tubo das células várias vezes suavemente para quebrar agregados de células e produzir uma suspensão homogênea. Limpe a superfície do tubo com 70% de etanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Revestimento de ensaio<ol>
<li>Dispense 100 μL da Suspensão da Célula repórter em cada poço usando uma pipeta multicanal.</li>
		<li>Dispense 100 μL de amostras em triplicado em poços de ensaio apropriados.</li>
		<li>Transfira a placa para uma incubadora de 37 °C, umidificada de 5% de CO2 por 22-24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Descongele substrato de detecção e tampão de detecção em uma geladeira escura durante a noite para se preparar para o dia 2.</li>
	<li>Pouco antes do fim da incubação da placa, remova o Substrato de Detecção e o Tampão de Detecção da geladeira e coloque em área de pouca luz até que seja equilibrado para RT. Uma vez no RT, inverta cada tubo suavemente várias vezes para misturar completamente as soluções.<ol>
<li>Imediatamente antes da incubação estar concluída, despeje todo o conteúdo do Buffer de Detecção no tubo do Substrato de Detecção para criar reagente de detecção de Luciferase. Misture suavemente para não produzir espuma.</li>
		<li>Uma vez que a incubação esteja completa, inverta a placa para descartar o conteúdo em um recipiente de resíduos apropriado. Bata suavemente a placa em uma toalha de papel absorvente limpa para remover as últimas gotículas dos poços.</li>
		<li>Adicione 100 μL do Reagente de Detecção de Luciferase a cada poço. Deixe a placa de ensaio descansar em RT por 15 minutos. Não agite o prato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantifique a luminescência usando um luminômetro de leitura de placas de 96 poços.</li>
</ol>

<ol><li>Wasserman, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+plant+consumption+predicts+red+colobus+monkey+%28Procolobus+rufomitratus%29+hormonal+state+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior.</a> Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).</li>
<li>Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+phytoestrogens+in+primate+ecology+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Primatology%22%5BJournal%5D)">The roles of phytoestrogens in primate ecology and evolution.</a> International Journal of Primatology. 34 (5), 861-878 (2013).</li>
<li>DeGabriel, J. L., Moore, B. D., Foley, W. J., Johnson, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+plant+defensive+chemistry+on+nutrient+availability+predict+reproductive+success+in+a+mammal%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology%22%5BJournal%5D)">The effects of plant defensive chemistry on nutrient availability predict reproductive success in a mammal.</a> Ecology. 90 (3), 711-719 (2009).</li>
<li>Wasserman, M. D., Steiniche, T., Després-Einspenner, M. -L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWasserman%2C+MD+%22Primate+Diet+%26+Nutrition%22">Primate Diet & Nutrition</a>. Lambert, J. E., Rothman, J. M. , University of Chicago Press. (2020).</li>
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<li>Shen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+the+influences+of+diosgenin+on+aging+ovarian+reserve+and+function+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">Observation of the influences of diosgenin on aging ovarian reserve and function in a mouse model.</a> European Journal of Medical Research. 22 (1), 42(2017).</li>
<li>Boué, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+estrogenic+effects+of+legume+extracts+containing+phytoestrogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (8), 2193-2199 (2003).</li>
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<li>Lutz, I., Kloas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphibians+as+a+model+to+study+endocrine+disruptors%3A+I.+Environmental+pollution+and+estrogen+receptor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+The+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Amphibians as a model to study endocrine disruptors: I. Environmental pollution and estrogen receptor binding.</a> Science of The Total Environment. 225 (1), 49-57 (1999).</li>
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<li>Jeng, Y. -J., Kochukov, M. Y., Watson, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+estrogen+receptor-alpha-mediated+nongenomic+actions+of+phytoestrogens+in+GH3%2FB6%2FF10+pituitary+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Signaling%22%5BJournal%5D)">Membrane estrogen receptor-alpha-mediated nongenomic actions of phytoestrogens in GH3/B6/F10 pituitary tumor cells.</a> Journal of Molecular Signaling. 4, 2-2 (2009).</li>
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<li>Kuiper, G. G. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Estrogenic+Chemicals+and+Phytoestrogens+with+Estrogen+Receptor+%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor β.</a> Endocrinology. 139 (10), 4252-4263 (1998).</li>
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<li>Jefferson, W. N., Patisaul, H. B., Williams, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+consequences+of+developmental+phytoestrogen+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Reproductive consequences of developmental phytoestrogen exposure.</a> Reproduction. 143 (3), Cambridge, England. 247-260 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O ensaio de repórter ERβ desenvolvido para triagem individual de agentes farmacêuticos também é adequado para triagem de alimentos vegetais para fitoestrogênios biologicamente ativos através do ERβ. Considerações importantes no protocolo incluem tratar as amostras da planta com cuidado: material vegetal fresco precisa ser seco rapidamente para evitar moldagem ou outra degradação biológica, e precisa ser mantido longe da luz para evitar a fotolise dos compostos18. O protocolo de ensaio<sup class="x...

As plantas são uma fonte necessária de alimento para muitos animais, fornecendo calorias e nutrientes críticos à sobrevivência, reprodução, crescimento, desenvolvimento e comportamento1. As plantas produzem milhares de produtos químicos, muitos como adaptações para seu próprio crescimento, manutenção e reprodução estomáticas. Outros compostos, considerados metabólitos secundários vegetais (PSMs), têm funções menos claras, embora algumas sejam tóxicas e provavelmente usadas como defesa contra herbívoro e parasitismo (por exemplo, alcaloides, taninos)2,3. Alguns desses produtos químicos têm a capacidade de afetar processos fisiológicos de longo prazo em animais, como o funcionamento endócrino, embora por que esses fitoquímicos endócrinos-ativos interagem com o sistema endócrino vertebrado ainda não está claro2,4.
Os fitoestrogênios, os fitoquímicos endocrinos mais bem estudados, são PSMs polifenóficos que imitam estrutural e funcionalmente estrogênios, interagindo diretamente com o eixo gânico hipotalmo-pituitário do sistema endócrinovertebrado 5. A ingestão de fitoestrogênios na dieta humana está associada à proteção contra alguns cânceres, doenças cardíacas e sintomas da menopausa, embora outros efeitos incluam problemas de fertilidade. De fato, os efeitos fisiológicos desses compostos foram descobertos na década de 1940, quando a infertilidade em ovelhas foi atribuída ao seu pasto no trevo rico em fitoestrogênio(Trifolium subterrareum)6. Quando ingeridos, fitoestrogênios podem passar para as células e imitar os efeitos do estrogênio. Embora os fitoestrogênios tivessem efeitos negativos na fertilidade das ovelhas, a relação entre fitoestrogênios e fisiologia não é simples. Como ovelhas, rinocerontes brancos do sul apresentam sensibilidade a compostos estrogênicos em ração derivada de altas quantidades de soja e alfafa. Filhas de mulheres alimentadas com essa dieta durante a gravidez são menos propensas a se reproduzir7. No entanto, outros estudos têm demonstrado que fitoestrogênios também podem ter efeitos positivos, incluindo a maturação de folículos ovarianos em camundongos mais velhos8, prevenção de certos cânceres, atividade antioxidante e efeitos antiproliferativos9.
A amplitude dos efeitos dos fitoestrogênios não é surpreendente, dado que os estrogênios afetam uma ampla gama de funções biológicas, incluindo crescimento, desenvolvimento e regulação dos sistemas nervosos reprodutivos e centrais10. Embora existam muitos mecanismos de ação, fitoestrogênios muitas vezes têm a capacidade de modificar, melhorar ou interromper a sinalização de estrogênio através de sua capacidade de agir como ligantes para os receptores de estrogênio intranuclear alfa e beta (ERα e ERβ). Muitos fitoestrogênios têm uma estrutura de anel fenólico semelhante aos estrogênios que lhes permite ligar receptores de estrogênio. Aqueles com atividade estrogênica agonizante funcionam como estrogênio, formando um complexo ativado de ligante ER que pode escurecer e se ligar a um elemento de resposta de estrogênio (ERE) e desencadear transcrição genética11. Assim, estrogênios e fitoestrogênios regulam a atividade celular e as funções do sistema através de suas ações como fatores de transcrição.
Aqui apresentamos o novo uso de um ensaio baseado em células para triagem de extratos vegetais para a presença de compostos que têm atividade biológica estrogênica. Este ensaio usa células de ovário de hamster chinês projetadas para expressar altamente ERβ, que foram transfectadas com o gene de luciferase de hamster(Photinus pyralis) ligado a um promotor do ERE12. Quando os compostos estrogênicos estão presentes, eles se ligam ao ER, escurecem e se ligam ao ERE, levando à transcrição do gene da luciferase. Após a adição de uma solução de substrato, a luciferase catalisa uma reação que leva à emissão de fótons. Portanto, amostras positivas produzem amostras leves e negativas.
Este ensaio comercialmente disponível elimina a necessidade de laboratórios transfetarem as células mamíferas com o gene repórter e o receptor de estrogênio13,14, que era instável e variável em eficácia. O ensaio fornece uma plataforma de transfecção estável que permite determinar rapidamente e simplesmente se uma planta tem atividade estrogênica através da ligação do receptor.
Testamos a hipótese de que a soja tem maior atividade estrogênica do que todos os outros alimentos, dadas as suas concentrações conhecidas de isoflavonas estrogênicas15 utilizando alimentos humanos de mercearias locais.

<table><tbody><tr><td>1000 &micro; Pipeta</td><td></td><td></td><td></td>L</tr><tr><td>20 &micro; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &#176; banho-maria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &#176;, incubadora</td><td></td><td></td><td></td>umidificada 5% CO2</tr><tr><td>70% etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>balança analítica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>capela</td><td></td><td></td><td></td>de fluxo laminar classificada para cultura celular</tr><tr><td>dimetilsulfóxido</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bacia de mídia descartável,</td> sistema de filtragem por gotejamento estéril <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frascos</td><td></td><td></td> Erlenmeyer <td>125 mL e 250 mL</td></tr><tr><td>de metanol</td><td></td><td></td><td></td>de grau HPLC</tr> Human <tr><td></td> ER&beta;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sistema de Ensaio Reporter, 1 x ensaios de formato de 96 poços</td> Kit <td>de ensaio de IB00411</td><td>da Indigo Biosciences</td><td>- analisa 24 amostras mais</td></tr><tr><td>liofilizador</td><td></td><td></td><td></td></tr> de curva padrão <tr><td>pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>multicanal agitador</td><td></td><td></td><td></td>orbital</tr><tr><td>luminômetro</td><td></td><td></td> de leitura de placas <td>ex. Evaporador</td></tr> <tr><td></td><td>rotativo Bioteck Synergy HTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>frascos</td><td></td><td></td> de fundo redondo tubos de microcentrífuga estéreis <td>de 50 mL e 300 mL</td></tr><tr><td>ou bacias</td><td></td><td></td><td></td>de mídia multicanal estéreis</tr><tr><td>pontas</td><td></td><td></td> estéreis <td>200 &micro; L e 1000 &micro; L</td></tr><tr><td>Whatman grau 1 papel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>whirl-pak sacos</td><td></td><td></td> sacos de <td>polietileno estéril</td></tr></tbody></table>

triagem para fitoestrogênios usando um receptor de estrogênio baseado em células β reporter assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

As plantas são uma fonte de alimento para muitos animais, e podem produzir milhares de produtos químicos. Alguns desses compostos afetam processos fisiológicos nos vertebrados que os consomem, como a função endócrina. Os fitoestrogênios, os fitoquímicos endócrinos mais bem estudados, interagem diretamente com o eixo gândalo hipotalmo-pituitário do sistema endócrino vertebrado. Aqui apresentamos o novo uso de um ensaio baseado em células para triagem de extratos vegetais para a presença de compostos que têm atividade biológica estrogênica. Este ensaio usa células de mamíferos projetadas para expressar altamente o receptor de estrogênio beta (ERβ) e que foram transfectadas com um gene de luciferase. A exposição a compostos com atividade estrogênica resulta nas células produtoras de luz. Este ensaio é uma maneira confiável e simples de testar a atividade estrogênica biológica. Possui várias melhorias em relação aos ensaios transitórios de transfecção, mais notavelmente, à facilidade de uso, à estabilidade das células e à sensibilidade do ensaio.

Vinte e dois extratos de frutas e vegetais comumente encontrados em dietas humanas foram examinados para a presença de compostos estrogênicos. Uma variedade de alimentos foram avaliados, incluindo leguminosas, como soja, ervilhas de neve e ervilhas, já que a família de ervilhas é uma fonte conhecida de fitoestrogênios16, além de figos, tâmaras, milho, cenoura, maçãs, bananas, morangos, tomate, couve e repolho. Compostos disruptores endócrinos são encontrados em substâncias comuns (por exemplo, plá...

Otimizamos um receptor de estrogênio comercialmente disponível β ensaio para triagem de alimentos primatas humanos e não humanos para atividade estrogênica. Validamos este ensaio mostrando que a conhecida soja humana estrogênica registra alta, enquanto outros alimentos não mostram atividade.

Triagem para Fitoestrogênios usando um receptor de estrogênio baseado em células β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Usamos este ensaio para avaliar se os alimentos vegetais contêm fitoesteróides, que podem afetar os processos fisiológicos em animais, bem como o comportamento e o sucesso reprodutivo. Este ensaio fornece um método simples e confiável para determinar se as plantas produzem compostos estrogênicos com atividade biológica. Este método foi desenvolvido inicialmente para rastrear medicamentos com atividade de xenoestrogênio para aplicações na medicina.Por exemplo, inibir a proliferação celular. Estamos usando-o para fornecer informações sobre a ecologia e evolução dos primatas. É importante ter prática de trabalho com técnica asséptica em um ambiente limpo antes de tentar este ensaio, pois é muito sensível à contaminação.Comece liofilizando os itens vegetais frescos com o liofilizador e, em seguida, triture-os finamente usando um moinho com uma tela de malha de 0,85 milímetros. Armazene as amostras moídas em sacos no escuro até a extração. Para extrair quaisquer fitoesteróides potenciais nas plantas, adicione uma amostra seca a um frasco de tamanho apropriado e, em seguida, a metanol de qualidade HPLC.Cubra a solução de metanol da planta com papel alumínio e coloque-a para girar a 100 RPM por três dias em um agitador orbital. Após três dias, use papel de filtro para decantar o sobrenadante e colocá-lo em um sistema de filtragem por gotejamento. Seque o extrato vegetal com um evaporador rotativo até engrossar, mas despeje em um balão redondo de fundo de 300 mililitros.Deitar a amostra num balão de 50 mililitros e lavar o balão grande com uma pequena quantidade de metanol, depois continuar a secar a amostra no balão pequeno até que o metanol tenha evaporado completamente. Quando terminar, pesar o resíduo da amostra com uma balança analítica e registar a massa. Dissolva o extrato da planta em DMSO na concentração de 0,1 grama de extrato para dois mililitros de DMSO e vortex até homogeneizar.O DMSO não é tóxico por si só, mas é um veículo que permite que outras substâncias atravessem as membranas. Como não sabemos se nossas plantas contêm produtos químicos tóxicos, todas são tratadas como se fossem perigosas. Não permita que a solução toque a pele, substitua as luvas se estiver contaminada e use sapatos grossos e fechados e jalecos.Armazene a amostra a quatro graus Celsius em frascos de vidro âmbar até que esteja pronta para uso. Vortex as amostras e, em seguida, adicione quatro microlitros de cada amostra a 496 microlitros de meio de triagem composto para produzir uma solução de 0,8% de DMSO. Desinfete a superfície externa de um tubo de meio de recuperação de células pré-aquecido com 70% de etanol e transfira 10 mililitros do meio para um tubo de células repórter congeladas para descongelá-las.Feche o tubo das células repórter e coloque-o em banho-maria a 37 graus Celsius por cinco a 10 minutos. Depois de recuperar as células do banho-maria, inverta suavemente o tubo várias vezes para quebrar os agregados de células e produzir uma suspensão homogênea, depois limpe a superfície do tubo com etanol a 70%. Use uma pipeta multicanal para dispensar 100 microlitros da suspensão da célula repórter em cada poço de uma placa de 96 poços e, em seguida, dispense 100 microlitros de amostras em triplicado nos poços apropriados.Incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 22 a 24 horas. Pouco antes do final da incubação da placa, remova o substrato de detecção e o tampão de detecção da geladeira e coloque-os em uma área com pouca luz até que estejam equilibrados à temperatura ambiente e, em seguida, inverta suavemente cada tubo para misturar as soluções. Imediatamente antes da conclusão da incubação da placa, despeje todo o conteúdo do tampão de detecção no tubo do substrato de detecção para criar o reagente de detecção de luciferase.Misture o tubo delicadamente para não produzir espuma. Descarte o conteúdo da placa de amostra em um recipiente de lixo inadequado e bata suavemente em uma toalha de papel absorvente limpa para remover as últimas gotículas dos poços. Adicione 100 microlitros do reagente de detecção de luciferase a cada poço e deixe a placa de ensaio descansar em temperatura ambiente por 15 minutos, depois quantifique a luminescência usando um luminômetro de leitura de placa de 96 poços.22 extratos de frutas e vegetais comumente encontrados em dietas humanas foram rastreados quanto à presença de compostos estrogênicos. A atividade estrogênica é apresentada de maneira qualitativa ordinal de alta, média, baixa ou nenhuma atividade. A soja orgânica e não orgânica apresentou altos níveis de atividade, enquanto todos os outros itens de frutas e hortaliças não registraram atividade.A comparação dos resultados da soja com a curva padrão também mostra que eles têm altos níveis de atividade estrogênica nessa concentração. O extrato de soja, uma fonte potente conhecida de isoflavonas, daidzeína e genisteína, foi usado para determinar a diluição produzindo um sinal de 50% ao máximo. Este extrato requer 422 vezes mais diluição para produzir metade do sinal do nosso protocolo de diluição padrão.As amostras identificadas com atividade podem ser enviadas para análise por espectrometria de massa para identificar os produtos químicos ativos. Usando um método antagonista, também podemos determinar se o alimento vegetal contém produtos químicos que reduzem a ligação e a atividade dos estrogênios endógenos. Essa técnica nos permite aprofundar nossa compreensão de como os alimentos estrogênicos são prevalentes nas dietas dos primatas, bem como como o consumo de fitoestrogênios afeta a fisiologia e o comportamento quando o ensaio é combinado com análises de hormônios fecais e dados de campo.

screening-for-phytoestrogens-using-cell-based-estrogen-receptor

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo descreve um ensaio repórter baseado em células para determinar a atividade estrogênica de compostos derivados de plantas. Um composto com atividade semelhante ao estrogênio imita sua ligação aos receptores de estrogênio e impulsiona a transcrição do gene da enzima repórter a jusante. A enzima repórter gera bioluminescência em uma reação, indicando a atividade estrogênica do composto.

Ensaio de atividade do receptor-repórter de estrogênio para rastrear a atividade estrogênica do fitoestrogênio

Molecular sinalização através de estrogênio e microRNAs são fundamentais no desenvolvimento do câncer de mama e de crescimento. O estrogênio ativa os receptores de estrogênio, que são fatores de transcrição. Muitos fatores de transcrição pode regular a expressão de microRNAs e microRNAs regulados por estrogénios podem ser perfilado utilizando diferentes técnicas de larga escala.

Profiling de MicroRNAs estrogênio regulados em células do cancro da mama

A integração de dados de experimentos de sequenciamento de todo o genoma e experimentos metabolômicos é um desafio.  Neste artigo, relatamos, pela primeira vez, a geração, análise e integração de dados de transcriptoma, cistrome e metaboloma de células de câncer de mama tratadas com estradiol.

Biologia de sistemas de regulação metabólica pelo receptor de estrogênio sinalização no cancro da mama

Desreguladores endócrinos (EDC) representam um risco significativo para o ambiente aquático. plantas municipais de tratamento de esgoto são grandes contribuintes para a potência estrogênica das águas superficiais. A metodologia prevista neste artigo permite uma avaliação da eficácia e adequação dos processos de tratamento de águas residuais em relação à remoção de EDC.

O uso de uma bateria de métodos químicos e ecotoxicológicos para a avaliação da eficácia dos Processos de Tratamento de Águas Residuais remover estrogénica Potência

Um protocolo para rastrear a atividade endócrina em extratos orgânicos de amostras de água, incluindo efluentes de águas residuais tratadas e águas superficiais (receptoras), foi adaptado usando bioensaios de transativação in vitro com prisão por divisão ("congelamento e descongelamento") disponíveis comercialmente.

Triagem para Endocrine Atividade em Água Utilizando disponíveis comercialmente<em&gt; In Vitro</em&gt; Transativação Bioensaios

Este artigo apresenta uma tela de estrogênio fermento otimizado para quantificação dos ligands em produtos de cuidados pessoais (PCP) que ligam alfa de receptores de estrógeno (ERα) e/ou beta (ERβ). O método incorpora duas opções de substrato colorimétrico, uma seis dias incubação refrigerada para uso em cursos de graduação e ferramentas estatísticas para análise de dados.

Detecção de ligantes estrogênicos em produtos de cuidados pessoais, usando uma tela de estrogênio de levedura otimizado para o laboratório de ensino de graduação

Apresentamos um método para analisar a 4-hidroxi-tamoxifeno-dependente de estrogênio receptor alfa ligand domínio dimerização actividade de ligação usando o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido.

Detectando a actividade de dimerização de domínio ligante-ligação do Receptor de estrogênio alfa usando o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido

Clinicamente, a deficiência de estrogênio em mulheres menopáusicas pode agravar a incidência de ruptura lipídica e aterosclerose. Nós estabelecemos um modelo in vivo da deficiência do estrogen pelo ovariectomia bilateral através de uma incisão dorsal-lateral dobro em APOE-/- ratos. O modelo do rato é aplicável para a triagem de tratamentos de estrogênio exógena de disfunção cardiovascular após a menopausa.

Um modelo in vivo de deficiência de estrogênio mouse para triagem tratamentos de estrogênio exógeno de disfunção cardiovascular após a menopausa

Presente aqui está um protocolo detalhado para o uso de embriões de zebrafish Tg(vtg1: mCherry) para a detecção de efeitos estrogênicos. O protocolo abrange a propagação do peixe e o tratamento de embriões, e enfatiza a detecção, documentação e avaliação de sinais fluorescentes induzidos por compostos disruptores endócrinos (EDC).

Usando embriões de zebrafish Tg (Vtg1:mcherry) para testar os efeitos estrogênicos dos compostos disruptivos endócrinos

Fluorescência de RNA de molécula única in situ hibridização (smFISH) é um método para quantificar com precisão os níveis e a localização de RNAs específicos no nível único celular. Aqui, relatamos nossos protocolos de laboratório validados para processamento de banco molhado, imagem e análise de imagens para quantificação de células únicas de RNAs específicas.

Análise celular única de alelos ativos transcricionralmente por peixe de molécula única

Aprenda a triar fitoestrogênios em alimentos vegetais usando um ensaio reporter com receptor de estrogênio β. Este método simples e confiável ajuda pesquisadores a estudar impactos dietéticos em primatas.

Triagem para Fitoestrogênios usando um receptor de estrogênio baseado em células β Reporter Assay

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