Modelo de Sistema Autônomo Translaminar para a Modulação da Pressão Intraocular e Intracraniana em Segmentos Posteriores de Doadores Humanos

Este novo sistema autônomo translaminar ocular usa o segmento posterior humano para regular independentemente as pressões intraocular e intracraniana para gerar um gradiente de pressão translaminar. O modelo TAS permite a avaliação da pressão intracraniana humana de forma ex vivo, pré-clínica, que anteriormente não podia ser estudada. Este modelo poderia ser usado para estudar doenças como glaucoma, lesão cerebral traumática, hipertensão intracraniana idiopática e síndrome neuroocular associada a voos espaciais.

Para configurar as seringas de entrada, carregue a seringa de 30 mililitros com 30 mililitros do fluido de perfusão de interesse e conecte uma torneira de parada de três vias à seringa. Conecte um filtro hidrofílico de 0.22 micrômetro à torneira de parada e conecte um adaptador de stub luer de calibre 15 ao filtro hidrofílico de 0.22 micrômetro. Depois de remover as bolhas de ar da configuração da seringa, conecte a tubulação ao adaptador de ponta luer e feche a porta lateral da torneira de parada com uma tampa de trava universal não ventilada.

Depois de configurar uma segunda seringa de entrada conforme demonstrado, rotule um canal de seringa um ICP e rotule o outro canal de seringa dois IOP. Em seguida, configure as seringas de saída como acabamos de demonstrar, mas sem carregar as seringas com o meio de infusão. Para preparar uma amostra do globo ocular inteiro humano, remova a bainha do nervo óptico e remova o humor vítreo do segmento posterior.

Para garantir um bom ajuste na cúpula redonda da câmara da PIO, apare a esclera adicional do segmento posterior conforme necessário e use uma pinça para garantir que a retina esteja espalhada uniformemente sobre a parte posterior humana do segmento. Em seguida, coloque o segmento na câmara IOP do TAS sobre a cúpula redonda com o nervo óptico voltado para cima e use um O-ring de resina epóxi e quatro parafusos para selar o segmento posterior. Para configurar a câmara IOP, insira a tubulação nas portas de entrada e saída da câmara e insira a seringa de entrada IOP na porta de entrada.

Insira a configuração da seringa de saída de PIO vazia na porta de saída e use o método de empurrar/puxar para infundir lentamente o meio de perfusão na porta de entrada para preencher a ocular posterior, enquanto simultaneamente puxa lentamente o meio de perfusão através da seringa de saída para remover quaisquer bolhas de ar das linhas. Assim que os tubos de entrada e saída estiverem livres de bolhas de ar, pare a infusão e trave as torneiras de parada na posição desligada. Remova a seringa do conjunto do filtro da porta IOP in e reabasteça a seringa com 30 milímetros adicionais de meio e, em seguida, reinsira a configuração da seringa no conjunto do filtro.

Para configurar a câmara ICP, coloque a câmara sobre a parte de trás do segmento posterior, tomando cuidado para que o nervo óptico esteja dentro da câmara superior, e sele a câmara superior com quatro parafusos, em seguida, insira a tubulação nas portas de entrada e saída da câmara ICP, a seringa de entrada ICP na porta de entrada, e a seringa de saída ICP vazia na porta de saída para lavar o sistema com meio, como acabamos de demonstrar. Para configurar o sistema de gravação de dados, ligue a fonte de alimentação de oito canais e o computador e inicie o software de aquisição de dados. Selecione Arquivo e Novo e selecione Configuração e Configurações do canal.

Selecione três canais e renomeie-os conforme indicado. Selecione dois milivolts para o Intervalo em todos os canais e, na coluna Cálculo, selecione Sem cálculo para os canais um e dois. Selecione Aritmética para o canal três Na janela Fórmula, em Canais, selecione Ch 2.

Em Função, selecione Matemática e Menos e, em Canais, selecione Ch 1. Para configurar e calibrar os transdutores de pressão hidrostática, conecte os transdutores de pressão hidrostática às linhas do transdutor conectadas ao amplificador de ponte multicanal e conecte uma seringa vazia de 30 mililitros à porta lateral do transdutor de pressão ICP do canal um. Conecte um esfigmomanômetro na parte inferior do transdutor de pressão ICP do canal um e clique na seta ao lado do tempo de amostragem para definir a velocidade de amostragem para 100.

Selecione Bridge Amp, Filtro de rede e Zero e espere o sistema zerar, tomando cuidado para não mover o transdutor de pressão. Em seguida, aperte as abas brancas do transdutor de pressão e empurre o ar através do transdutor até que 40 milímetros de mercúrio sejam obtidos no esfigmomanômetro, depois solte as abas brancas e remova a seringa e o esfigmomanômetro. Na página Conversão de Unidades, selecione menos e realce o patamar mais alto para indicar 40 milímetros de mercúrio.

Clique na seta para 0,1, digite 100 e realce o platô mais baixo para indicar zero milímetros de mercúrio. Clique na seta para 0,2, digite zero, selecione milímetros de mercúrio para as unidades e clique em OK. Na janela Bridge Amp, clique em OK e calibre os transdutores de pressão hidrostática para o IOP do canal dois, conforme demonstrado, usando 100 milímetros de mercúrio para o platô mais alto e zero para o platô mais baixo.

Para conectar a unidade do segmento posterior TAS ao sistema de aquisição de dados, coloque a unidade do segmento posterior TAS em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius e 5% e conecte a tubulação ICP da porta de saída do transdutor de pressão ICP do canal um. Conecte a tubulação IOP da porta de saída ao transdutor de pressão IOP do canal dois. Na página Exibição de Gráfico, selecione Iniciar Amostragem e defina a velocidade de amostragem como Lenta e um minuto.

Em seguida, ajuste as seringas no suporte do anel para cima ou para baixo para regular as pressões ICP e IOP de acordo com os requisitos do protocolo ou coloque-as em bombas de perfusão para regular a pressão. Nesta análise representativa, a manutenção dos diferenciais de pressão normais médios em ambas as câmaras foi testada através de vários parâmetros das condições de PIO e PIC. Para garantir a viabilidade do tecido, o meio no tecido foi trocado a cada 48 horas.

Aumentos mínimos de pressão ocorreram no momento da troca do meio, e não afetaram a viabilidade ou morfologia da cabeça do nervo óptico conforme observado pela análise imuno-histoquímica e expressão de colágeno IV nos dias 14 e 30 do experimento. Aumentar a PIO ou diminuir a PIC em vários pontos de tempo permite a manutenção de uma faixa de gradiente de pressão translaminar elevada por sete dias. Aos sete dias de gradiente de pressão translaminar elevado, escavação e espessamento foram observados nos segmentos posteriores, e a expressão de colágeno IV demonstra feixes espessados com expressão de sinal aumentada durante o período experimental.

A imagem de fase revela células ganglionares retinianas saudáveis dentro da camada de células ganglionares sem ventosas nos segmentos de controle, enquanto as imagens de culturas de gradiente de pressão translaminar elevada exibem ventosas extensas sem células ganglionares da retina remanescentes dentro da camada de fibras nervosas da retina e aumento da remodelação da matriz extracelular. Essa técnica permitirá que os pesquisadores estudem efetivamente os paradigmas de doenças biomecânicas e descubram a pressão translaminar direcionada à patogênese molecular no olho humano.