Protocolo de imagem e caracterização de terahertz para tumores de câncer de mama recém-excisados

Este protocolo utiliza imagens e espectroscopia terahertz para avaliar as margens cirúrgicas dos tumores mamários com o objetivo de diminuir substancialmente a necessidade de uma segunda cirurgia. A imagem terahertz pode ser usada para distinguir entre tecidos cancerígenos e não cancerosos com base em suas propriedades ópticas, em processos de maneira não ionizante e biologicamente seguro. Esta técnica foi desenvolvida para avaliação da margem do câncer de mama, mas é aplicável a outros tumores sólidos que requerem excisão cirúrgica e avaliação de margem.

Este método permite a imagem do interior dos blocos de tecido FFPE sem a necessidade de corte físico, facilitando a identificação de margens tumorais em qualquer profundidade precisa. Este protocolo requer o desempenho de etapas críticas, como manuseio de tecidos e balanceamento de palco que podem ser difíceis de entender sem demonstração visual. Antes de manusear a bandeja de metal de aço inoxidável com um saco de risco biológico e colocar todos os materiais de laboratório apropriados ao alcance fácil da bandeja coberta.

Em seguida, transfira a amostra de tumor fresco para uma placa de petri na bandeja e use inspeção grosseira para selecionar um lado do tumor que é suficientemente plano e tem pouco sangue e poucos vasos sanguíneos. Em seguida, coloque o lado a ser imageado no papel filtro de grau um para remover qualquer meio de demanda em excesso e para limpar o tecido de fluido ou secreções, reposicionando o tumor para um ponto seco à medida que o papel satura. Mantendo o tumor secando por cinco minutos, coloque uma placa de poliestireno de 1,2 milímetros de espessura na janela de varredura dentro de um diâmetro de aproximadamente 37 milímetros e coloque a janela de varredura e a placa de poliestireno no estágio amostral do imager Terahertz.

Na janela principal clique no ícone De varredura de ponto fixo para ativar as antenas Terahertz e para começar a enviar e receber o sinal terahertz refletido a partir de um único ponto na placa de poliestireno. Clique no ícone de diálogo Motor Stage. A janela do Controle motor se abrirá.

Para centralizar o pulso refletido do poliestireno na janela principal, clique nas setas do eixo de atraso óptico para ajustar o eixo de atraso óptico. Clique no botão Configurações de aquisição de dados para abrir a janela Descansamento de Configurações de Aquisição de Dados e alterar o valor de atraso óptico de cinco para quatro volts. Ajuste a posição vertical do estágio de digitalização com a escala de micrometro, até que o mínimo do pulso secundário seja o mais forte e ajuste o atraso óptico do eixo na janela do Controle do Motor para colocar o reflexo primário fora do intervalo do sinal refletido que está sendo medido.

Para nivelar o estágio da amostra e registrar o sinal de referência, clique no botão de diálogo de controle do motor para abrir a janela de controle do motor e reposicione o controle do motor e as janelas principais do software para que o sinal de domínio do tempo seja visível ao ajustar as posições do motor. Para nivelar o eixo A usando as seguintes etapas na janela de controle do motor, altere o valor do eixo x de zero para 10 negativo e bata Enter. O estágio passará para a posição de menos 10 milímetros do eixo A e uma mudança na posição do sinal será observada na janela principal.

Use a escala de micromímetro ajustável para mover o pico mínimo do sinal de volta para a posição vertical anterior e alterar o valor do eixo A para mais 10. Clique em Enter. O palco passará para a posição de mais 10 milímetros no eixo A e uma mudança no sinal será observada novamente.

Observe que a direção e distância que o sinal mudou de sua posição anterior e alterou o valor do eixo A de volta para menos 10. O sinal retornará à posição vertical original. Gire o parafuso de nivelamento no eixo A do estágio de digitalização e desloce o sinal para dobrar a distância na mesma direção, o estágio passou da posição original.

Use o micrômetro no estágio de digitalização para deslocar o sinal de volta para a posição original e repetir o ajuste até que o sinal em mais 10 e menos 10 sejam iguais no pico para ambas as posições estar focado na posição original. Uma vez alcançado o nivelamento do eixo A, altere o valor do eixo A para zero e repita o mesmo procedimento para o eixo B. Uma vez nivelados os dois eixos, devolva os eixos A e B a zero milímetros, insira a janela de controle do motor e verifique se o sinal está em sua posição original caso tenha mudado um pouco.

Para registrar esse sinal como referência na janela Propriedades de Aquisição de Dados, altere o valor médio para cinco e deixe todos os outros parâmetros em suas configurações padrão. Em seguida, clique em nova referência. O contador de médias contará de zero a 20.

Uma vez que o contador atinja 20, altere o valor médio para um e clique em OK. O sinal refletido do poliestireno será salvo como referência para quaisquer varreduras subsequentes. Quando todos os parâmetros tiverem sido definidos, transfira a janela de imagem do estágio de varredura para a área de manuseio do tecido e monte o tumor na placa de poliestireno. Remova quaisquer bolhas de ar dentro do tumor com pinças ou role suavemente a amostra para o poliestireno até que as aberturas de ar sejam minimizadas.

Coloque espaçadores absortivos em intervalos regulares ao redor da amostra de ensaio e coloque outra placa de poliestireno acima do tumor. Pressione suavemente a superfície do tumor o mais plano possível e tape o tumor e o arranjo da placa de poliestireno na janela da amostra. Uma superfície de tecido plano e um bom contato com a placa de poliestireno são vitais, pois bolhas de ar, excesso de fluido e uma superfície irregular podem arruinar a imagem do tecido tumoral.

Vire a janela da amostra e tire fotos do tumor para manter um registro de sua orientação. Retorne a janela de amostra para o estágio de digitalização e clique no botão de diálogo do parâmetro de imagem para abrir a janela de parâmetros de aquisição de imagens. Defina os valores do eixo um mínimo, eixo um máximo, eixo dois mínimo e eixo dois máximo para fechar totalmente a posição do tumor na janela de imagem.

Defina o eixo um passo e o eixo dois passos a 0,2 milímetros para a varredura de imagens. Em seguida, no menu Medir, selecione a varredura 2D do Flyback e crie uma pasta e nome de arquivo sob o qual salvar os dados de varredura na janela pop-up. Nesta análise, foi avaliado um carcinoma ductal de grau um a dois, obtido de uma mulher de 49 anos por meio de procedimento cirúrgico de lumpectomia de mama esquerda.

Ao correlacionar a imagem de Terahertz com a imagem patológica, ficou claro que a região do câncer apresentou um reflexo maior do que a região da gordura. Imagens tomográficas revelaram que, à medida que a frequência aumentava, os valores calculados do coeficiente de absorção para o câncer em pixels de gordura aumentaram com os pixels de câncer mostrando valores mais elevados do que a gordura em ambas as frequências. Em contrapartida, o índice de refração de ambos os tecidos diminuiu à medida que a frequência aumentava.

A análise da espectroscopia de transmissão do mesmo tumor revela uma boa concordância para a faixa de frequência tanto do coeficiente de absorção extraída quanto do índice refrativo para ambas as seções extraídas do tumor. Note-se que o manuseio insuficiente do tecido pode levar a resultados de imagem enganosos, resultando, por exemplo, em sugerir uma maior presença de câncer no tumor devido à presença de excesso de líquido dentro da amostra de tumor não seco. Caracterização adicional pode ser realizada nos dados da imagem terahertz para obter informações sobre as propriedades dependentes de frequência do tecido e a análise estatística pode ser realizada para segmentação automatizada de imagens.

Esta técnica levou ao desenvolvimento de algoritmos de imagem e espectroscopia para investigar as assinaturas de carcinoma ductal in situ, para diferenciar tumores de baixo grau de tumores mortais de alto grau. Lembre-se, para lidar com tecidos cancerígenos e a solução de formalina com cautela e que quaisquer elementos do sistema ou ferramentas que entrem em contato com o tecido tumoral devem ser limpos ou descartados adequadamente.