Análise de Citometria de Fluxo de Subconjuntos de Células Imunes dentro do Baço de Murina, Medula Óssea, Linfonodos e Tecido Sinovial em um Modelo de Osteoartrite

Nosso protocolo permite a identificação e análise detalhada de monócitos e macrófagos e células T e seus subconjuntos relevantes dentro dos neurônios e ovium e vários outros tecidos do sistema imunológico. Nossa técnica facilita a colheita confiável de células imunes da vida do sinovium e outros tecidos relevantes para uma caracterização abrangente da resposta imune osteoartrítica. Para o isolamento de tecidos de interesse de um rato modelo de osteoartrite, com o rato em posição supina, limpe o peito, o abdômen e as pernas com 70% de etanol.

Use uma tesoura para abrir cuidadosamente a pele ao longo da linha média do abdômen, deixando a cavidade abdominal intacta. E puxe suavemente a pele do lado direito do animal para longe do músculo subjacente, deixando o tecido adiposo subcutâneo preso à pele. Coloque o mouse sob um microscópio dissecando e use dois fórceps finos curvos para provocar suavemente o tecido adiposo localizado na coxa.

Após identificar os três vasos transversais, utilize fórceps de dissecação fino para remover o linfonodo inguinal localizado no cruzamento dos vasos, tomando cuidado para não romper a cápsula. Use os fórceps para remover a gordura restante da superfície do linfonodo e abrir a cavidade abdominal. Se nenhuma gordura restante puder ser vista, coloque o linfonodo imediatamente em uma placa previamente preparada e rotulada de seis poços preenchidos com 0,5 mililitros de mídia RPMI.

Daqui em diante, abra a cavidade abdominal. Use uma tesoura fina para extirpar o baço e extrair suavemente os intestinos para expor a aorta e sua bifurcação. Daqui em diante, coloque o baço imediatamente em um previamente preparado e rotulado seis bem jogados cheios de 0,5 mililitros de mídia RPMI.

Remova o linfonodo ilílico localizado no segmento terminal da aorta abdominal e a origem da artéria ilíaca comum e remova cuidadosamente a pele de ambos os membros traseiros. Coloque imediatamente o linfonodo em uma construção de seis placas de poço previamente preparada e rotulada com 0,5 mililitros de mídia RPMI unindo todos os linfonodos de dois animais. Usando uma tesoura fina ou um bisturi limpe o fêmur esquerdo do tecido muscular ligado e desconecte cuidadosamente tanto o sufocamento quanto a articulação do quadril, deixando todo o osso intacto durante a remoção do fêmur.

Em seguida, colocou o fêmur em uma placa previamente preparada e rotulada de seis poços cheios de 0,5 mililitros de mídia RPMI. Identifique o tendão da patela direita e use uma tesoura fina para remover o tecido muscular adjacente proximal à articulação até que aproximadamente cinco mililitros de quadríceps tendões proximais à patela sejam expostos. Corte o tendão do quadríceps aproximadamente de três a quatro milímetros proximal à patela para formar uma alça e use fórceps finos para afastar suavemente a tensão da articulação para expor as bordas do acessório da cápsula articular.

Começando com o fêmur e movendo-se em direção à tíbia, use um bisturi para cortar cuidadosamente ao longo das bordas da cápsula articular em ambos os lados, mantendo uma tração suave no tendão do quadríceps. Quando o bloco de tecido sinovial é anexado apenas à tíbia, a almofada de gordura intraarticular deve ser claramente visível dítala à patela e pode ser suavemente separada da articulação e aspecto anterior do Minsky. Em seguida, corte ao longo da parte restante da cápsula articular para remover o bloco de tecido sinovial e coloque-o imediatamente em uma placa previamente preparada e rotulada de seis poços preenchidos com 1,5 mililitros de mídia RPMI.

Quando todos os tecidos forem coletados, coloque dois baços agrupados por condição em um coador de células de 70 micrômetros em um tubo de 15 mililitros e use um estéril êmbolo de três mililitros para classificar suavemente os tecidos através do filtro de malha lavando o coador com frequência com um total de seis mililitros de RPMI 1640 médio suplementado com 10% de FBS. Sedimente as células por centrifugação, e suspenda a pelota em cinco mililitros de soprador de lise de glóbulos vermelhos. Após cinco minutos, pare a reação com 10 mililitros de PBS e centrifugar as células.

Quando não forem observados mais glóbulos vermelhos, suspenda a pelota em um mililitro de PBS fresco para contar. Para o processamento do linfonodo coloque todos os quatro linfonodos em um coador de células de 70 micrômetros em um novo tubo de 15 mililitros e use um novo êmbolo de três mililitros estéreis para provocar suavemente os linfonodos através da malha em uma única suspensão celular, em seguida, centrifugar as células a 500 vezes G por cinco minutos, descartar o sobrenante e suspender novamente a pelota em 500 microliters de PBS para contagem. Para isolar a medula óssea, use um fórceps de polegar de tecido para agarrar cuidadosamente o fêmur intacto e usar uma tesoura afiada para cortar a extremidade do fêmur proximal.

Insira uma agulha de calibre 23 no meio do entalhe intercondílar do fêmur e gire a agulha enquanto aplica pressão suave para fazer um furo no entalhe. Mudando a agulha conforme necessário, lave o conteúdo ósseo com seis mililitros de RPMI complementados com 10% de FBS em um coador de células de 70 micrômetros em um novo tubo de 15 mililitros e use um novo êmbolo de seringa de três mililitros para pressionar suavemente a medula óssea através da malha. A seguir, execute o passo RBC como demonstrado para o baço.

Quando não forem observados mais glóbulos vermelhos, suspenda a pelota em um mililitro de PBS fresco para contar. Para o processamento do tecido sinovial use uma tesoura cirúrgica fina para dados os dois blocos de tecido sinovial em pequenos pedaços e transfira as amostras para um novo tubo de 15 mililitros. Enxágüe o recipiente de coleta com 500 microliters de médio porte para coletar quaisquer células restantes e tecidos sinoviais e puxe a lavagem no tubo de coleta de amostras.

Em seguida, adicione um volume suficiente de enzima para alcançar em uma unidade por mililitro concentração final e digerir a amostra de tecido sinovial a 37 graus Celsius em uma incubadora por duas horas de uma rotadora. Certifique-se de movimento suficiente ao colocar os tubos no rotador. No final da incubação, pare a digestão com oito mililitros de RPMI suplementados com 10% de FBS e filtre a suspensão celular através de um coador de células de 70 micrômetros em um novo tubo de 15 mililitros.

Enxágüe o antigo tubo de 15 mililitros com cinco mililitros de médio e use-o para lavar o filtro. Em seguida, sedimentar as células por centrifugação e resuspensar a pelota em 500 microliters de PBS para contagem. Para realizar a vibilidade das células imunes isoladas, adicione cinco vezes 10 às cinco células de cada suspensão celular aos poços apropriados de duas diferentes placas de fundo U de 96 poços e colete as células ao fundo de cada poço.

Inclua sempre células não manchadas suficientes de cada tipo de tecido como controles negativos. Lave células com 200 microlitadores de PBS e suspenda as pelotas em 100 microliters de células em corante reativo de amina permeante por poço para uma incubação de 15 minutos a quatro graus Celsius protegido da luz. No final da incubação lave as células duas vezes em 200 microliters de tampão FACS por lavagem e suspenda derresor cada pelota em 100 microliters do anticorpo apropriado de interesse ou coquetel de controle.

Se a coloração intra e extracelular for conduzida no mesmo executar a etapa de coloração extracelular agora. Após 30 minutos de incubação a quatro graus Celsius protegidos da lavagem da luz as células duas vezes com 200 microliters de tampão FACS por poço e suspender as células e a placa do painel do subconjunto monocito em 250 microliters de tampão FACS complementados com um EDTA mililitro. Conduza esta etapa somente se não for planejada nenhuma coloração intracelular, caso contrário, passe para o aspecto de coloração intracelular do protocolo.

Em seguida, transfira cada amostra de subconjunto de monócito para o tubo FACS correspondente apropriado no gelo protegido da luz. Para coloração intercelular das células do painel de subconjunto de células T, suspenda-as as pelotas em 200 microliters de tampão de fixação de um kit de fixação e permeabilização apropriado para uma incubação de 40 minutos a quatro graus Celsius protegidas da luz. No final da incubação lave as células duas vezes com 200 microlitadores de tampão de lavagem de permeabilização e suspenda as pelotas em 100 microliters do anticorpo apropriado de interesse ou coquetel de controle para uma incubação de 40 minutos a quatro graus Celsius protegido da luz.

Em seguida, lave as células duas vezes em 200 microliters de tampão de lavagem de permeabilização por lavagem. E suspenda as células em 250 microliters de FACS mais tampão EDTA antes de transferir as amostras para os tubos FACS correspondentes apropriados no gelo protegidos da luz. Aqui, pode ser observada a estratégia hierárquica do subconjunto de monocitos em células imunes recolhidas da medula óssea de animais tratados com DMM.

Trolls não manchados podem ser usados para determinar os verdadeiros negativos para a mancha viva morta e os portões podem ser ajustados cada vez que o experimento é conduzido conforme necessário. Nesta análise representativa, as células imunes foram isoladas dos tecidos sinoviais e manchadas com marcadores de superfície extracelulares, seis semanas após a DMM ou a cirurgia de controle falso. Uma maior porcentagem de macrófagos MHC2 positivos de Ly-SC e m2 são observados em animais tratados com DMM em comparação com as populações de células observadas em camundongos de cirurgia falsa.

Aqui, pode-se observar a estratégia hierárquica de gating para o painel extra e intracelular de células T em células imunes isoladas do baço dos animais tratados com DMM. Uma maior porcentagem de células TH1 são observadas nos linfonodos e tecidos sinoviais de animais DMM, bem como maior número de células reguladoras T e células TH17. Para garantir a aquisição de amostras de alta qualidade, os tecidos devem ser colhidos de forma rápida, meticulosa e consistente.

Uma vez que as células imunes tenham sido isoladas, outras análises a jusante podem ser conduzidas, como RTPCR, cultura celular e descanso sobre o sangue para iluminar os processos moleculares de interesse.