Name: Análise de Citometria de Fluxo de Subconjuntos de Células Imunes dentro do Baço de Murina, Medula Óssea, Linfonodos e Tecido Sinovial em um Modelo de Osteoartrite (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Aprenda a identificar subconjuntos de células imunes em baço, medula óssea, linfonodos e tecido sinovial de murinos usando citometria de fluxo. Este protocolo reprodutível facilita o estudo da resposta imune na osteoartrite.

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Gostaríamos de agradecer andrew Lim, Ph.D. e Giles Best, Ph.D. por sua ajuda na configuração do citómetro de fluxo. Este projeto foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1) concedida ao PH.

<ol><li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology%2C+treatment%2C+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).</li>
<li>Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cells+in+Osteoarthritis%3A+Alterations+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond.</a> Frontiers in Immunology. 8, 356(2017).</li>
<li>Woolf, A. D., Pfleger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+major+musculoskeletal+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Burden of major musculoskeletal conditions.</a> Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).</li>
<li>Little, C. B., Hunter, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-traumatic+osteoarthritis%3A+from+mouse+models+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials.</a> Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).</li>
<li>Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+post-traumatic+OA+with+a+view+to+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research%3A+Clinical+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention.</a> Best Practice & Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).</li>
<li>Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+knee+injuries+and+knee+osteoarthritis%3A+a+meta-analysis+of+observational+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).</li>
<li>Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes+subsets+in+osteoarthritis+versus+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Egyptian+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis.</a> Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).</li>
<li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+accumulation+of+activated+Th1+cells+not+only+in+rheumatoid+arthritis+but+also+in+osteoarthritis+joints%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints.</a> Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).</li>
<li>Sakkas, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+and+T-cell+cytokine+transcripts+in+the+synovial+membrane+in+patients+with+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+and+Diagnostics+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis.</a> Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).</li>
<li>Guo, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+CD%284%29%28%2B%29+CD%282%29%285%29%28%2B%29+Foxp%283%29%28%2B%29+Treg+with+the+recovery+of+joint+function+after+total+knee+replacement+in+rats+with+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Research%22%5BJournal%5D)">Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis.</a> Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).</li>
<li>Moradi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29%2FhighCD127low%2F%28-%29+regulatory+T+cells+are+enriched+in+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis+joints--analysis+of+frequency+and+phenotype+in+synovial+membrane%2C+synovial+fluid+and+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood.</a> Arthritis Research & Therapy. 16 (2), 97(2014).</li>
<li>Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cellular+infiltrate+in+inflammatory+synovia+of+osteoarthritic+knees%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+macrophage+M1+polarisation+exacerbates+experimental+osteoarthritis+partially+through+R-spondin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).</li>
<li>Culemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locally+renewing+resident+synovial+macrophages+provide+a+protective+barrier+for+the+joint%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint.</a> Nature. 572, 670-675 (2019).</li>
<li>Mocellin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantitative+real-time+PCR+to+determine+immune+cell+density+and+cytokine+gene+profile+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).</li>
<li>Ward, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+markers+for+the+rodent+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical markers for the rodent immune system.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).</li>
<li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology%2C+treatment%2C+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).</li>
<li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+%28DMM%29+model+of+osteoarthritis+in+the+129%2FSvEv+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li>
<li>Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Staining+and+Flow+Cytometry+to+Identify+Lymphocyte+Subsets+within+Murine+Aorta%2C+Kidney+and+Lymph+Nodes+in+a+Model+of+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55266(2017).</li>
<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Protocol+for+the+Comprehensive+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+in+Normal+and+Inflamed+Murine+Non-Lymphoid+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).</li>
<li>Lorenz, J., Grassel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+osteoarthritis+models+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Experimental osteoarthritis models in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).</li>
<li>Christiansen, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+mouse+models+of+post-traumatic+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+alteration+of+lymphatic+vessels+in+knee+joints+of+normal+and+osteoarthritic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice.</a> Arthritis & Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).</li>
<li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+mapping+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Lymph node mapping in the mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+culture+and+isolation+of+murine+synovial+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Reports%22%5BJournal%5D)">A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts.</a> Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).</li>
<li>Belluzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+Infrapatellar+Fat+Pad+and+Synovial+Membrane+to+Knee+Osteoarthritis+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain.</a> BioMed Research International. 2019, 18(2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os métodos descritos neste protocolo foram projetados e testados para identificar de forma confiável vários subconjuntos de monócitos/macrófagos e células T dentro do baço de murina, medula óssea, linfonodos e tecido sinovial em um modelo de murina de osteoartrite (OA). O protocolo atual pode ser facilmente modificado para investigar diferentes tipos de tecidos, ou outros tipos de células, trocando anticorpos, e pode ser usado para modelos murinos alternativos de OA. Ao testar outros tipos de tecidos, é fundamental testa...

A osteoartrite (OA) é uma doença debilitante e dolorosa que envolve várias patologias de todos os tecidos associados à articulação1. Afetando aproximadamente 3,8% da população global2, o AA é uma das doenças musculoesqueléticos mais prevalentes e deve se tornar a4ª principal causa de incapacidade em todo o mundo até 20203. OA pós-traumático ocorre após uma lesão articular e representa pelo menos 12% de todos os OA e até 25% de OA em articulações suscetíveis como o joelho4,,5. Além disso, a lesão articular aumenta o risco de vida útil de OA em mais de cincovezes 6. Nem todas as lesões com instabilidade aparentemente semelhante continuarão a desenvolver OA e, portanto, a definição de fatores que impulsionam o risco OA de longo prazo permanece desafiadora. É fundamental desenvolver tratamentos eficazes para prevenir e/ou tratar o OA pós-traumático, investigar e definir melhor a patologia, causas e mecanismos específicos da lesão que predispõem à OA1.
OA e sua definição de destruição da cartilagem foram previamente atribuídas inteiramente ao estresse mecânico e, portanto, a OA foi considerada uma doença não inflamatória2. No entanto, estudos mais recentes têm mostrado uma infiltração inflamatória de membranas sinoviais e um aumento de células inflamatórias no tecido sinovial em pacientes com OA em comparação com controles saudáveis2, lançando luz sobre um componente inflamatório como uma potencial força motriz em OA. Outros estudos indicaram que anormalidades tanto no perfil das células T CD4+ quanto em CD8+, bem como monócitos/macrófagos do sistema imunológico inato podem contribuir para a patogênese de OA2,7. Investigações detalhadas sobre essas anormalidades revelaram funções relevantes para vários subconjuntos de células T2, como as populações normando Th18,Th29, Th178 e T (Treg)10,11. Apesar dessa evidência convincente, a relação causal entre a alteração das respostas das células T e o desenvolvimento e progressão da OA ainda é desconhecida2.
Além de células T específicas terem um papel em OA, estudos recentes sugerem que macrófagos polarizados/ativados diferencialmente podem estar associados à patogênese de OA12. Em particular, macrófagos originários de monócitos sanguíneos se acumulam no sinolio e polarizam-se em macrófagos ativados clássicamente (M1) ou macrófagos ativados alternativamente (M2) durante o desenvolvimento de OA, implicando uma correlação entre macrófagos derivados de monocitos e OA13. Em contraste, certos subconjuntos de macrófagos povoam órgãos precocemente durante o desenvolvimento e auto-sustentam seus números em uma matéria independente monócito14. Recentemente, uma função de proteção articular mediada por uma barreira de junção apertada foi mostrada para esses macrófagos residentes em tecido sinovial (STRMs)14. Esses achados indicam que anormalidades em subconjuntos de macrófagos em particular podem desempenhar um papel crucial durante o desenvolvimento do OA. No entanto, as interações entre essa resposta inflamatória celular e as mudanças estruturais na articulação posterior ao trauma são desconhecidas.
Historicamente, a análise das células imunes no tecido sinovial foi restrita à imunohistoquímica (IHC) ou à expressão mRNA por reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) se aproxima15,,16. No entanto, tanto o IHC quanto o RT-PCR não têm a capacidade de identificar vários tipos de células diferentes e seus subconjuntos simultaneamente, limitando assim a aplicabilidade desses métodos. Além disso, o IHC limita-se à análise de pequenas amostras de tecido e pode perder acúmulos de células inflamatórias focais. Ao longo dos últimos anos, uma miríade de marcadores superficiais para vários tipos de células foram desenvolvidos, e subconjuntos de células imunes podem agora ser identificados de forma confiável por combinações distintas desses marcadores. Devido ao progresso técnico constante, os citómetros de fluxo são agora capazes de identificar uma infinidade de diferentes fluorochromes simultaneamente permitindo a análise de grandes painéis de anticorpos multicoloridos.
A citometria de fluxo fornece aos pesquisadores uma técnica poderosa que permite a identificação simultânea e quantificação de uma infinidade de células imunes e seus subconjuntos no nível único das células. Desenvolvemos e otimizamos tanto um ensaio de coloração extracelular para identificar monócitos/macrófagos e seus subconjuntos, bem como um ensaio de coloração extra/intracelular para identificar células T e seus subconjuntos dentro do baço murina, medula óssea, linfonodos e tecido sinovial. Cada etapa deste protocolo foi otimizada e testada resultando em um ensaio altamente reprodutível que pode ser utilizado para outros modelos de camundongos OA cirúrgicos e não cirúrgicos17.

<table><tbody><tr><td>APC anti-mouse CD194 (CCR4)</td><td>BioLegend</td><td>131212</td><td>Painel de Células T</td></tr><tr><td>Brilhante Buffer de Manchas Plus 1000Tst</td><td>BD</td><td></td><td>566385 Buffers</td></tr><tr><td>Viabilidade Fixável Mancha 510, 100 &micro; g</td><td>BD</td><td>564406</td><td>Painel de Células</td></tr><tr><td>T Fixável Mancha de Viabilidade 510, 100 &micro; g</td><td>BD</td><td>564406</td><td>Painel de Monócitos</td></tr><tr><td>Liberase, Grau de Pesquisa</td><td>Roche</td><td>5401127001</td><td>Enzima para tecido sinovial</td></tr><tr><td>Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 &micro; g</td><td>BD</td><td>564985</td><td>Painel de Monócitos</td></tr><tr><td>Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 &micro; g</td><td>BD</td><td>562454</td><td>Painel de Monócitos</td></tr><tr><td>Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>742274</td><td>Painel de Células T</td></tr><tr><td>Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 &micro; g</td><td>BD</td><td>565250</td><td>Painel de Monócitos</td></tr><tr><td>Ms CD25 BV605 PC61, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>563061</td><td>Painel de Células T</td></tr><tr><td>Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 &micro; g</td><td>BD</td><td>557596</td><td>Painel de Células T</td></tr><tr><td>Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 &micro; g</td><td>BD</td><td>552775</td><td>Painel de Células T</td></tr><tr><td>Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>565480</td><td>Painel de Células T</td></tr><tr><td>Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 &micro; g</td><td>BD</td><td>565261</td><td>Painel de Células T</td></tr><tr><td>Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>740664</td><td>Painel de Células T</td></tr><tr><td>Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>563687</td><td>Painel de Monócitos</td></tr><tr><td>Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>563332</td><td>Painel de Células T</td></tr><tr><td>Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>565411</td><td>Painel de Monócitos</td></tr><tr><td>Ms Foxp3 PE MF23, 100 &micro; g</td><td>BD</td><td>560408</td><td>Painel de Células T</td></tr><tr><td>MS I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>563414</td><td>Painel de Monócitos</td></tr><tr><td>Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>560593</td><td>Painel de Monócitos</td></tr><tr><td>Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>560600</td><td>Painel de Monócitos</td></tr><tr><td>Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>564143</td><td>Painel de Células T</td></tr><tr><td>MS ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>562894</td><td>Painel de células T</td></tr><tr><td>Tampão de lise de glóbulos vermelhos</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>Tampões Conjunto de</td></tr><tr><td>buffer de fator de transcrição 100Tst</td><td>BD</td><td>562574</td><td>Buffers</td></tr></tbody></table>

análise de citometria de fluxo de subconjuntos de células imunes dentro do baço de murina, medula Óssea, linfonodos e tecido sinovial em um modelo de osteoartrite

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

A osteoartrite (OA) é uma das doenças musculoesqueléticos mais prevalentes, afetando pacientes que sofrem de dor e limitações físicas. Evidências recentes indicam um potencial componente inflamatório da doença, com células T e monócitos/macrófagos potencialmente associados à patogênese de OA. Outros estudos postularam um papel importante para subconjuntos de ambas as linhagens celulares inflamatórias, como linfócitos de th1, th2, th17 e t-regulatory, e M1, M2, e macrófagos residentes em tecido sinovium. No entanto, a interação entre a resposta celular inflamatória sinovial local e sistêmica e as mudanças estruturais na articulação é desconhecida. Para entender perfeitamente como as células T e os monócitos/macrófagos contribuem para o OA, é importante ser capaz de identificar quantitivamente essas células e seus subconjuntos simultaneamente em tecido sinovial, órgãos linfáticos secundários e sistematicamente (o baço e a medula óssea). Hoje em dia, os diferentes subconjuntos de células inflamatórias podem ser identificados por uma combinação de marcadores de superfície celular tornando a citometria de fluxo multicolorida uma técnica poderosa na investigação desses processos celulares. Neste protocolo, descrevemos etapas detalhadas relativas à colheita de tecido sinovial e órgãos linfáticos secundários, bem como a geração de suspensões de células únicas. Além disso, apresentamos um ensaio de coloração extracelular para identificar monócitos/macrófagos e seus subconjuntos, bem como um ensaio de coloração extra e intracelular para identificar células T e seus subconjuntos dentro do baço de murina, medula óssea, linfonodos e tecido sinovial. Cada etapa deste protocolo foi otimizada e testada, resultando em um ensaio altamente reprodutível que pode ser utilizado para outros modelos de camundongos OA cirúrgicos e não cirúrgicos.

Os resultados representativos do painel de subconjunto de monócito e do painel de subconjunto de células T são descritos abaixo.
A Figura 1 ilustra a estratégia hierárquica de gating para o painel de subconjunto de monócitos em células imunes recolhidas da medula óssea de animais tratados com DMM. A mesma estratégia foi utilizada e verificada em todos os outros tipos de tecidos. Ao configurar o experimento, a tensão de Área de Dispersão Para a Frente (FSC-A) e Áre...

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado e reprodutível de citometria de fluxo para identificar subconjuntos de monócito/macrófago e células T usando ensaios de coloração extra e intracelular dentro do baço de murina, medula óssea, linfonodos e tecido sinovial, utilizando um modelo cirúrgico estabelecido de osteoartrite de murina.

Análise de Citometria de Fluxo de Subconjuntos de Células Imunes dentro do Baço de Murina, Medula Óssea, Linfonodos e Tecido Sinovial em um Modelo de Osteoartrite

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Nosso protocolo permite a identificação e análise detalhada de monócitos e macrófagos e células T e seus subconjuntos relevantes dentro dos neurônios e ovium e vários outros tecidos do sistema imunológico. Nossa técnica facilita a colheita confiável de células imunes da vida do sinovium e outros tecidos relevantes para uma caracterização abrangente da resposta imune osteoartrítica. Para o isolamento de tecidos de interesse de um rato modelo de osteoartrite, com o rato em posição supina, limpe o peito, o abdômen e as pernas com 70% de etanol.Use uma tesoura para abrir cuidadosamente a pele ao longo da linha média do abdômen, deixando a cavidade abdominal intacta. E puxe suavemente a pele do lado direito do animal para longe do músculo subjacente, deixando o tecido adiposo subcutâneo preso à pele. Coloque o mouse sob um microscópio dissecando e use dois fórceps finos curvos para provocar suavemente o tecido adiposo localizado na coxa.Após identificar os três vasos transversais, utilize fórceps de dissecação fino para remover o linfonodo inguinal localizado no cruzamento dos vasos, tomando cuidado para não romper a cápsula. Use os fórceps para remover a gordura restante da superfície do linfonodo e abrir a cavidade abdominal. Se nenhuma gordura restante puder ser vista, coloque o linfonodo imediatamente em uma placa previamente preparada e rotulada de seis poços preenchidos com 0,5 mililitros de mídia RPMI.Daqui em diante, abra a cavidade abdominal. Use uma tesoura fina para extirpar o baço e extrair suavemente os intestinos para expor a aorta e sua bifurcação. Daqui em diante, coloque o baço imediatamente em um previamente preparado e rotulado seis bem jogados cheios de 0,5 mililitros de mídia RPMI.Remova o linfonodo ilílico localizado no segmento terminal da aorta abdominal e a origem da artéria ilíaca comum e remova cuidadosamente a pele de ambos os membros traseiros. Coloque imediatamente o linfonodo em uma construção de seis placas de poço previamente preparada e rotulada com 0,5 mililitros de mídia RPMI unindo todos os linfonodos de dois animais. Usando uma tesoura fina ou um bisturi limpe o fêmur esquerdo do tecido muscular ligado e desconecte cuidadosamente tanto o sufocamento quanto a articulação do quadril, deixando todo o osso intacto durante a remoção do fêmur.Em seguida, colocou o fêmur em uma placa previamente preparada e rotulada de seis poços cheios de 0,5 mililitros de mídia RPMI. Identifique o tendão da patela direita e use uma tesoura fina para remover o tecido muscular adjacente proximal à articulação até que aproximadamente cinco mililitros de quadríceps tendões proximais à patela sejam expostos. Corte o tendão do quadríceps aproximadamente de três a quatro milímetros proximal à patela para formar uma alça e use fórceps finos para afastar suavemente a tensão da articulação para expor as bordas do acessório da cápsula articular.Começando com o fêmur e movendo-se em direção à tíbia, use um bisturi para cortar cuidadosamente ao longo das bordas da cápsula articular em ambos os lados, mantendo uma tração suave no tendão do quadríceps. Quando o bloco de tecido sinovial é anexado apenas à tíbia, a almofada de gordura intraarticular deve ser claramente visível dítala à patela e pode ser suavemente separada da articulação e aspecto anterior do Minsky. Em seguida, corte ao longo da parte restante da cápsula articular para remover o bloco de tecido sinovial e coloque-o imediatamente em uma placa previamente preparada e rotulada de seis poços preenchidos com 1,5 mililitros de mídia RPMI.Quando todos os tecidos forem coletados, coloque dois baços agrupados por condição em um coador de células de 70 micrômetros em um tubo de 15 mililitros e use um estéril êmbolo de três mililitros para classificar suavemente os tecidos através do filtro de malha lavando o coador com frequência com um total de seis mililitros de RPMI 1640 médio suplementado com 10% de FBS. Sedimente as células por centrifugação, e suspenda a pelota em cinco mililitros de soprador de lise de glóbulos vermelhos. Após cinco minutos, pare a reação com 10 mililitros de PBS e centrifugar as células.Quando não forem observados mais glóbulos vermelhos, suspenda a pelota em um mililitro de PBS fresco para contar. Para o processamento do linfonodo coloque todos os quatro linfonodos em um coador de células de 70 micrômetros em um novo tubo de 15 mililitros e use um novo êmbolo de três mililitros estéreis para provocar suavemente os linfonodos através da malha em uma única suspensão celular, em seguida, centrifugar as células a 500 vezes G por cinco minutos, descartar o sobrenante e suspender novamente a pelota em 500 microliters de PBS para contagem. Para isolar a medula óssea, use um fórceps de polegar de tecido para agarrar cuidadosamente o fêmur intacto e usar uma tesoura afiada para cortar a extremidade do fêmur proximal.Insira uma agulha de calibre 23 no meio do entalhe intercondílar do fêmur e gire a agulha enquanto aplica pressão suave para fazer um furo no entalhe. Mudando a agulha conforme necessário, lave o conteúdo ósseo com seis mililitros de RPMI complementados com 10% de FBS em um coador de células de 70 micrômetros em um novo tubo de 15 mililitros e use um novo êmbolo de seringa de três mililitros para pressionar suavemente a medula óssea através da malha. A seguir, execute o passo RBC como demonstrado para o baço.Quando não forem observados mais glóbulos vermelhos, suspenda a pelota em um mililitro de PBS fresco para contar. Para o processamento do tecido sinovial use uma tesoura cirúrgica fina para dados os dois blocos de tecido sinovial em pequenos pedaços e transfira as amostras para um novo tubo de 15 mililitros. Enxágüe o recipiente de coleta com 500 microliters de médio porte para coletar quaisquer células restantes e tecidos sinoviais e puxe a lavagem no tubo de coleta de amostras.Em seguida, adicione um volume suficiente de enzima para alcançar em uma unidade por mililitro concentração final e digerir a amostra de tecido sinovial a 37 graus Celsius em uma incubadora por duas horas de uma rotadora. Certifique-se de movimento suficiente ao colocar os tubos no rotador. No final da incubação, pare a digestão com oito mililitros de RPMI suplementados com 10% de FBS e filtre a suspensão celular através de um coador de células de 70 micrômetros em um novo tubo de 15 mililitros.Enxágüe o antigo tubo de 15 mililitros com cinco mililitros de médio e use-o para lavar o filtro. Em seguida, sedimentar as células por centrifugação e resuspensar a pelota em 500 microliters de PBS para contagem. Para realizar a vibilidade das células imunes isoladas, adicione cinco vezes 10 às cinco células de cada suspensão celular aos poços apropriados de duas diferentes placas de fundo U de 96 poços e colete as células ao fundo de cada poço.Inclua sempre células não manchadas suficientes de cada tipo de tecido como controles negativos. Lave células com 200 microlitadores de PBS e suspenda as pelotas em 100 microliters de células em corante reativo de amina permeante por poço para uma incubação de 15 minutos a quatro graus Celsius protegido da luz. No final da incubação lave as células duas vezes em 200 microliters de tampão FACS por lavagem e suspenda derresor cada pelota em 100 microliters do anticorpo apropriado de interesse ou coquetel de controle.Se a coloração intra e extracelular for conduzida no mesmo executar a etapa de coloração extracelular agora. Após 30 minutos de incubação a quatro graus Celsius protegidos da lavagem da luz as células duas vezes com 200 microliters de tampão FACS por poço e suspender as células e a placa do painel do subconjunto monocito em 250 microliters de tampão FACS complementados com um EDTA mililitro. Conduza esta etapa somente se não for planejada nenhuma coloração intracelular, caso contrário, passe para o aspecto de coloração intracelular do protocolo.Em seguida, transfira cada amostra de subconjunto de monócito para o tubo FACS correspondente apropriado no gelo protegido da luz. Para coloração intercelular das células do painel de subconjunto de células T, suspenda-as as pelotas em 200 microliters de tampão de fixação de um kit de fixação e permeabilização apropriado para uma incubação de 40 minutos a quatro graus Celsius protegidas da luz. No final da incubação lave as células duas vezes com 200 microlitadores de tampão de lavagem de permeabilização e suspenda as pelotas em 100 microliters do anticorpo apropriado de interesse ou coquetel de controle para uma incubação de 40 minutos a quatro graus Celsius protegido da luz.Em seguida, lave as células duas vezes em 200 microliters de tampão de lavagem de permeabilização por lavagem. E suspenda as células em 250 microliters de FACS mais tampão EDTA antes de transferir as amostras para os tubos FACS correspondentes apropriados no gelo protegidos da luz. Aqui, pode ser observada a estratégia hierárquica do subconjunto de monocitos em células imunes recolhidas da medula óssea de animais tratados com DMM.Trolls não manchados podem ser usados para determinar os verdadeiros negativos para a mancha viva morta e os portões podem ser ajustados cada vez que o experimento é conduzido conforme necessário. Nesta análise representativa, as células imunes foram isoladas dos tecidos sinoviais e manchadas com marcadores de superfície extracelulares, seis semanas após a DMM ou a cirurgia de controle falso. Uma maior porcentagem de macrófagos MHC2 positivos de Ly-SC e m2 são observados em animais tratados com DMM em comparação com as populações de células observadas em camundongos de cirurgia falsa.Aqui, pode-se observar a estratégia hierárquica de gating para o painel extra e intracelular de células T em células imunes isoladas do baço dos animais tratados com DMM. Uma maior porcentagem de células TH1 são observadas nos linfonodos e tecidos sinoviais de animais DMM, bem como maior número de células reguladoras T e células TH17. Para garantir a aquisição de amostras de alta qualidade, os tecidos devem ser colhidos de forma rápida, meticulosa e consistente.Uma vez que as células imunes tenham sido isoladas, outras análises a jusante podem ser conduzidas, como RTPCR, cultura celular e descanso sobre o sangue para iluminar os processos moleculares de interesse.

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