Rastreamento de pernas totalmente automatizado em insetos em movimento livre usando segmentação e rastreamento de pernas de aprendizagem de recursos (FLLIT)

FLLIT é um algoritmo que calcula as composições do corpo e das pernas de um animal rastreado. E isso é útil para caracterizar os circuitos que sustentam comportamentos normais e de caminhada por doenças. A única coisa única sobre a FLLIT é que ela não requer nenhum conjunto de dados anotado pelo usuário para treinamento e, portanto, é totalmente automatizado.

Mas também analisa automaticamente os dados da faixa produzindo uma série de medições de marcha, gráficos de marcha para visualização e um vídeo de faixa. Demonstrando o procedimento estará Animesh Banerjee, uma colega de pós-doutorado do meu laboratório. Antes de iniciar um experimento, confirme que a estação de gravação tem uma câmera de alta velocidade com um palco sobre ela para segurar a câmara da arena.

Coloque luzes LED infravermelhas na parte superior do palco com um difusor entre a câmera e a amostra. Cerca de 40 minutos antes de começar a gravação, transfira as moscas para uma vil vazia no gelo por cinco a sete minutos. Enquanto as moscas estão sendo sedadas, use água e um lenço para limpar a arena e lâminas de vidro da câmara e fita um dos slides de vidro abaixo da câmara.

Usando um pincel limpo, transfira uma mosca anestesiada para dentro da câmara e proteja a câmara com um segundo slide e fita. Em seguida, deixe a mosca câmara se aclimatar à temperatura ambiente por 15 a 20 minutos. Para gerar vídeos para análise FLLIT, primeiro, ligue a fonte de energia e abra o aplicativo do visualizador no sistema de computador conectado.

Altere a taxa de quadros de gravação para 1.000 quadros por segundo e defina a velocidade do obturador em um milissegundo. Coloque a câmara com a mosca na arena de gravação e clique no botão LIVE. Confirmou que a câmera está focada nas pontas das pernas quando a mosca está andando ereto no chão da câmara e clique em Record.

Durante a gravação, certifique-se de que a mosca caminha em uma trajetória relativamente reta sem tocar na borda da arena, caminha pelo menos três passos por perna, não faz uma pausa durante a caminhada, e que a distância percorria é o equivalente a pelo menos um comprimento e meio do corpo. No final da análise clique em Gravar Feito para interromper a gravação e salvar os arquivos no formato mraw ou tiff nas pastas apropriadas. Para instalar o FLLIT, baixe primeiro o programa em qualquer sistema operacional.

Extrair o conteúdo do arquivo zip e baixar conjuntos de dados de amostra. Para instalar o FLLIT no Ubuntu, navegue até o diretório FLLIT/Compilado e clique com o botão direito do mouse para selecionar Abrir no Terminal. Baixe um conjunto de dados de amostra e crie dados de pastas em FLLIT-master/Compiled no qual as pastas de conjunto de dados serão colocadas.

Instale as bibliotecas de tempo de execução do MATLAB em HOME/MCR. Quando a instalação da biblioteca de tempo de execução do MATLAB estiver concluída, emita o comando para garantir que os direitos executáveis sejam registrados na FLLIT. Em seguida, digite o comando para executar FLLIT.

Para segmentação do vídeo, converta o arquivo em arquivos TIFF individuais e salve os arquivos convertidos na pasta de dados FLLIT. Quando todos os arquivos tiverem sido transferidos, execute a FLLIT. Na janela pop-up, selecione 0 para realizar apenas a segmentação da perna ou selecione 1 para incluir o rastreamento das pernas com a segmentação das pernas.

Selecione a pasta contendo as imagens TIFF quadro a quadro do vídeo a serem rastreadas e o arquivo de interesse e clique em Adicionar. Em seguida, clique em Feito para iniciar a segmentação e rastreamento do vídeo selecionado. Para verificar a precisão do rastreamento e para realizar correções de erro, clique em Selecionar pasta de dados e selecione a pasta a ser rastreada.

Clique em Exibir Rastreamento e verifique a rotulagem de todas as pernas no primeiro quadro. Se uma perna estiver rotulada incorretamente e for necessária uma correção, clique em Pausar a visualização e ajustar a previsão. No painel Perna para Ajustar, selecione a perna que requer correção e clique duas vezes na posição correta desta perna na janela da imagem.

Em seguida, clique em Salvar e Sair. Para processar os dados segmentados e rastreados, clique em Processo de Dados. Primeiro, calcule o campo de visão real do vídeo capturado para que os parâmetros do portão possam ser medidos.

Na janela pop-up digite o número de quadros por segundo em que o vídeo é gravado e digite o campo de visão calculado em milímetros. Para acessar os resultados de rastreamento, abra os resultados e rastreie as pastas. Para gerar um vídeo da mosca rastreada, selecione Fazer vídeo.

Após a segmentação da perna, rastreamento e processamento de dados, a FLLIT gera automaticamente dados brutos para as posições do corpo, e cada garra de perna, 20 parâmetros de marcha e tramas que acompanham e vídeos rastreados. O SCA3 é tipificado por uma marcha ataxic com veering corporal, colocação errática do pé e passos de arrasto curtos. Para caracterizar a marcha das moscas mutantes SCA3 e investigar se elas exibem uma marcha semelhante à dos pacientes humanos, os parâmetros de marcha relevantes gerados pela FLLIT podem ser analisados.

As moscas SCA3-Q84 exibem mais curvas, colocação errática do pé, como exibido por uma baixa regularidade de pegada, e aumento da sobreposição do domínio das pernas, domínios de pernas aumentados em comprimento e área, e diminuição do comprimento do passo. A FLLIT também pode gerar um vídeo mostrando a mosca e as pernas rastreadas nas vistas centradas na arena e centradas no corpo, trajetória corporal, direção de direção e deslocamentos verticais e laterais de cada perna. Em comparação com as moscas SCA3-Q27, as moscas SCA3-Q84 exibem domínios irregulares de pernas intersetoriais de diferentes tamanhos, indicativos de uma marcha ataxica.

Os dados brutos para as posições da garra do corpo e da perna podem ser analisados para movimentos específicos de interesse. Por exemplo, o uso de FLLIT permitiu que nosso grupo determinasse que os fenótipos rígidos exibidos pelos modelos de Drosophila da doença de Parkinson são causados por disfunção do neurônio dopaminérgico.