Fenotipagem de tensão de levedura de alta produtividade com sequenciamento de RNA baseado em gotículas
21 de maio de 2020
Um gargalo no ciclo de "projeto-construção-teste" da engenharia microbiana é a velocidade com que podemos executar telas funcionais de cepas. Descrevemos um método de alto throughput para triagem de cepas aplicado a centenas a milhares de células de levedura por experimento que utiliza sequenciamento de RNA baseado em gotículas.
ICO, ou ICO-seq é a primeira adaptação do sequenciamento de RNA de alto rendimento para micróbios. Este método avaliou a função microbiana em uma escala genoma. Para micróbios projetados, este método pode elucidar como mudanças no genoma microbiano podem perturbado suas funções.
Obtenha levedura de uma cultura de suspensão, e conte as células usando um hemócito. Suspenda as células da PBS a uma concentração de cerca de 750.000 células por mililitro. Em seguida, misture o ponto de fusão ultra-baixo na PBS, e aqueça a mistura a 90 graus Celsius, até que a agarose derreta.
Carregue a mistura de agarose em uma seringa, com um filtro de 0,22 míces anexado. Coloque uma bomba de seringa na frente de um aquecedor espacial definido a 80 graus Celsius e coloque a seringa na bomba. Encha uma segunda seringa com a suspensão da levedura e encha uma terceira seringa com óleo fluorado, com fluorosurfactante 2% iônico.
Coloque as duas seringas nas bombas de seringa. Conecte a tubulação das seringas ao dispositivo A.Coloque um tubo cônico de 15 mililitros em um balde de gelo e guie a tubulação de saída para o tubo cônico. Defina a taxa de fluxo para cada seringa e colete aproximadamente um mililitro de emulsão no tubo cônico de 15 mililitros.
Depois de esperar cinco minutos para que a agarose no tubo seja definida, adicione um volume igual de 20% perfluoro-octanol em óleo fluorado à emulsão. Misture a emulsão e o perfluoro-octanol invertendo o tubo cônico algumas vezes. Centrifugar a emulsão quebrada a 2.000 vezes G por dois minutos.
Certifique-se de que os hidrogéis foram pelotados acima das fases de óleo e PFO. Remova as fases de óleo e PFO. Adicione dois mililitros de tampão tet(W) para suspender os hidrogéis.
Transfira a suspensão para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar o tubo novamente a 2.000 vezes G por dois minutos. Remova o supernatante e suspenda novamente os hidrogéis em tet(W)novamente.
Depois de girar os hidrogéis a 2.000 vezes G por dois minutos, suspenda os hidrogéis em dois mililitros de meio de cultura de levedura. Incubar o tubo durante a noite a 30 graus Celsius, com agitação. Cada cepa cresce a taxas diferentes.
A escolha de um tempo adequado de mídia e incubação é essencial para garantir que a levedura cresça dentro do hidrogel, mas não cresça demais, levando as células a escapar para a mídia. Primeiro, transfira os hidrogéis para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar o tubo a 2.000 vezes G por dois minutos.
Lave os hidrogéis duas vezes com PBS e, em seguida, uma vez no tampão de esferoplastia. Realize uma diluição de 40x de enzima spheroplasting em tampão de esferoplastação. Em seguida, adicione um mililitro da enzima diluída aos hidrogéis.
Incubar o tubo de hidrogéis a 37 graus Celsius por uma hora. A levedura tratada ficará mais transparente. Do tubo contendo a suspensão do hidrogel, retire 0,8 mililitros da suspensão da parte inferior do tubo e transfira-a para uma seringa sem tampa de um mililitro.
Coloque a seringa no suporte de seringa impresso em 3D. Centrifugar a seringa e o suporte a 2.000 vezes G por dois minutos. Antes de prosseguir, certifique-se de que os hidrogéis estejam bem embalados na parte inferior da seringa.
Coloque 240.000 contas de gota seq em um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar o tubo a 1.000 vezes G por um minuto. Remova o supernascer e suspenda as contas em dois mililitros de tampão de levedura de 0,9x, com cloreto de sódio de 500 mililitros.
Insira uma barra de mexida e transfira a suspensão da conta para uma seringa de três mililitros. Prepare outra seringa, contendo vários mililitros de surfactante PFPE-PEG em óleo fluorado. Obtenha a seringa previamente preparada de hidrogéis embalados com leveduras.
Evacuar a cabeça do aquiesce, e tampar a seringa. Insira as três seringas, os hidrogéis, a suspensão das contas e o óleo nas bombas de seringa. Conecte as seringas através de tubos ao dispositivo B, o dispositivo de encapsulamento.
Coloque a extremidade da tubulação de saída em um tubo cônico de 50 mililitros no gelo. Defina a taxa de fluxo para cada seringa. Colete aproximadamente 1.000 mililitros de emulsão, ou execute o dispositivo até que não haja mais hidrogéis.
Em seguida, siga o protocolo drop-seq para síntese de cDNA, preparação da biblioteca e sequenciamento. Usando um dispositivo microfluido, as células de levedura foram encapsuladas em gotículas de 160 micrômetros. Um divisor de oito vezes dividiu essas gotículas em oito gotículas de 60 micrômetros.
A incubação noturna resultou em colônias de leveduras isogênicas crescendo dentro de alguns dos hidrogéis. Antes de carregar os hidrogéis de levedura no segundo dispositivo microfluido, eles foram lavados e imersos em uma solução para digerir as paredes celulares. A digestão adequada foi verificada por microscopia, com células de levedura tratadas com morfologia mais reflexiva.
Um fluxo de contas de captura de mRNA no tampão de lise foi misturado com um fluxo de hidrogéis de levedura de embalagem fechada antes da junção de fabricação de gotas do segundo dispositivo microfluido. Na emulsão resultante, cerca de 10% das gotículas coletadas continham uma conta com uma colônia de lise. Este fluxo de trabalho de sequenciamento de colônia isogênica foi usado para analisar a resposta de comutação opaca branca dos c.albicans.
Componente principal, PC, análise e redução de dimensionalidade do TSNE indicaram concordância geral entre o conjunto de dados da amostra e um conjunto de dados de referência. A análise do TSNE revelou três aglomerados de células. Enquanto o cluster dois foi predominantemente composto por células do conjunto de dados da amostra, os clusters zero e um foram compostos por células de ambas as amostras.
Sobrepondo a expressão WH11 no tSNE indicou que o cluster provavelmente continha colônias brancas. A expressão STF2 aumentou no cluster um, consistente com os dados obtidos anteriormente. Nos clusters zero e dois, WH11 e STF2 foram significativamente regulados em comparação com o cluster um.
Micróbios andrógenos têm um potencial cada vez maior para produzir em massa biológicos para o tratamento de uma grande variedade de doenças. Após este procedimento, pode-se aplicar uma variedade de ferramentas bioinformáticas para analisar melhor os dados de sequenciamento.
Visão Geral
Este estudo apresenta um método de alto rendimento para triagem de cepas em engenharia microbiana, utilizando especificamente sequenciamento de RNA baseado em gotículas para analisar células de levedura. O método permite avaliações funcionais de microrganismos modificados em escala genômica.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Engenharia Microbiana
- Triagem de Alta Produtividade
- Sequenciamento de RNA
Contexto
- A triagem funcional de cepas microbianas é frequentemente lenta e ineficiente.
- Métodos de alto rendimento podem aumentar significativamente a velocidade dessas avaliações.
- O sequenciamento de RNA baseado em gotículas oferece uma abordagem inovadora para avaliar funções microbianas.
- Compreender perturbações no genoma pode orientar estratégias de engenharia microbiana.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método de triagem rápida para cepas de levedura utilizando sequenciamento de RNA.
- Elucidar os impactos funcionais de alterações genômicas em microrganismos modificados.
- Aumentar a eficiência do ciclo projeto-construção-teste na engenharia microbiana.
Métodos Utilizados
- Células de levedura foram cultivadas e preparadas em uma concentração específica.
- Microfluídica baseada em gotículas foi empregada para encapsular células de levedura.
- Sequenciamento de RNA foi realizado nas células encapsuladas para avaliar a expressão gênica.
- Ferramentas bioinformáticas foram aplicadas para analisar os dados de sequenciamento.
Resultados Principais
- O método encapsulou com sucesso células de levedura em gotículas para análise de alto rendimento.
- Colônias isogênicas foram geradas e analisadas quanto aos padrões de expressão gênica.
- A análise de componentes principais revelou agrupamentos distintos de expressão gênica.
- Os resultados indicaram diferenças significativas na expressão gênica relacionadas à morfologia da colônia.
Conclusões
- Este método de alto rendimento aumenta a capacidade de triagem eficiente de cepas microbianas.
- Os conhecimentos obtidos podem orientar a engenharia futura de microrganismos para aplicações biotecnológicas.
- A abordagem é aplicável a diversas espécies microbianas além da levedura.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A triagem de cepas de alto rendimento continua sendo um gargalo na engenharia microbiana, apesar dos avanços na edição do genoma. Este método de sequenciamento de RNA baseado em gotículas permite a avaliação funcional em todo o genoma de cepas de levedura modificadas, abordando diretamente a compensação entre produção de informações e produtividade. Ao fornecer inferência fenotípica a partir de perfis transcricionais, ele oferece confiança preditiva na seleção de cepas e acelera o ciclo projetar-construir-testar na produção de biológicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao vincular modificações genômicas a fenótipos funcionais por meio de leituras abrangentes do transcriptoma.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos por meio de perfis quantitativos de expressão gênica que esclarecem os impactos em nível de vias decorrentes de edições genéticas.
- Valor Preditivo: Facilita a triagem de portfólios ao identificar cepas com assinaturas de expressão desejadas associadas às vias-alvo, reduzindo a dependência de ensaios de baixo rendimento.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do ensaio: Gera colônias isogênicas padronizadas de levedura encapsuladas em gotículas, adequadas para triagem fenotípica reprodutível baseada em RNA-seq.
- Escalabilidade: Processa milhares de cepas geneticamente distintas em paralelo, superando as limitações dos métodos tradicionais de seleção de colônias e baseados em matrizes.
- Qualidade dos dados: Produz medidas quantitativas e multiplexadas de expressão gênica, permitindo comparações robustas entre bibliotecas de cepas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Aplicado à comutação branca-opaca de Candida albicans, um fenótipo relacionado à virulência, demonstrando utilidade na caracterização de cepas patogênicas.
- Continuidade Translacional: Relaciona modificações genéticas a desfechos fenotípicos por meio de biomarcadores de expressão (por exemplo, WH11, STF2), apoiando a seleção de cepas alinhada a biomarcadores.
- Redução de Riscos Pré-clínicos: Permite a identificação precoce de cepas não funcionais ou aberrantes, reduzindo o risco de falhas no desenvolvimento subsequente.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se aos fluxos de trabalho de engenharia de linhagens microbianas, desde a construção de bibliotecas até a validação funcional, permitindo a priorização de linhagens orientada pelo transcriptoma antes da identificação do candidato principal.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao revelar como perturbações genômicas afetam a expressão gênica global em contextos isogênicos.
- Triagem: Oferece sistemas microbianos padronizados e prontos para ensaios, com saídas transcricionais reprodutíveis para testes de resposta a compostos ou condições.
- Análises: Fornece agrupamentos de expressão derivados de PCA e tSNE, além de sobreposições de genes marcadores, que permitem a classificação fenotípica e a comparação de cepas.
- Pesquisa Translacional: Conecta genótipos de cepas a estados fenotípicos por meio de marcadores conservados, apoiando a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável para triagem de bibliotecas de leveduras e outras cepas microbianas em múltiplos projetos e áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva nas relações entre linhagens e funções ao reduzir ambiguidades mecanicistas por meio de dados de expressão em escala genômica.
- Valor Operacional: Aprimora a reprodutibilidade e a padronização por meio do encapsulamento em microfluídica e crescimento controlado de colônias baseado em hidrogel.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência nas decisões de prosseguimento ou interrupção e a alocação de capital ao permitir avaliação rápida de linhagens com múltiplos parâmetros.
- Impacto na Carteira: Apoia o avanço ajustado ao risco ao identificar linhagens com perfis moleculares indicativos de fenótipos desejados já nos estágios iniciais do desenvolvimento.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em microfluídica, genética de leveduras e preparação de bibliotecas de sequenciamento de RNA de célula única.
- Depende do acesso a dispositivos de geração de gotículas, óleos fluorados, surfactantes e infraestrutura de sequenciamento e bioinformática downstream.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de preparação de hidrogel, esferoplação e acoplamento a microesferas para resultados consistentes.
- Envolve a otimização do tempo de incubação e do meio para prevenir o crescimento excessivo do hidrogel e a liberação celular, o que depende da linhagem.
- É limitado pela necessidade de biomarcadores transcricionais com associações fenotípicas conhecidas para permitir inferência fenotípica precisa a partir de dados de RNA-seq.
