Name: Detecção de Proteína S-Acilação usando captura assistida de acila-resina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Aprenda a técnica Acyl-RAC para detectar S-acilação de proteínas em amostras biológicas variadas. Este método sensível permite análise simultânea de múltiplas proteínas em células, tecidos primários e amostras congeladas.

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Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde 5R01GM115446 e 1R01GM130840.

Os camundongos utilizados neste protocolo foram eutanizados de acordo com as diretrizes do NIH. O Comitê de Bem-Estar Animal do Centro de Ciência da Saúde da Universidade do Texas, em Houston, aprovou todo o trabalho animal.
1. Preparação de lysates celulares
<ol><li>Prepare o buffer de lysis conforme descrito na Tabela 1. A 10 mL de PBS, adicione 0,1 g de n-dodecil β-D-maltoside detergente (DDM) e gire para dissolver. Adicione 100 μL de coquetel inibidor de fosfatase 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 mM) e coquetel inibidor de protease (1x) e esfrie o tampão no gelo antes do uso.</li>
	<li>Transferir a mídia necessária contendo células da incubadora para tubos cônicos de 15 mL ou 50 mL e células giratórias a 350 x g por 5 min e aspirar para se livrar de quaisquer detritos celulares. NOTA: Utilizou 1 x 107 células para cada reação acil-RAC a ser realizada.</li>
	<li>Lave a pelota resuspendendo-a em 5 mL de PBS e girando a 350 x g por 5 min. NOTA: Execute rapidamente a etapa 1.3 para evitar a lse celular devido à incubação prolongada na PBS.</li>
	<li>Adicione 600 μL de tampão de lysis preparado na etapa 1.1 para a pelota e lyse-lo agitando a 1500 rpm em um shaker térmico por 30 min a 4 °C.</li>
	<li>Limpe as lidas por centrifugação a 20.000 x g a 4 °C por 30 min para pellet detergente-insolúvel. Colete lysate limpo em tubos de microfusão pré-resfriados de 1,5 mL e mantenha-os no gelo.</li>
	<li>Realize um ensaio bradford/bca para estimar a concentração de proteínas. É fundamental garantir a mesma quantidade de proteína em diferentes amostras antes de realizar o experimento. Recomendamos o uso de pelo menos 500 μg de proteína por reação. NOTA: Nos experimentos descritos, utilizou-se células cultivadas (Jurkat) e esplenocites primários a partir do tecido de camundongos. O método de lyse descrito acima também pode ser adotado para outros tipos de células. A concentração média de proteína obtida para os tipos de células acima mencionadas é de aproximadamente 500 μg por 1 x 107 células. As células de Jurkat foram mantidas no meio RPMI-1640 modificado para conter 2 mM L-glutamina, 10 mM HEPES, 1 mM de piruvato de sódio, 4.500 mg/L de glicose e 1.500 mg/L de bicarbonato de sódio suplementado com 10% de FBS a 37 °C com 5% de CO2. Usamos 1 x 107 células Jurkat por reação. Os esplenocites primários foram isolados do tecido do baço do camundongo como descrito26. Resumidamente, o tecido do baço foi macerado no gelo, seguido de lyse de eritrócitos em solução hipotônica e separação dos linfócitos por centrifugação. Usamos 1 x107 células primárias por reação.</li>
</ol>2. Acill-RAC: Bloqueio de grupos de tiol gratuitos
NOTA: Todas as etapas subseqüentes podem ser executadas à temperatura ambiente (RT).
<ol><li>Transfira o lysate para um tubo de microfusão fresco de 1,5 mL e realize precipitação de clorofórmio-metanol (CM), conforme descrito abaixo.<ol>
<li>Adicione metanol (MeOH) e clorofórmio (CHCl3) ao lysato em uma razão final de lysate: MeOH: CHCl3 de 2:2:1 e agite vigorosamente para criar uma suspensão homogênea.</li>
		<li>Gire a 10.000 x g por 5 min para formar uma pelota ("panqueca") na interfase entre as fases aquosas e orgânicas.</li>
		<li>Incline o tubo e aspirar o máximo de solvente possível usando uma agulha ou uma ponta de carregamento de gel.</li>
		<li>Seque o ar da pelota de proteína por alguns minutos e lave-a delicadamente adicionando 600 μL de MeOH e misturando suavemente para evitar quebrar a pelota</li>
		<li>Retire cuidadosamente o MeOH restante e seque a pelota de proteína em uma bancada por aproximadamente 5 minutos.</li>
		<li>(Opcional) Realize um passo adicional de centrifugação para girar qualquer pelota quebrada após a lavagem MeOH para evitar a perda da amostra. NOTA: O experimento pode ser interrompido após a etapa de precipitação de CM. Uma vez obtida a pelota, pode ser armazenada em 500 μL de MeOH em -20 °C até uma semana.<ol>
<li>Dissolva a pelota de proteína em 200 μL de tampão 2SHB, vórticando a 42 °C/1500 rpm em um agitador térmico até que a pelota seja dissolvida.</li>
		</ol>
</li>
		<li>(Opcional) Incubar por mais 5-10 min em um banho de água sônica para dissolver a pelota. NOTA: O comprimento da sonagem varia dependendo da solubilidade do material. No entanto, a sonoração prolongada pode causar degradação proteica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare 0,2% de metanosulfonato de metila (MMTS) (v/v) em 2SHB adicionando 2 μL de MMTS a 998 μL de tampão 2SHB. NOTA: Use mms de 0,2% recém-preparados para cada experimento.</li>
	<li>Adicione 200 μL de 0,2% de MMTS em 2SHB a cada tubo a uma concentração final de 0,1% MMTS. Incubar por 15 min a 42 °C com agitação a 1500 rpm em um agitador térmico.</li>
</ol>3. Acila-RAC: Decote de hidroxilamina (HAM) e captura de proteínas S-aciadas
<ol><li>Repita precipitações de 3-4x CM conforme descrito acima para remover mmts. A remoção do MMTS pode ser estimada pela falta de odor distinto de MMTS. Após cada precipitação, dissolva a pelota em 100 μL de tampão 2SHB, vórticando a 42 °C/1500 rpm em um agitador térmico até que a pelota se dissolva e, em seguida, diluir com 300 μL de Tampão A.</li>
	<li>Após a precipitação final, dissolva amostras em 200 μL de tampão 2SHB conforme descrito acima e diluir com 240 μL de Buffer A.</li>
	<li>No caso de comparar as alterações na acilação s em resposta a várias condições de tratamento, meça novamente a concentração de proteínas e prossiga com a mesma quantidade de proteína para cada condição.</li>
	<li>Retenha 40 μL de cada amostra como um controle de entrada.</li>
	<li>Divida as amostras em duas partes iguais de 200 μL e marque tubos como "+ HAM" e "- HAM". Adicione 50 μL de 2 M HAM neutro recém-preparado (pH 7.0-7.5) a uma concentração final de 400 mM a um dos tubos (+ HAM) e 50 μL de 2 M neutros para o segundo tubo (- HAM), que será usado como um controle negativo. Proceder à adição de contas de thiopropyl-Sepharose (TS). NOTA: O experimento pode ser interrompido após qualquer uma das etapas de precipitação do CM. Uma vez obtida a pelota, pode ser armazenada em 500 μL de MeOH em -20 °C até uma semana. O pH neutro de 2 M HAM garante sua seletividade para a ligação de thioester acile-cisteína e deve ser cuidadosamente ajustado. Deve-se tomar cuidado ao manusear amostras no tampão 2SHB para evitar a perda da amostra devido à espuma excessiva. Todas as etapas seguintes são idênticas para amostras de HAM e + HAM.</li>
	<li>Adicione 30 μL de pasta-de-bico-ts a cada tubo e gire os tubos por 1-2 h em RT.</li>
	<li>Lave as contas TS 4x com 1% de SDS no Buffer A para remover o HAM residual.<ol>
<li>Gire suavemente todas as amostras de contas usando um microfuge por 1 min e apiratee cuidadosamente o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspensão das contas em 500 μL de 1% de SDS no Buffer A.</li>
		<li>Repita o passo 3.7.1-3.7.2 três vezes. NOTA: O thiopropyl-Sepharose ativado (TS) é fornecido congelado na presença de aditivos que devem ser lavados em pH neutro antes do acoplamento. A água destilada é recomendada para inchaço e lavagem. Pesar 0,1 g de contas e resuspender em 1 mL de água destilada e deixá-la inchar enquanto gira por 30 min-1 h em RT. Lave as contas 1x com tampão A e prepare um chorume com tampão A, em uma razão de 50% de médio assentado a 50% tampão. TS inchado pode ser armazenado em pH neutro na presença de 20% de etanol a 4 °C até uma semana. Não use azida de sódio como agente bacteriostático, uma vez que os íons de azida reagem com os grupos de dissulfeto de 2-piridinas. Para maior eficiência, prepare contas novas. Ao manusear as contas, a ponta de uma pipeta P200 pode ser cortada ligeiramente de modo a evitar qualquer dano. NOTA: O experimento pode ser interrompido em qualquer estágio após a precipitação de CM. A pelota pode ser guardada em 500 μL de MeOH em -20 °C até uma semana.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Elução e detecção de proteínas S-aciadas
<ol><li>Após a última lavagem, gire suavemente para baixo as contas como descrito acima e aspirar o máximo de sobrenatantes possível sem perturbar as contas.</li>
	<li>Recupere as proteínas das contas com tampão amostral de 4x SDS com DTT.<ol>
<li>Adicione 50 μL de tampão de amostra SDS 4x às contas e incubar a 80 °C, 1500 rpm por 15 min em um shaker térmico. Deixe os tubos esfriarem.</li>
		<li>Centrifugar as contas a 5.000 x g por 3 min para pellet completamente as contas e transferir as proteínas eluidas para um tubo fresco de 1,5 mL usando uma ponta de carregamento de gel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute o SDS-PAGE e analise a s-acilação das proteínas de interesse pela mancha ocidental.</li>
</ol>

<ol><li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).</li>
<li>Magee, A. I., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+classes+of+fatty+acid+acylated+proteins+exist+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells.</a> EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).</li>
<li>Fujimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-selectin+is+acylated+with+palmitic+acid+and+stearic+acid+at+cysteine+766+through+a+thioester+linkage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).</li>
<li>DeMar, J. C., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantitation+of+the+fatty+acids+composing+the+CoA+ester+pool+of+bovine+retina%2C+heart%2C+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).</li>
<li>Montigny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S+-Palmitoylation+and+S+-Oleoylation+of+Rabbit+and+Pig+Sarcolipin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).</li>
<li>Muszbek, L., Laposata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+modification+of+proteins+by+arachidonate+and+eicosapentaenoate+in+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).</li>
<li>Hallak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+binding+of+arachidonate+to+G+protein+alpha+subunits+of+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).</li>
<li>Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+protein-palmitoylating+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archive%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Discovery of protein-palmitoylating enzymes.</a> Pflügers Archive: European Journal of Physiology. , 1206(2008).</li>
<li>Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+palmitoylation%2C+raft+localization%2C+and+T+cell+signaling+by+2-bromopalmitate+and+polyunsaturated+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).</li>
<li>Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+palmitoylation+of+the+protein-tyrosine+kinase+p56lck%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).</li>
<li>Blanc, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SwissPalm%3A+Protein+Palmitoylation+database%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">SwissPalm: Protein Palmitoylation database.</a> F1000Research. 4 (0), 1-23 (2015).</li>
<li>O'Brien, P. J., Zatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acylation+of+bovine+rhodopsin+by+%5B3H%5Dpalmitic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid.</a> Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).</li>
<li>Drahansky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((We+are+IntechOpen+%2C+the+world%27s+leading+publisher+of+Open+Access+books+Built+by+scientists%5BTitle%5D)+AND+%22Intech%22%5BJournal%5D)">We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists.</a> Intech. 13, (2016).</li>
<li>Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+analogs+and+inhibitors+to+study+the+functional+significance+of+protein+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation.</a> Methods. 40 (2), 191-197 (2006).</li>
<li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).</li>
<li>Martin, B. R., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+profiling+of+protein+palmitoylation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells.</a> Nature Methods. 6, 135-138 (2009).</li>
<li>Rami, N., Hannoush, N. A. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+lipidome%3A+omega-alkynyl+fatty+acids+for+detection+and+cellular+visualization+of+lipid-modified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).</li>
<li>Kostiuk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+palmitoylated+mitochondrial+proteins+using+a+bio-orthogonal+azido-palmitate+analogue%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue.</a> FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).</li>
<li>Charron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Fluorescent+Detection+of+Protein+Fatty-Acylation+with+Chemical+Reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).</li>
<li>Roth, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+palmitoylation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein palmitoylation in yeast.</a> Cell. 125, 1003-1013 (2006).</li>
<li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).</li>
<li>Forrester, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+analysis+of+protein+S+-acylation+by+resin-assisted+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture.</a> Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Profiling+of+Cysteine-Based+Reversible+Modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications.</a> Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).</li>
<li>Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+era+of+protein+S-acylation%3A+spotlight+on+structure%2C+mechanisms%2C+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).</li>
<li>Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+brain+palmitoyl-proteome+using+both+acyl-biotin+exchange+and+acyl-resin-assisted+capture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li>
<li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+activation+of+murine+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and activation of murine lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).</li>
<li>Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+EBV-genome+negative+%22null%22+and+%22T%22+cell+lines+derived+from+children+with+acute+lymphoblastic+leukemia+and+leukemic+transformed+non-Hodgkin+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma.</a> International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).</li>
<li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).</li>
<li>Hundt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation-Dependent+Plasma+Membrane+Transport+but+Lipid+Raft-Independent+Signaling+by+Linker+for+Activation+of+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells.</a> Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).</li>
<li>Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+detergents+to+purify+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">The use of detergents to purify membrane proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).</li>
<li>Brdicka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoprotein+associated+with+glycosphingolipid-enriched+microdomains+%28PAG%29%2C+a+novel+ubiquitously+expressed+transmembrane+adaptor+protein%2C+binds+the+protein+tyrosine+kinase+csk+and+is+involved+in+regulation+of+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).</li>
<li>Akimzhanov, A. M., Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+transient+palmitoylation+of+the+tyrosine+kinase+Lck+mediates+Fas+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).</li>
<li>Stetsenko, A., Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+top+ten+detergents+used+for+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Crystals%22%5BJournal%5D)">An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization.</a> Crystals. 7 (7), (2017).</li>
<li>Adibekian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+characterization+of+a+triazole+urea+dual+inhibitor+for+lysophospholipase+1+%28LYPLA1%29+and+lysophospholipase+2+%28LYPLA2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Probe+Reports+from+the+NIH+Molecular+Libraries+Program%22%5BJournal%5D)">Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2).</a> Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).</li>
<li>Dekker, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibition+of+APT1+affects+Ras+localization+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling.</a> Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-background+acyl-biotinyl+exchange+largely+eliminates+the+coisolation+of+non-+s-acylated+proteins+and+enables+deep+s-acylproteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).</li>
<li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).</li>
<li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).</li>
</ol>

Nenhum conflito de interesse declarado.

Aqui, utilizamos com sucesso o ensaio acil-RAC para detectar a ciação S de proteínas selecionadas em células humanas cultivadas e células primárias derivadas do tecido do camundongo. Este método é simples, sensível e pode ser facilmente realizado com requisitos mínimos de equipamento usando técnicas padrão de bioquímica. Este método tem sido demonstrado para identificar com sucesso novas proteínas S-acylated, como a β-subunidade do sistema de translocação de proteínas (Sec61b), proteína ribossômica S11 (Rps11) e glutatio...

A s-acilação é uma modificação pós-translacional reversível que envolve a adição de uma cadeia de acila gordurosa a um resíduo de cisteína interna em uma proteína alvo através de uma ligação de thioester labile1. Foi relatado pela primeira vez como uma modificação de proteínas com palmitato, um ácido graxo saturado de 16carbonos 2, e, portanto, esta modificação é frequentemente referida como S-palmitoylation. Além do palmitato, as proteínas podem ser reversivelmente modificadas por uma variedade de ácidos graxos mais longos e curtos saturados (myristate e esteato), monoinsaturados (oleato) e poliinsaturados (aracidonate e eicosapentanoato) ácidos graxos3,4,5,6,7. Em células eucarióticas, a s-acilação é catalisada por uma família de enzimas conhecidas como aciltransferases de proteína DHHC e a reação reversa da deacinada cisteína é catalisada por thioesterases protéicas, a maioria das quais ainda permanecem enigmáticas8.
A labilidade da ligação tioester torna reversível essa modificação lipídica, permitindo-lhe regular dinamicamente o agrupamento de proteínas, a localização da membrana plasmática, o tráfico intracelular, as interações proteína-proteína e a estabilidade proteica9,10. Consequentemente, a s-acilação tem sido associada a vários distúrbios, incluindo a doença de Huntington, doença de Alzheimer e vários tipos de câncer (próstata, gástrico, bexiga, pulmão, colorretal), o que requer o desenvolvimento de métodos confiáveis para detectar essa modificação proteica pós-translacional11.
A rotulagem metabólica com palmitato radioativo([3H], [14C] ou [125I]) foi uma das primeiras abordagens desenvolvidas para ensaio de proteína S-acilação12,13,14. No entanto, os métodos baseados em rotulagem por radiorotulagem apresentam preocupações de saúde, não são muito sensíveis, demorados e detectam apenas lipidação de proteínas altamente abundantes15. Uma alternativa mais rápida e não radioativa à rotulagem radioativa é a rotulagem metabólica com sondas de ácidos graxos bioortogonais, que é usada rotineiramente para ensaio dinâmico da proteína S-acilação16. Neste método, um ácido graxo com um repórter químico (grupo alquina ou azida) é incorporado na proteína S-acylated por uma proteína aciltransferase. A reação de cicloadição de Azide-alquino Huisgen (química do clique) pode então ser usada para anexar um grupo funcionalizado, como um floróforo ou biotina, ao ácido graxo integrado que permite a detecção da proteína S-acylated17,18,19.
A troca de acilina (ABE) é um dos métodos bioquímicos amplamente utilizados para captura e identificação de proteínas S-acyladas que ignora algumas das deficiências da rotulagem metabólica, como a inadequação para amostras de tecido15. Este método pode ser aplicado para análise da s-acilação em uma variedade diversificada de amostras biológicas, incluindo tecidos e amostras de células congeladas20,21. Este método baseia-se no decote seletivo da ligação tioester entre o grupo acile e o resíduo de cisteína por hidroxilamina neutra. Os grupos thiol liberados são então capturados com um derivado de biotina tiol-reativo. As proteínas biotinyladas geradas são então purificadas por afinidade usando agarose de streptavidin e analisadas por imunoblotting.
Uma abordagem alternativa denominada captura assistida de acilina (Acyl-RAC) foi posteriormente introduzida para substituir a etapa de biotinylation por conjugação direta de cisteínas livres por uma resina tiol-reativa22,23. Este método tem menos passos em comparação com a ABE e da mesma forma pode ser usado para detectar aciação de proteína S em uma ampla gama de amostras1.
A Cil-RAC consiste em 4 passos principais (Figura 1), 1. Bloqueio de grupos de tiol livres; 2. Decote seletivo da ligação cisteine-acila thioester com hidroxilamina neutra (HAM) para expor grupos de cisteína thiol; 3. Captura das cisteínas lipidados com resina tiol-reativa; 4. Enriquecimento seletivo das proteínas S-acylated após elução com a redução do tampão.
As proteínas capturadas podem então ser analisadas por imunoblotting ou submetidas à espectrometria de massa (MS) para avaliar o proteoma s-acylado em uma variedade variada de espécies e tecidos22,24,25. Os locais individuais de s-acilação também podem ser identificados pela digestão da tripsina das proteínas capturadas e análise dos peptídeos resultantes por LC-MS/MS22. Aqui, demonstramos como a acil-RAC pode ser usada para detecção simultânea de s-acilação de múltiplas proteínas em uma linha celular e uma amostra de tecido.

<table><tbody><tr><td>comprimidos de coquetel de inibidor de protease completo</td><td>Sigma</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5424</td><td>Eppendorf</td><td>22620444</td><td></td></tr><tr><td>hidroxilamina (HAM)</td> <td>Sigma</td><td>159417</td><td></td></tr><tr><td>metil metantiossulfonato (MMTS)</td> <td>Sigma</td><td>64306</td><td></td></tr><tr><td>Mini rotador de tubo</td><td>LabForce</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ML211</td><td>Cayman</td><td>17630</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Therm Cool-Heat-Shake</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000-HC</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecil &beta;-D-maltosídeo (DDM)</td><td>Sigma</td><td>D641</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel Inibidor de Fosfatase 2</td><td>Sigma</td><td>P5726</td><td></td></tr><tr><td>Tiopropil-Sepharose 6B (TS)</td><td>Sigma</td><td>T8387</td><td></td></tr><tr><td>Ultrassom Quantrex Sonicator</td><td>L &; R</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detecção de proteína s-acilação usando captura assistida de acila-resina

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

A proteína S-acilação, também referida como S-palmitoylation, é uma modificação pós-translacional reversível de resíduos de cisteína com ácidos graxos de cadeia longa através de uma ligação de tiéster labile. A acilação s, que está emergindo como um mecanismo regulatório generalizado, pode modular quase todos os aspectos da atividade biológica das proteínas, desde a formação complexa até o tráfico de proteínas e a estabilidade proteica. O recente progresso na compreensão da função biológica da proteína S-acilação foi alcançado em grande parte devido ao desenvolvimento de novas ferramentas bioquímicas permitindo a detecção robusta e sensível da proteína S-acilação em uma variedade de amostras biológicas. Aqui, descrevemos a captura assistida por acilina (Acyl-RAC), um método recentemente desenvolvido baseado na captura seletiva de proteínas endógenas S-acylated por contas de Sefarrose reativas de tiol. Em comparação com as abordagens existentes, a Acyl-RAC requer menos passos e pode produzir resultados mais confiáveis quando associada à espectrometria de massa para identificação de novos alvos de acilação S. Uma grande limitação nesta técnica é a falta de capacidade de discriminação entre espécies de ácidos graxos ligadas a cisteínas através da mesma ligação thioester.

Seguindo o protocolo descrito acima, primeiro usamos acil-RAC para detectar simultaneamente a acilação de S de várias proteínas em células de Jurkat, uma linha de células T imortalizada originalmente derivada do sangue periférico de um paciente com leucemia de células T27. As proteínas de células T regulatórias previamente identificadas como S-acylated9,28,29 foram escolhidas para demonstrar a utilidade d...

A Cil-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) é um método altamente sensível, confiável e fácil de executar para detectar modificações lipídicas reversíveis de resíduos de cisteína (S-acilação) em uma variedade de amostras biológicas.

Detecção de Proteína S-Acilação usando captura assistida de acila-resina

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Captura assistida por acicl-resina ou Acyl-RAC é um método sensível e confiável que pode ser usado para detectar aciilação de proteínas em uma variedade de amostras biológicas. Este protocolo contorna algumas das limitações da rotulagem metabólica e rotulagem de rádio, e permite a detecção simultânea da S-acylation de múltiplas proteínas. Não só células vivas, mas também tecidos primários e amostras congeladas.A aciilação de S pode regular uma variedade de processos celulares, como tráfico de proteínas, segmentação de membrana plasmática, transdução de sinal, transporte de ferro e interações proteína-proteína. É importante usar a solução de hidroxilamina recém-preparada com pH cuidadosamente ajustado para cada experimento para garantir um decote eficiente e específico da ligação do tioester. Com uma demonstração deste método é fundamental para passos como clorofórmio, precipitação de metanol.A pelota de forma de panqueca obtida durante esta etapa deve ser manuseada com muito cuidado. Pode ser frágil e a perda parcial da amostra durante a etapa pode levar à recuperação desigual da amostra. Demonstrando o procedimento será Savannah West, uma estudante de pós-graduação do nosso laboratório.Para obter lisescelulares, colete as células de interesse em um tubo de centrífuga cônica. E remova qualquer detrito celular por centrifugação. Lave a pelota em 5 mililitros de PBS.E imediatamente resuspensa as células em 600 microliters de tampão de lise recém-preparado. Agitar a amostra a 1.500 revoluções por minuto em um agitador termo por 30 minutos a 4 graus Celsius. Antes de limpar os lises, detergente de pelota e material solúvel por centrifugação.No final da centrifugação, colete o lysate limpo em um tubo de microcentrífuga pré-resfriado de 1,5 mililitro no gelo. E realize um ensaio de ácido bradford ou bicinchonínico para estimar a concentração de proteína de acordo com os protocolos padrão. Adicione metanol e clorofórmio à lise a uma proporção de 2:1.Agite rigorosamente para criar uma suspensão homogênea e centrifugar a amostra para coletar uma pelota de proteína na interface entre as fases aquosa e orgânica. Inclinando o tubo, use uma agulha ou uma ponta de carregamento de gel para aspirar o máximo de solvente possível. O ar secou a pelota de proteína por alguns minutos.Antes de misturar suavemente o conteúdo do tubo com 600 microliters de metanol, tomando cuidado para não quebrar a pelota. Depois de remover cuidadosamente a lavagem do metanol, seque a pelota de proteína em uma parte superior do banco por aproximadamente cinco minutos. Em seguida, resuspenja a pelota de proteína em 200 microliters de tampão 2SHB.E vórtice a 42 graus Celsius e 1.500 revoluções por minuto em um agitador termo. Quando a pelota for dissolvida, adicione 200 microliters de 0,2% MMTS em 2SHB à amostra. E incubar a proteína por 15 minutos a 42 graus Celsius e 1.500 revoluções por minuto em um agitador termo.No final da incubação, realize precipitações de clorofórmio-metanol 3:4, como demonstrado. Para remover o MMTS, dissolva a pelota em 100 microliters de tampão 2SHB fresco com vórtice. E diluir a amostra com 300 microliters de tampão A após cada precipitação.Após a precipitação final, dissolva as amostras em 200 microliters de tampão 2SHB e diluir com 240 microliters de buffer A.Meça novamente a concentração proteica e reserve 40 microliters de cada amostra como controles de entrada. As amostras divididas em dois volumes iguais de 200 microliters. E marque os tubos como mais hidroxilamina e menos hidroxilamina.Adicione 50 microliters de hidroxilamina neutra recém-preparada a uma concentração final de 400 mililitros ao tubo de hidroxilamina plus. E 50 microliters de dois cloretos de sódio molar neutro para o controle negativo, um tubo de hidroxilamina menos. Em seguida, adicione 30 microliters de chorume de contas TS a cada tubo.E gire os tubos por uma a duas horas em temperatura ambiente. No final da incubação lave as contas quatro vezes com 1%SDS no buffer A para remover qualquer hidroxilamina residual. Após a última lavagem, lave todas as amostras de contas com três microcentrifugações suaves de um minuto.Aspirando cuidadosamente os supernantes e reutilizando as contas em 500 microlitres de 1%SDS no buffer A em cada lavagem. Após a última lavagem, gire suavemente as contas como demonstrado. E aspirar o máximo de supernascida possível sem perturbar as contas.Para recuperar as proteínas das contas, adicione 50 microliters de 4%SDS tampão de amostra em cada tubo e incubar as amostras a 80 graus Celsius e 1.500 revoluções por minuto durante 15 minutos em um agitador termo. No final da incubação, deixe as amostras esfriarem antes de centrifugar para pastar completamente as contas. Em seguida, use uma ponta de carregamento de gel para transferir as proteínas elucidadas em novos tubos de 1,5 mililitro.E execute as amostras em um gel SDS-PAGE para analisar a S-acylation das proteínas de interesse por manchas ocidentais. Tyrosine quinase Lck pode ser detectado em lysates tratados com hidroxilamina molar neutra. para cortar a ligação thioester entre resíduos de cisteína e a moiety ácido graxo.Descascando e rerobinando com anticorpos contra proteínas Fyn e LAT demonstram que o ensaio de captura assistida aciila-resina pode ser usado para analisar a aciilação de múltiplas proteínas ao mesmo tempo. Além disso, a aciilação de Lck, Fyn e LAT pode ser prontamente detectada em esplenócitos de camundongos primários. Indicando que esta modificação é conservada entre duas espécies.Além da identificação de novas proteínas S-acylated, este método também pode ser usado para avaliar mudanças na proteína S-acylation em diferentes condições biológicas. O número de proteínas S-acylated recém-identificadas aumentou tremendamente após o double-up significou uma técnica rápida e confiável, como a Acyl-RAC. Além da identificação de novas proteínas S-acylated, este método também pode ser usado para avaliar mudanças na proteína S-acylation em diferentes condições biológicas.

detection-of-protein-s-acylation-using-acyl-resin-assisted-capture

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Compostos de captura são trifuncional pequenas moléculas para reduzir a complexidade do proteoma por funcionais reversíveis interação molécula de proteína pequena seguido por foto-reticulação e purificação. Aqui usamos um Composto de captura...

Perfil de metiltransferases e Outros S-Adenosil- L Homocisteína-Proteínas de Ligação de captura por Espectrometria de Massa Compound (CCMS)

As proteínas de superfície são biologicamente importantes e amplamente glicosilada. Apresentamos aqui uma abordagem de captura de glycopeptide para solubilizar, enriquecer e deglycosylate estas proteínas para análise proteômica baseada LC-MS fáceis.

Captura de glicopeptídeos de Superfície Celular Proteômica

Este protocolo descreve as etapas necessárias para executar ensaios de desacetilação in vitro e in vivo, a fim de estabelecer o papel das proteínas como substratos específicos de desacetilação para sirtuínas e estudar ainda mais o papel da acetilação reversível - lisina como uma modificação pós-tradução.

Desacetilação Ensaios para desvendar a interação entre Sirtuins (SIRT2) e Proteína-substratos específicos

Descrevemos um método para gerar linhagens celulares estáveis induzíveis marcadas com localização e purificação de afinidade (LAP) para investigar a função proteica, localização subcelular espaço-temporal e redes de interação proteína-proteína.

Induzíveis linhas celulares estáveis ​​marcado-LAP para investigar a função da proteína, Spatiotemporal Localização e redes de interação de proteínas

Ácido siálico é uma monossacarídeo-unidade típica encontrada em glicoconjugados. Está envolvido em uma infinidade de interações moleculares e celulares. Aqui nós apresentamos um método para modificar a expressão de superfície de ácido siálico célula usando glycoengineering metabólica com derivados de N- acetylmannosamine.

Glycoengineering metabólica do ácido siálico usando N-acil-modificado Mannosamines

Investigando várias, modificações borne-translational endógenas para uma proteína do alvo podem ser extremamente desafiadoras. Técnicas descritas aqui utilizam um sistema de buffer e filtro de Lise otimizado desenvolvido com PTM-direcionamento específico, matrizes de afinidade para detectar as modificações fosforilação acetilação, ubiquitination, SUMOylation 2/3 e tirosina para um destino proteína, usando um sistema único e simplificado.

Utilizando um sistema de enriquecimento de imunoprecipitação abrangente para identificar um perfil endógena modificação pós-traducional de proteínas alvo

Aqui, apresentamos a quantificação imparcial de ocupação acetilação e/ou succinylation proteína site-specific (estequiometria) de um proteome inteira através de uma análise ratiometric de modificações endógenas às modificações introduzidas após quantitativa química acilação usando anidridos rotulado de isótopo estáveis. Em combinação com a espectrometria de massa sensível aquisição de dados independente, obtêm-se medições de ocupação do local exato.

Quantificação de Estoicometria de Acetilação e Succinilação de Lisinas Proteicas em Sítios Específicos Usando Espectrometria de Massa de Aquisição de Dados Independente

Apresentamos um método para a purificação, detecção e identificação de peptídeos diGly que se originam de proteínas ubiquitinadas de amostras biológicas complexas. O método apresentado é reprodutível, robusto e supera os métodos publicados em relação ao nível de profundidade da análise ubiquitinome.

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

Este fluxo de trabalho descreve o desempenho do enriquecimento tempo e econômico de múltiplas modificações pós-translacionais de proteínas (PTMs) simultaneamente para análise proteômica global quantitativa. O protocolo utiliza o enriquecimento ptm em nível de peptídeo com múltiplos anticorpos conjugados, seguido pela análise de espectrometria de aquisição independente de dados para obter insights biológicos sobre o crosstalk PTM.

Enriquecimento de afinidade simultânea de duas modificações pós-translacionais para quantificação e localização do site

O estudo da aciilação gordurosa tem implicações importantes nas interações e doenças das proteínas celulares. Apresentado aqui é um protocolo modificado para melhorar a detecção de química de cliques de proteínas acicladas gordurosas, que podem ser aplicadas em vários tipos celulares e combinadas com outros ensaios, incluindo perseguição de pulso e espectrometria de massa.

Incorporação otimizada de Análogos de Ácido Graxo Alkynyl para a detecção de proteínas aciclantes gordurosas usando a Química do Clique

A oxidação do tiol proteico tem implicações significativas em condições fisiológicas e fisiopatológicas normais. Descrevemos os detalhes de um método proteômico redox quantitativo, que utiliza captura assistida por resina, marcação isobárica e espectrometria de massa, permitindo a identificação e quantificação específicas do local de resíduos de cisteína oxidada reversivelmente de proteínas.

Captura assistida por resina juntamente com marcação de massa em tandem isobárica para quantificação multiplexada da oxidação de proteína tiol

Aprenda a técnica Acyl-RAC para detectar S-acilação de proteínas em amostras biológicas variadas. Este método sensível permite análise simultânea de múltiplas proteínas em células, tecidos primários e amostras congeladas.

Detecção de Proteína S-Acilação usando captura assistida de acila-resina

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