Name: Ensaio de mudança de gel de troca acila-PEGyl para determinação quantitativa de palmitoilação de proteínas de membrana cerebral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Aprenda o ensaio APEGS para determinar a palmitoilação de proteínas de membrana cerebral em lisados de camundongo sem purificação por afinidade. Este método utiliza mudanças na mobilidade em gel para análise rápida.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores agradecem a K. Woolfrey por conselhos e contribuições sobre o ensaio da APEGS. Esses estudos foram financiados por bolsas de pesquisa para a E.D. da Whitehall Foundation e do NIH-NIMH (1R01MH119347).

Todos os procedimentos animais seguiram as diretrizes estabelecidas pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais Institucionais da Universidade da Califórnia, Davis.
1. Preparação de membranas cerebrais do camundongo
<ol><li>Decapitar o rato usando um aparelho de guilhotina e dissecar o cérebro rapidamente (em <1 min, se possível, para minimizar as alterações de palmitoilação que podem ocorrer durante o procedimento de dissecção). Homogeneize imediatamente em 10 mL de tampão de homogeneização(Tabela 1)em um homogeneizador de vidro (~12 traços) no gelo.</li>
	<li>Linsatos de centrífuga saem por 15 min a 1.400 x g a 4 °C. Transfira o sobrenadante para um novo tubo no gelo. Ressuspensão da pelota (~6 traçados) em um volume igual de tampão de homogeneização e centrífuga a 710 x g por 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Combine os sobrenatantes do passo 1.2 e centrífugas a 40.000 x g por 20 min a 4 °C.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante (fração citossólica) e resuspenda a fração da membrana pelleted (P2) no tampão de homogeneização. NOTA: As amostras podem ser congeladas e armazenadas a -80 °C para uso posterior.</li>
	<li>Realize um ensaio de ácido bicinchonínico (BCA) para quantitar os níveis de proteína. Para o ensaio APEGS, comece com ~100-200 mgs de proteína (máximo de 250 mgs) em um volume de 470 μL de tampão A(Tabela 1)em um tubo de 1,5 mL. Sonicate e centrífuga em >13.000 x g por 10 min a 25 °C para remover proteína insolúvel. Transfira a proteína solubilizada para um novo tubo de 1,5 mL.</li>
</ol>2. Ensaio de troca acil-PEGyl (APEGS)
<ol><li>Interrompa as ligações de dissulfeto e bloqueie cisteínas livres.<ol>
<li>Interromper as ligações de dissulfeto incubando em 25 mM tris (2-carboxyethyl)fosfina (TCEP; 25 μL, adicionado a partir de uma solução de estoque; Tabela 1) por 60 min a 55 °C.</li>
		<li>Bloquear cisteínas livres com N-etilmaleimida de 50 mM (NEM; 12,5 μL, adicionadas a partir de uma solução de estoque; Tabela 1) em temperatura ambiente por 3 h. NOTA: A reação pode ser estendida durante a noite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar precipitação de metanol clorofórmio (CM).<ol>
<li>Transfira a solução proteica de tubo de 1,5 mL para um tubo de polipropileno ou vidro que pode ser centrifugado em um rotor de balde balançando a uma velocidade modesta. Um tubo de 5 mL é ideal. Adicione quatro volumes (2 mL) de metanol (MeOH) e vórtice brevemente.</li>
		<li>Adicione dois volumes (1 mL) de clorofórmio e vórtice brevemente.</li>
		<li>Adicione três volumes (1,5 mL) de dH2O e vórtice brevemente.</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 3.000 x g por 30 min a 25 °C em um rotor de balde balançando.</li>
		<li>Remova cuidadosamente e descarte a fase superior.</li>
		<li>Adicione 3 volumes (1,5 mL) de MeOH e misture suavemente, mas cuidadosamente, tomando cuidado para não fragmentar a panqueca de proteína opaca.</li>
		<li>Centrifugação a 3.000 x g por 10 min a 25 °C em um rotor de balde balançando.</li>
		<li>Usando um tubo sorológico de vidro, remova o máximo possível da fase superior sem perturbar a panqueca de proteína.</li>
		<li>Enxágüe cuidadosamente a pelota com 1 mL de MeOH.</li>
		<li>Seque a pelota por pelo menos 10 min. NOTA: A pelota seca pode ser armazenada a -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar decotes de ligações palmitoyl-thioester com hidroxilamina (NH2OH, HAM).<ol>
<li>Resuspender a proteína precipitar em 125 μL de tampão A e sônica brevemente. Centrifugação a >13.000 x g por 10 min a 25 °C para remover material insolúvel. Transfira a proteína solubilizada para um novo tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicionar 375 μL de buffer H (HAM+; Tabela 1) ou tampão T (HAM-; Tabela 1) e incubar amostras para 60 min a 25 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita a precipitação cm descrita na etapa 2.2. NOTA: A pelota seca pode ser armazenada a -20 °C.</li>
	<li>Adicione mPEG a cisteínas desprotegidas.<ol>
<li>Ressuspensão da pelota em 100 μL de tampão A contendo 10 mM TCEP. Transfira para um tubo de 1,5 mL. NOTA: É normal que a perda significativa de proteína tenha ocorrido durante as etapas de precipitação de CM. Todas as etapas subseqüentes serão realizadas em um tubo de 1,5 mL, restringindo o volume de proteína a um máximo de ~120-130 μL. Isso reduzirá a perda de proteínadurante a precipitação final de CM.</li>
		<li>Adicionar 20 mM mPEG-5k (25 μL, adicionado a partir de uma solução de estoque; Tabela 1) à amostra de proteínas e mistura por pipetting. Incubar por 60 min a 25 °C com rotação de extremidade superior.</li>
		<li>Para remover mPEG-5k não incorporado, realize a precipitação cm conforme descrito na etapa 2.2 utilizando estes volumes ajustados: 4 volumes de MeOH (500 μL), 2 volumes de clorofórmio (250 μL) e 3 volumes de dH2O (375 μL). Centrifugação a >13.000 x g por 10 min a 25 °C.</li>
		<li>Remova cuidadosamente a fase superior como antes, evitando a panqueca espessa e floculente. Adicione 1 mL de MeOH e misture delicadamente, mas completamente. Centrifugação a >13.000 x g por 10 min a 25 °C.</li>
		<li>Retire cuidadosamente o sobrenadante e enxágue a pelota com 1 mL de MeOH. Centrifugação a >13.000 x g por 10 min a 25 °C. Pelota seca a ar. NOTA: A pelota seca pode ser armazenada a -20 °C.</li>
		<li>Ressuspensão da pelota seca em 50 μL de tampão A (sem TCEP ou qualquer agente redutor). Reserve 5 μL para quantificar proteína BCA. Após a quantificação, adicione uma quantidade apropriada de tampão de amostra de 4x Laemmli e, dependendo da proteína de interesse, potencialmente aqueça a amostra a 70-100 °C por 10 min. NOTA: A ebulição pode causar agregação de algumas proteínas de membrana.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Análise de manchas ocidentais de proteínas PEGylated
<ol><li>Carregue a amostra em um gel de gel de poliacrilamida de sulfato de dodecil de sódio13. NOTA: Neste protocolo foi utilizado 10% de poliacrilamida.</li>
	<li>Use protocolos padrão de separação, transferência e detecção para manchas ocidentais14.</li>
	<li>Use a densitometria14 para determinar as quantidades relativas de proteínas PEGylated versus nonPEGylated.</li>
</ol>

<ol><li>Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+does+S-palmitoylation+do+to+membrane+proteins%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">What does S-palmitoylation do to membrane proteins?</a> FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).</li>
<li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).</li>
<li>Globa, A. K., Bamji, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+palmitoylation+in+the+development+and+plasticity+of+neuronal+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).</li>
<li>Thomas, G. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation-dependent+regulation+of+glutamate+receptors+and+their+PDZ+domain-containing+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners.</a> Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).</li>
<li>Kalashnikova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SynDIG1%3A+an+activity-regulated%2C+AMPA-+receptor-interacting+transmembrane+protein+that+regulates+excitatory+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development.</a> Neuron. 65, 80-93 (2010).</li>
<li>Kaur, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Dependent+Palmitoylation+Controls+SynDIG1+Stability%2C+Localization%2C+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function.</a> Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).</li>
<li>Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylated+proteins%3A+purification+and+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Palmitoylated proteins: purification and identification.</a> Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).</li>
<li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).</li>
<li>Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Screening+of+Depalmitoylating+Enzymes+and+Evaluation+of+Their+Activities+by+the+Acyl-PEGyl+Exchange+Gel-Shift+%28APEGS%29+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).</li>
<li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).</li>
<li>Percher, A., Thinon, E., Hang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-Tag+Labeling+Using+Acyl-PEG+Exchange+for+the+Determination+of+Endogenous+Protein+S-Fatty+Acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation.</a> Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).</li>
<li>Yokoi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+PSD-95+Depalmitoylating+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes.</a> Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Separating+Protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Science+Education+Database.+The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Science Education Database. The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).</li>
<li>Chenaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+SynDIG1+Reduces+Excitatory+Synapse+Maturation+But+Not+Formation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li>
<li>Matt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SynDIG4%2FPrrt1+Is+Required+for+Excitatory+Synapse+Development+and+Plasticity+Underlying+Cognitive+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function.</a> Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).</li>
<li>Purkey, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKAP150+Palmitoylation+Regulates+Synaptic+Incorporation+of+Ca%282%2B%29-Permeable+AMPA+Receptors+to+Control+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP.</a> Cell Reports. 25, 974-987 (2018).</li>
<li>Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+palmitoyl+acyltransferase+DHHC2+regulates+recycling+endosome+exocytosis+and+synaptic+potentiation+through+palmitoylation+of+AKAP79%2F150%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150.</a> Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Em nosso trabalho anterior, utilizamos o ensaio ABE para demonstrar que o SynDIG1 é palmitoilado em dois resíduos de Ciscos de justa-transmembrana conservados (encontrados em todas as proteínas SynDIG) de forma dependente da atividade para regular a estabilidade, a localização e a função6. Uma limitação é que o ensaio ABE requer purificação de afinidade com resinas agaroseconjugadas aos moieties avidin como a etapa final do procedimento, resultando em perda significativa de sinal que complica mati...

S-palmitoylation é uma modificação pós-translacional reversível de proteínas-alvo que regula a associação estável de membranas, tráfico de proteínas e interações proteína-proteína1. Envolve a adição de um moiety palmitato de 16 carbonos a resíduos de cisteína via ligação thioester catalisado por enzimas palmitoxil aciltransferase (PAT). Muitas proteínas sinápticas no cérebro são palmitoiladas, incluindo AMPA-Rs e PSD-95, de forma dependente da atividade para regular a estabilidade, a localização e a função2,3,4. Alterações nos níveis de AMPARs sinápticas no PSD por interação de fatores auxiliares com andaimes sinápticos como o PSD-95 subjacentes à plasticidade sináptica; assim, métodos para determinar o estado de palmitoilação de proteínas sinápticas fornecem uma visão importante sobre mecanismos de plasticidade sináptica.
Anteriormente, identificamos a família SynDIG de quatro genes (SynDIG1-4) codificando proteínas transmembranas específicas do cérebro que se associam às AMPARs5. A superexpressão ou derrubada do SynDIG1 em neurônios hipocampais de ratos dissociados aumenta ou diminui, respectivamente, o tamanho e o número da sinapse AMPA-R em ~50% conforme detectado usando imunocitoquímica e eletrofisiologia5. Utilizamos o ensaio de troca de acilina (ABE) para demonstrar que o SynDIG1 é palmitoilado em dois resíduos de Cisa justa-transmembrana conservados (encontrados em todas as proteínas SynDIG) de forma dependente da atividade para regular a estabilidade, a localização e a função6. O ensaio ABE baseia-se na troca de biotina em cisteínas protegidas por modificação e posterior purificação de afinidade7. Aqui, descrevemos uma abordagem bioquímica inovadora, o ensaio de mudança de gel de troca acil-PEGyl (APEGS)8,,9,,10,,11,,12,que não requer purificação de afinidade e, em vez disso, utiliza mudanças na mobilidade do gel para determinar o número de modificações para uma proteína de interesse. O protocolo é descrito para investigação de proteínas endógenas de membrana do cérebro do camundongo para as quais anticorpos adequados estão disponíveis.

<table><tbody><tr><td>Hidroxilamina (HAM)</td><td>ThermoFisher</td><td>26103</td><td></td></tr><tr><td>Metoxi-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)</td><td>NOF</td><td>ME-050MA</td><td>MW ~5000 kDa</td></tr><tr><td>Microfuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>ou equipamento equivalente</td></tr><tr><td>N-etilmalemida (NEM)</td><td>Calbiochem</td><td>34115</td><td>Altamente tóxico.</td></tr><tr><td>Gerador de imagens ópticas para densitometria</td><td>Azure Biosystems</td><td>Sapphire Biomolecular Imager</td><td>ou equipamento equivalente</td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno com tampa</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-1D</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas (vidro)</td>Centrífuga de mesa <td>Fisher Scientific</td><td>13-678-27D</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman</td><td>Allegra X-15R</td><td>ou equipamento equivalente</td></tr><tr><td>Cloridrato de tris(2-carboxietil) fosfina (TCEP)</td><td>EMD Millipore</td><td>580560</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaio de mudança de gel de troca acila-pegyl para determinação quantitativa de palmitoilação de proteínas de membrana cerebral

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Acredita-se que alterações dependentes da atividade nos níveis de receptores AMPA sinápticos (AMPARs) dentro da densidade postynaptic (PSD) representem um mecanismo celular para aprendizagem e memória. Palmitoilação regula a localização e a função de muitas proteínas sinápticas, incluindo AMPA-Rs, fatores auxiliares e andaimes sinápticos de forma dependente da atividade. Identificamos a família de genes induzidos por diferenciação sinapse (SynDIG) de quatro genes (SynDIG1-4) codificando proteínas transmembranas específicas do cérebro que se associam às AMPARs e regulam a força da sinapse. SynDIG1 é palmitoilado em dois resíduos de cisteína localizados nas posições 191 e 192 na região justxta-transmembrana importante para o desenvolvimento da sinapse excitatória dependente da atividade. Aqui, descrevemos uma abordagem bioquímica inovadora, o ensaio acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS), para investigar o estado de palmitoilação de qualquer proteína de interesse e demonstrar sua utilidade com a família SynDIG de proteínas em lysates cerebrais de camundongos.

A imunoaspiração com anticorpos contra a proteína de interesse revela o estado palmitoylated (não, sozinho, duplamente, etc.) em lysatos cerebrais de camundongos determinados por mudança de mobilidade em comparação com amostras em que o HAM não foi incluído. Anteriormente, tínhamos demonstrado que o SynDIG1 foi palmitoilado em dois locais usando o ensaio ABE6; no entanto, não pudemos determinar se ambos os locais foram modificados no tecido cerebral. Aqui mostramos...

Palmitoilação implica a incorporação de um moiety palmitato de 16 carbonos a resíduos de cisteína de proteínas alvo de forma reversível. Aqui, descrevemos uma abordagem bioquímica, o ensaio de mudança de gel de troca acil-PEGyl (APEGS), para investigar o estado de palmitoilação de qualquer proteína de interesse em lysatos cerebrais de camundongos.

Ensaio de mudança de gel de troca acila-PEGyl para determinação quantitativa de palmitoilação de proteínas de membrana cerebral

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

Este método bioquímico permite a determinação do estado de palmitoylation de qualquer proteína de membrana expressa no cérebro para a qual um anticorpo adequado está disponível. A principal vantagem dessa técnica é que ela não requer purificação de afinidade e, em vez disso, utiliza mudanças na mobilidade do gel para determinar o número de modificações de uma proteína de interesse. Depois de dissecar o cérebro, homogeneize-o imediatamente em 10 mililitros de tampão de homogeneização em um homogeneizador de vidro no gelo.Usando aproximadamente 12 traçados, centrifugar os lysates por 15 minutos a 1400 vezes G, e quatro graus Celsius. Transfira o supernatante para um novo tubo no gelo. Resuspenque a pelota em 10 mililitros de tampão de homogeneização.Homogeneizá-lo usando aproximadamente seis golpes. Centrifugar a suspensão a 710 vezes G e 4 graus Celsius por 10 minutos. Combine os supernacantes e centrifuá-los a 40.000 vezes G e quatro graus Celsius por 20 minutos.Descarte o supernatante e resuspenque a fração de membrana pelleted em um tampão de homogeneização, quebrando a pelota com uma ponta de pipeta e pipeta para cima e para baixo. Realize o ensaio ABCA para quantificar os níveis de proteína. Para realizar o ensaio APEGS, coloque 470 microliters de tampão A em um tubo de 1,5 mililitro e adicione aproximadamente 100 a 200 miligramas de proteína.Sonicar o tubo e, em seguida, separar a proteína insolúvel por centrifugação do tubo a 25 graus Celsius e um mínimo de 13.000 vezes G por 10 minutos. Transfira a proteína solubalizada para um novo tubo de 1,5 mililitro. Primeiro, interrompa as ligações de dissulfeto incubando a proteína solubalizada em 25 microliters de TCEP por 60 minutos a 55 graus Celsius.Em seguida, bloqueie cisteínas livres incubando a solução com 12,5 microliters da solução de estoque de NEM por três horas em temperatura ambiente. Em seguida, comece o processo de precipitação de metanol clorofórmio. Transfira a solução proteica do tubo de 1,5 mililitro para um tubo de polipropileno ou vidro que pode ser centrifugado em um rotor de balde balançando a uma velocidade modesta.Adicione dois mililitros de metanol e vórtice brevemente. Adicione um mililitro de clorofórmio e vórtice brevemente. Em seguida, adicione 1,5 mililitros de água deionizada e vórtice brevemente novamente.Se necessário, inverta o tubo para garantir a mistura completa. Centrifugar as amostras a 3000 vezes G e 25 graus Celsius por 30 minutos em um rotor de balde balançando. Remova e descarte cuidadosamente a fase superior da solução em um tubo.Adicione 1,5 mililitros de metanol. Misture suavemente, mas completamente, por uma suave inversão do tubo, tomando cuidado para não fragmentar a panqueca de proteína opaca. Centrifugar a amostra a 3000 vezes G e 25 graus Celsius por 10 minutos em um rotor de balde balançando.Usando uma pipeta sorológica de vidro, remova o máximo possível da fase superior da solução sem perturbar a panqueca de proteína. Enxágue cuidadosamente a pelota com um mililitro de metanol e deixe-a secar pelo menos por pelo menos 10 minutos. Com a precipitação de metanol clorofórmio completa, inicie o decote das ligações de tioester palmitoyl, reutilizando o precipitado de proteína em 125 microliters de tampão A.Transfira para um novo tubo de 1,5 mililitro.Sonicar o tubo brevemente e, em seguida, centrifuá-lo a 13.000 vezes G ou superior e 25 graus Celsius por 10 minutos para remover material insolúvel. Transfira a proteína solubalizada para novos tubos de 1,5 mililitro e adicione 375 microliters de tampão H ou tampão T.Depois de incubar as amostras por 60 minutos à temperatura ambiente, repita a precipitação de metanol de clorofórmio. Para adicionar m-PEG a cisteínas desprotegidas, comece reutilizando a pelota em 100 microliters de tampão A contendo 10 mil ou mais DEXP.Em seguida, transfira a suspensão para um tubo de 1,5 mililitro. Adicione 25 microliters de solução m-PEG 5K e misture por pipetação. Incubar em temperatura ambiente com final sobre rotação final.Após 60 minutos de incubação, remova m-PEG 5K não incorporado realizando precipitação de metanol clorofórmio novamente. Centrífuga a mais de 13.000 vezes G e 25 graus Celsius por 10 minutos. Remova cuidadosamente a fase superior como antes, evitando a panqueca espessa e floculante.Adicione um mililitro de metanol e misture suavemente, mas completamente. Centrífuga a mais de 13.000 vezes G e 25 graus Celsius por 10 minutos. Remova cuidadosamente o supernasce e enxágue a pelota com um mililitro de metanol.Novamente, centrífuga superior a 13.000 vezes G e 25 graus Celsius por 10 minutos. Após a secagem do ar da pelota, resuspenque-a em 50 microliters de tampão A sem TCEP ou qualquer agente redutor. Reserve 5 microliters da solução para a quantitação da proteína BCA.Após a quantitação, adicione uma quantidade apropriada de tampão amostral de Laemmli 4x. Carregue a amostra em um gel de página SDS. Use protocolos de transferência e detecção padrão de separação para manchas ocidentais.Para investigar o estado de palmitoição das proteínas SynDIG, frações de membrana P2 de cérebros de camundongos homogeneizados foram submetidas ao ensaio APEGS. A separação e sondagem com anticorpos demonstraram que SynDIG1, SynDIG4 Prrt1 e Prrt2 são palmitoylated no cérebro do camundongo. O objetivo da precipitação de metanol clorofórmio é evitar que um produto químico, como o NEM, interfira na próxima etapa do protocolo.Uma precipitação adequada de metanol de clorofórmio removerá produtos químicos indesejáveis, minimizando a perda de proteínas. Este método pode ser aplicado a lises cerebrais de camundongos de diferentes idades ou de diferentes regiões cerebrais para investigar as regulamentações espaço-temporais da palmitoylation.

acyl-pegyl-exchange-gel-shift-assay-for-quantitative-determination

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Endocitose regulada governa o celular níveis de expressão de superfície da maioria das proteínas da membrana. Aqui nós utilizamos redutível, membrana reagentes Biotinilação impermeant para medir a taxa endocítica do transportador de dopamina (DAT), uma proteína de membrana politópica. O método facilita uma abordagem simples para medir a taxa de proteínas mais endocítica membrana plasmática.

Taxas de medição de plasma Proteína de membrana endocítica por Biotinilação reversível

O vídeo demonstra a análise do estado de palmitoilação de proteínas da membrana celular isoladas do tecido cerebral de camundongos. O processo envolve expor as cisteínas não palmitoiladas e bloqueá-las, usando um polímero que se liga às cisteínas palmitoiladas, auxiliando na avaliação do estado de palmitoilação das proteínas isoladas.

Avaliando o estado de palmitoilação de proteínas da membrana celular do tecido cerebral de camundongos

A adição de palmitato reversível às proteínas é um importante regulador do tráfico intracelular de proteínas. Isto é de particular interesse, onde os neurónios em muitas proteínas sinápticas são palmitoilada. Nós utilizamos um método simples bioquímica para detectar proteínas palmitoilados em neurónios em cultura, que podem ser adaptadas para vários tipos de células e tecidos.

Detecção de palmitoylation proteína em neurônios cultivados por imunoprecipitação e Acil-Biotina Exchange (ABE)

Tráfico de membrana neuronal controla dinamicamente membrana disponibilidade de proteína plasmática e significativamente impactos neurotransmissão. Até à data, tem sido um desafio para medir tráfico endocítico neuronal em neurônios adultos. Aqui, descrevemos um método altamente eficaz, quantitativo para medir as mudanças rápidas na expressão de proteínas de superfície ex vivo em fatias cerebrais agudas.

Cérebro Fatia Biotinilação: Uma<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Abordagem medir Região específicas do tráfego de proteínas de membrana plasmática em adultos Neurônios

Um protocolo de extração de proteínas comum utilizando tampão uréia / tiouréia / SDS para tecido cerebral humano e camundongos permite indentification de proteínas por 2D-DIGE e sua posterior caracterização por mini-immunoblotting 2DE. Este método permite a obtenção de resultados mais reprodutíveis e confiáveis ​​a partir de biópsias humanos e modelos experimentais.

Proteína Consenso Brain-derivada, protocolo de extração para o Estudo do cérebro humano e murino Proteome Usando ambas 2D DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

A Cil-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) é um método altamente sensível, confiável e fácil de executar para detectar modificações lipídicas reversíveis de resíduos de cisteína (S-acilação) em uma variedade de amostras biológicas.

Detecção de Proteína S-Acilação usando captura assistida de acila-resina

Apresentamos aqui um ensaio de fluorescência sensível para monitorar a atividade da apolipoproteína N-aciltransferase usando peptídeo diacilglicerilo e alquino-fosfolipídios como substratos com click-química.

Ensaio fluorométrico baseado em química de cliques para apolipoproteína N-aciltransferase da caracterização enzimática à triagem de alto rendimento

O estudo da aciilação gordurosa tem implicações importantes nas interações e doenças das proteínas celulares. Apresentado aqui é um protocolo modificado para melhorar a detecção de química de cliques de proteínas acicladas gordurosas, que podem ser aplicadas em vários tipos celulares e combinadas com outros ensaios, incluindo perseguição de pulso e espectrometria de massa.

Incorporação otimizada de Análogos de Ácido Graxo Alkynyl para a detecção de proteínas aciclantes gordurosas usando a Química do Clique

Aqui, descrevemos protocolos usando sensores lipídicos fluorescentes e lipossomos para determinar se uma proteína extrai e transporta fosfatidylserina ou fosfattidylinositol 4-fosfato in vitro.

Medidas baseadas em fluorescência de fosfatidaserina/fosfattidylinositol 4-fosfato troca entre membranas

Descrevemos um método para o uso de ciclodextrina para mediar a troca entre lipídios da membrana plasmática com lipídios exógenos. Essa técnica pode ser combinada com experimentos que estudam proteínas transmembranares, que se comportam de maneira diferente em ambientes semelhantes a jangadas lipídicas do que em ambientes não semelhantes a jangadas.

Ensaio de Troca Lipídica em Células Vivas

Este estudo apresenta métodos experimentais para caracterizar bioquimicamente o GFAP e suas mutações causadoras de doenças, com foco na montagem, agregação e modificação pós-translacional de filamentos. Proteínas GFAP de alta pureza foram analisadas, revelando insights sobre os mecanismos da doença de Alexander que podem fornecer uma estrutura para estudar potenciais alvos terapêuticos e compreender mutações GFAP e distúrbios relacionados.

Abordagens experimentais para análise bioquímica da proteína ácida fibrilar glial e suas variantes associadas a doenças

Aprenda o ensaio APEGS para determinar a palmitoilação de proteínas de membrana cerebral em lisados de camundongo sem purificação por afinidade. Este método utiliza mudanças na mobilidade em gel para análise rápida.

Ensaio de mudança de gel de troca acila-PEGyl para determinação quantitativa de palmitoilação de proteínas de membrana cerebral

Explorar mais vídeos