Medição da Toxicidade do Peptídeo RAN em C. elegans
30 de abril de 2020
Os produtos translacionais não dependentes do ATG são características patogênicas emergentes de várias doenças baseadas em expansão repetida. O objetivo do protocolo descrito é avaliar a toxicidade causada por esses peptídeos utilizando ensaios comportamentais e celulares no sistema modelo C. elegans.
Peptídeos RAN são uma característica de distúrbios neurodegenerativos de expansão repetida, como a doença de Huntington, esclerose lateral amiotrófica e demência frontotemporal. Esses protocolos fornecem uma abordagem padronizada importante para quantificar a toxicidade do peptídeo RAN no sistema modelo C.elegans. As técnicas descritas são simples de aprender e baratas, podem ser realizadas rapidamente e aproveitam as características reprodutíveis do sistema C.elegans, como movimento e reprodução.
Ao tentar este protocolo, o maior desafio é obter toxicidade e expressão consistentes de peptídeos ran. Os principais fatores a serem controlados incluem temperatura da droga, tempo de mudanças de temperatura e preparação de placas de ensaio. É importante que os experimentadores classifiquem consistentemente os fenótipos dos animais neste ensaio de processo dependente da idade.
A demonstração visual desta técnica mostra seus critérios de classificação. Comece por derramar meio de crescimento padrão de nematoide com um IPTG milimolar e 25 microgramas por mililitro carbenicillin em placas de 24 poços. Ramal fora RNAi alimentando clones em bactérias HT115 em ágar lb carbenicilina e cultivá-los a 37 graus Celsius por 24 horas.
No dia seguinte, escolha uma única colônia em um mililitro de mídia líquida de carbenicilina LB e cresça a bactéria por 18 horas a 37 graus Celsius enquanto treme a 250 rpm. Localiza quatro poços individuais da placa NGM RNAi 24-well com 20 microliters de culturas bacterianas durante a noite, como descrito no manuscrito do texto e permita que as bactérias RNAi induzam a produção de RNA de dupla rerculação durante a noite. Use o método padrão de hipoclorito para isolar os ovos do primeiro dia de C.elegans adultos expressando o transgene de peptídeo RAN integrado.
Em seguida, semente cerca de 30 ovos em cada poço da placa de 24 poços e incubar a placa a 20 graus Celsius por sete dias. Para realizar a análise da velocidade de vídeo, adquira dois vídeos de dois poços separados para cada condição RNAi usando um microscópio de dissecação estéreo equipado com uma câmera monocromática. Certifique-se de usar configurações de aquisição consistentes entre poços.
Para cada vídeo, defina a duração por 10 segundos e o intervalo de tempo para 76 milissegundos. Defina o tempo de exposição da imagem para quatro milissegundos e use a configuração de zoom de 1,49. Em seguida, selecione dois por dois binning.
Verifique se a resolução é de 800 por 600 pixels e comece a gravar. Após a aquisição, rotule cada vídeo imediatamente com a cepa, condição RNAi e número do poço. Em seguida, meça a distância percorrida e o comprimento de cada animal para 20 animais diferentes por vídeo, examinando um total de cerca de 40 vermes para cada condição RNAi.
No software, selecione o botão de ferramentas de anotação. Em seguida, a ferramenta de texto de saque. Clique em um ponto no centro do worm sendo medido no primeiro quadro do vídeo e marque-o com um número.
Avance o vídeo até o final enquanto rastreia visualmente o worm. Em seguida, clique nele e marque-o com o próximo número correspondente. Use a ferramenta da barra de escala de saque para desenhar uma linha do primeiro número para o segundo número e registrar a distância percorrida em uma planilha.
Repita esta medição para outros 19 worms no vídeo, preservando cada medição individual na janela de análise. Uma vez que as medidas estejam concluídas, tire um instantâneo do quadro de vídeo final ilustrando todas as linhas de medição para que os dados possam ser rastreados até o animal de onde ele se originou. Em seguida, analise os dados usando uma planilha de quatro colunas onde a coluna um é o identificador de worm e a coluna dois é a velocidade.
O tempo de cada vídeo pode ser encontrado clicando com o botão direito do mouse no vídeo sob o experimento e indo para as propriedades. Para normalizar a medição de velocidade, encontre o comprimento de cada animal. Use a ferramenta de polilina de desenho para rastrear livremente os C.elegans desde a ponta da cabeça até a ponta da cauda.
Em seguida, tire uma foto do quadro de vídeo final ilustrando todas as polilinas. A duração das linhas será registrada nas estatísticas. Adicione duas colunas à planilha, uma para comprimento animal e outra para velocidade normalizada.
Finalmente, analise os dados de velocidade normalizados usando um ANOVA unidirecional com testes pós-hoc versus rnai vetor vazio. Coloque quatro a seis L4 C.elegans transgênicos expressando GFP de peptídeo RAN em uma placa GFP RNAi de seis centímetros e plante-os a 20 graus Celsius. Se o experimento estiver utilizando a RNAi para testar os efeitos genéticos na toxicidade do peptídeo RAN, mova 10 adultos gravid transgênicos para cada um dos dois vetores vazios RNAi GFP RNAi ou placas RNAi específicas de genes.
Se os mutantes estão sendo usados para analisar efeitos genéticos na toxicidade do peptídeo RAN, coloque 10 animais selvagens gravid ou animais mutantes expressando o mesmo transgene RAN em cada uma das duas placas de vetor vazio RNAi ou GFP RNAi. Cresça-os a 20 graus Celsius por 48 horas. Escolha 10 conjuntos de 10 L4s transgênicos das placas RNAi e coloque cada conjunto em uma placa RNAi de três centímetros.
Certifique-se de que os vermes selecionados para o ensaio tenham motilidade superficialmente normal. Coloque as placas em um saco plástico para reter a umidade e incuba-las a 25 graus Celsius. Após 24 horas, analise os animais para mobilidade, tocando nas placas do microscópio dissecando e verificando se há movimento.
Se um verme se mover mais do que um comprimento corporal, conte-o como móvel e transfira-o para uma nova placa RNAi de três centímetros. Use uma picareta de platina para tocar os vermes restantes na cabeça e na cauda. Se o animal se mover mais do que um comprimento corporal, conte o animal como móvel e transfira-o para uma nova placa RNAi de três centímetros.
Se a paralisia significativa não for observada no controle de vetores vazios até o segundo dia, termine o ensaio e comece de novo. Agrupar todos os vermes não-movimentos para que o movimento de mais de um comprimento corporal possa ser facilmente detectado. Conte todos os vermes paralisados, ensacados ou mortos e descarte a placa.
Continue marcando os animais para paralisia todos os dias por cinco a sete dias. O ensaio de crescimento foi utilizado para medir o efeito das inibições genéticas sobre a toxicidade dos dipeptídeos ran que são encontrados em pacientes com ELA com uma expansão repetitiva G4C2. A expressão do PR50 GFP sozinho resultou em uma prisão completa de crescimento, mas a derrubada de vários genes suprimiu a toxicidade do desenvolvimento.
O efeito de knockdowns genéticos específicos sobre a motilidade de desenvolvimento dos animais expressos pr50 foi medido utilizando-se o método de análise de velocidade de vídeo. Como esperado, a inibição da expressão PR50 GFP resultou em um grande aumento da motilidade em comparação com o vetor vazio RNAi. Além disso, o RNAi contra a subunidade proteasome RPN7 resultou no aumento significativo da motilidade PR50.
Quando os fenótipos adultos foram analisados com o ensaio de paralisia dependente da idade, PR50 GFP apresentou até 80% de paralisia por cinco dias de idade. No entanto, rnAi direcionado para o gene cul-6 paralisia significativamente retardada sugerindo que cul-6 é necessário para a toxicidade PR50 GFP. Para determinar se as proteínas RAN causam neuropatologia quando expressas em neurônios C.elegans, a toxicidade específica do neurônio foi examinada usando o ensaio de comissure.
No segundo dia, a expressão PR50 GFP nos neurônios motores levou a um aumento significativo no blebbing do neurônio motor. Esta neuropatologia foi significativamente suprimida por uma mutação no gene receptor de insulina IGF homólogo DAF-2 que atrasa as propriedades tóxicas de várias proteínas neurodegenerativas. Para o ensaio comportamental, é importante que os peptídeos RAN produzam um fenótipo altamente penetrante.
Tais genes ou drogas poderiam fornecer novos biomarcadores ou opções terapêuticas para doenças de peptídeos ran. Usando esses ensaios, realizamos uma tela RNAi em todo o genoma para supressores do peptídeo RAN proline-arginina associado C9ORF72. Os genes identificados nesta tela incluem muitos genes novos e conservados que serão objeto de futuros estudos mecanicistas.
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Visão Geral
Este estudo investiga a toxicidade de peptídeos não-ATG dependentes de repetição (RAN), que estão ligados a distúrbios neurodegenerativos, usando o organismo modelo C. elegans. A pesquisa descreve um protocolo para quantificar a toxicidade de peptídeos RAN através de ensaios comportamentais e celulares.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Distúrbios neurodegenerativos
- Toxicidade de peptídeos RAN
- Uso de C. elegans como sistema modelo
Contexto
- Os peptídeos RAN estão implicados em doenças como Huntington, ELA e demência frontotemporal.
- O estudo visa padronizar abordagens para quantificar a toxicidade de peptídeos.
- Entender os mecanismos de toxicidade é crucial para potenciais estratégias terapêuticas.
Métodos Utilizados
- Ensaios comportamentais para medir mobilidade e reprodução em C. elegans
- Ensaios celulares para avaliar a expressão e toxicidade de peptídeos RAN
- Análise de velocidade de vídeo para medir o movimento do verme
Principais Resultados
- Caracterizou os fenótipos de C. elegans em resposta aos peptídeos RAN
- Identificou variáveis-chave que afetam a toxicidade dos peptídeos RAN
- Validou os métodos de ensaio para garantir consistência nas observações
Conclusões
- O estudo apresenta metodologias robustas para investigar a toxicidade dos peptídeos RAN.
- Os resultados contribuem para uma compreensão mais profunda das doenças neurodegenerativas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Measuring RAN peptide toxicity in C. elegans provides a scalable, cost-effective platform for early-stage target validation in repeat expansion neurodegenerative diseases. The assay suite enables mechanistic de-risking by linking genetic or pharmacological interventions to quantifiable phenotypic outputs such as motility, growth, and neuronal morphology. This supports predictive confidence in lead identification and portfolio triage for ALS, Huntington’s disease, and related disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking gene knockdowns to suppression of RAN peptide-induced developmental toxicity and motility defects.
- Operational Value: Uses standardized RNAi feeding in C. elegans to systematically assess genetic modifiers of peptide toxicity across the genome.
- Predictive Value: Identifies suppressors of RAN peptide toxicity (e.g., cul-6, DAF-2) that inform target prioritization and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, normalized speed and length metrics from video analysis to enable reproducible, high-content assessment of compound or genetic effects on RAN peptide toxicity.
- Operational Value: Leverages the reproducibility of C. elegans locomotion and reproduction for low-cost, rapid screening in 24-well plate formats compatible with automation.
- Assay Readiness: Establishes Z-score–compatible readouts (e.g., normalized speed) suitable for large-scale genetic or small molecule screens to identify disease-modifying targets.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Uses neuron-specific commissure assay to model RAN peptide-induced neuropathology (e.g., motor neuron blebbing) in a disease-relevant system.
- Mechanistic De-risking: Links toxicity modulation to conserved pathways (e.g., insulin/IGF signaling via DAF-2) with known relevance to human neurodegenerative disease mechanisms.
- Preclinical Continuity: Supports risk-adjusted advancement decisions by validating targets across developmental, age-dependent, and cellular toxicity assays.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing phenotypic validation of targets identified from human genetics or CRISPR screens in repeat expansion disorders.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring how genetic perturbations affect RAN peptide toxicity in a multicellular organism.
- Screening: Enables assay standardization and quantitative outputs via video-based motility analysis, facilitating reproducible compound or genetic screening campaigns.
- Analytics: Generates normalized speed and length data suitable for statistical comparison (e.g., one-way ANOVA with post-hoc testing) to evaluate hit significance.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through neuron morphology assays that model subcellular neuropathology relevant to human disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative target validation across multiple RAN peptide diseases (e.g., ALS, Huntington’s) using the same transgenic readouts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing toxic RAN peptide species and linking them to specific genetic or environmental modifiers.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined RNAi induction, temperature control, and blinded phenotypic scoring protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, in vivo evidence of target modulation on peptide toxicity, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on concordance across developmental, age-dependent, and neurotoxicity assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, RNAi feeding, and transgenic strain maintenance.
- Dependent on standardized instrumentation for video acquisition (stereo dissecting microscope, monochrome camera) and analysis software for motion tracking.
- Necessitates cross-team standardization of assay conditions (e.g., temperature shifts, plate preparation, worm staging) to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when extending assays to different RAN peptide sequences or neuronal subtypes beyond motor neurons.
- Limited by the need for consistent RAN peptide expression and toxicity, which depends on precise control of induction timing and bacterial RNAi quality.
