Ensaio de amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa (RT-LAMP) para a detecção específica e rápida do vírus do lago tilápia
18 de maio de 2020
Apresentamos um ensaio RT-LAMP para a detecção de TiLV em peixes de tilápia usando instrumentos simples durante um período relativamente curto de tempo em comparação com as técnicas convencionais de RT-PCR. Este protocolo pode ajudar a controlar a propagação epidêmica do TiLVD, especialmente nos países em desenvolvimento.
O vírus do lago de tilápia é um vírus emergente e patógenos contagiosos, que causam alta mortalidade na tilápia e suas espécies híbridas. Como a tilápia é a principal fonte de proteína para muitos países em desenvolvimento, a nova infecção pelo vírus tem um grande impacto na aquicultura de tilápia, e também ameaça a segurança alimentar mundial. O desenvolvimento de um método rápido, preciso e sensível para detectar o vírus no tecido dos peixes ajudará o controle da doença e reduzirá o impacto do vírus.
Neste vídeo, mostraremos a amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa, ou ensaio RT-LAMP, para detecção rápida do vírus do lago de tilápia em amostras de peixes. Parte dois, extração de RNA. Em primeiro lugar, adicione 3250 miligramas de tecido hepático em um tubo de microcentrifusidade de 1,5 mililitros estéril, contendo 600 a 1000 microliters ácido guanidinium-phenol base reagente, e picadinho até homogêneo.
Centrifugar a 10.000 RCF por 30 segundos, e transferir o supernante para um novo tubo. Adicione um volume igual de 95% de etanol ao tubo e misture bem. Transfira a solução para uma coluna de spin, colocada em um tubo de coleta, depois centrífuga a 10.000 RCF por 30 segundos.
Descarte o fluxo e transfira a coluna para um novo tubo de coleta. Adicione 400 microliters de RNA PreWash na coluna e centrífuga a 10.000 RCF por 30 segundos. Descarte o fluxo e repita esta etapa.
Adicione 700 microliter RNA Wash Buffer na coluna e centrífuga a 10.000 RCF por dois minutos. Depois, transfira a coluna para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro estéril. Finalmente, elute RNA na matriz da coluna com 100 microliter, água sem nuclease e centrífuga a 10.000 RCF por 30 segundos.
Parte três, projeto de primer. O PrimerExplorer Versão 4 é a ferramenta bioinformática mais comum para projetar primers eficientes lamp, ou RT-LAMP, nos quais bons manuais para o software estão disponíveis em seu site. Aqui, quatro primers específicos, compostos por dois primers internos e dois externos, foram projetados para reconhecer seis regiões distintas no segmento 3 de TiLV, originários da Tailândia.
Depois de entrar no site, onde o link é mostrado no vídeo, clique em PrimerExplorer V4. Escolha o arquivo contendo a sequência do segmento 3 do TiLV, em formato FASTA, recuperado do número acessado pelo GenBank, KX631923 ou vírus do lago de tilápia TV1 segmento 3, e clique no botão Primer Design. Uma vez clicando no botão Gerar, o software irá processar e os resultados aparecerão. Após a otimização das sequências para amplificação de LÂMPADAs, no total, foram selecionados um par de primers externos e dois pares de primers internos para este estudo, para detectar a infecção por TiLV.
Este conjunto de primers são mostrados aqui. Parte quatro, demonstração de RT-LAMP. A mistura mestra para RT-LAMP específica para o vírus do lago de tilápia, compreende os seguintes produtos químicos.
Prepare uma mistura mestra usando os produtos químicos mostrados na mesa. Dispense 22 microliters de mistura mestre em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro estéril. Em seguida, adicione três microliters de modelo RNA no tubo de reação.
Para o controle negativo, use água destilada em vez de materiais RNA e misture bem. Incubar as reações a 65 graus Celsius por 60 minutos, seguido por 80 graus Celsius por 10 minutos. Após a incubação por 30 minutos, as mudanças calóricas são observadas visualmente por olhos nus.
Quando apropriado, podemos confirmar os resultados do ensaio RT-LAMP, realizando eletroforese de gel em gel de 1,5%, funcionando com uma constante de 100 Volts, por 40 minutos, pelo qual uma escada de DNA de tamanho molecular de um quilobase-par é carregada junto como um marcador para determinar o tamanho do fragmento. Parte cinco, resultados representativos e interpretação. Após a incubação por 30 minutos, a reação de fluorescência de grãos sugerindo a amplificação positiva do TiLV nos tecidos de peixe, foi obviamente observada em amostras infectadas sob luz UV a um comprimento de onda de 365 nanômetros, enquanto as de controle negativo tinham uma solução clara e ligeiramente incolor.
Correspondentemente, a amplificação dos produtos RT-LAMP foi confirmada na eletroforese do gel agarose, mostrando vários tamanhos das múltiplas amplificações de repetições de DNA invertido, formando estruturas de alça-tronco sob lâmpada UV em amostras infectadas por TiLV, enquanto nenhuma faixa foi exibida nos poços do controle negativo, onde os resultados estavam de acordo com os do RT-como lampião. Assim, para reduzir a propagação do vírus do lago de tilápia, uma triagem imediata desses peixes infectados, usando um método de diagnóstico eficaz, é uma das chaves importantes. Assim, o recém-desenvolvido ensaio RT-LAMP deve oferecer uma ferramenta de diagnóstico rápida e sensível a ser aplicada no processo de medida de biossegurança.
O ensaio pode ser usado tanto no laboratório, quanto em instalações no local. Esperamos que o método seja implementado para triagem da população de peixes infectados que possam levar à redução da propagação do vírus do lago de tilápia.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um ensaio RT-LAMP rápido para detectar o vírus da doença do lago da tilápia (TiLV) em peixes tilápia, oferecendo uma alternativa mais rápida aos métodos convencionais de RT-PCR. O protocolo tem como objetivo auxiliar no controle da disseminação do TiLV, especialmente em países em desenvolvimento onde a tilápia é uma fonte vital de proteína.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Virologia
- Aquicultura
- Detecção de patógenos
Contexto
- O vírus da tilápia é um patógeno contagioso que causa alta mortalidade na tilápia.
- O vírus representa uma ameaça significativa para a aquicultura de tilápia e para a segurança alimentar global.
- Os métodos atuais de detecção são frequentemente demorados e complexos.
- Um método de detecção rápida é essencial para o controle eficaz da doença.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método rápido e sensível para detectar TiLV em tecidos de peixes.
- Reduzir o impacto do TiLV na aquicultura de tilápias.
- Fornecer uma solução prática para o manejo de doenças em países em desenvolvimento.
Métodos Utilizados
- Ensaio de amplificação isotérmica mediada por loop com transcrição reversa (RT-LAMP).
- Extração de RNA de tecido hepático de tilápia.
- Uso de instrumentos simples para testes rápidos.
- Comparação com técnicas convencionais de RT-PCR.
Resultados Principais
- O ensaio RT-LAMP fornece detecção rápida e precisa do TiLV.
- Este método é mais simples e rápido do que o RT-PCR tradicional.
- Pode ser implementado em ambientes com recursos limitados.
- O protocolo pode ajudar a mitigar a disseminação do TiLV em populações de tilápia.
Conclusões
- O ensaio RT-LAMP é uma ferramenta promissora para a detecção do TiLV.
- Ele apoia os esforços de controle da doença na aquicultura.
- Estudos futuros podem aprimorar sua aplicação em diversos ambientes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A detecção rápida e específica de patógenos virais emergentes, como o vírus do lago da tilápia (TiLV), é fundamental para proteger a produção aquícola e a segurança alimentar global. O ensaio RT-LAMP permite a identificação oportuna da infecção por TiLV em tecidos de peixes, apoiando intervenções precoces e medidas de biossegurança. Esta abordagem reduz a dependência de métodos moleculares intensivos em mão de obra e facilita o rastreamento em larga escala em ambientes com recursos limitados.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmácia
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a detecção específica do RNA do TiLV, apoiando a confirmação do alvo viral em tecidos hospedeiros infectados.
- Valor Operacional: Oferece um método rápido de amplificação isotérmica que não requer equipamento de ciclagem térmica.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras visuais ou fluorométricas em até 60 minutos, permitindo avaliação rápida da presença viral.
- Valor Operacional: Utiliza instrumentação mínima e pode ser empregado em ambientes de campo ou laboratoriais para triagem de alto rendimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Demonstra aplicabilidade a tipos de amostras não letais, como muco, permitindo o monitoramento longitudinal da carga viral.
- Valor Operacional: Possibilita estudos longitudinais em modelos animais sem sacrificar os indivíduos, melhorando o desenho experimental e reduzindo a variabilidade.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio RT-LAMP insere-se no continuum da descoberta ao fornecer uma ferramenta de detecção aplicável após a geração de hipóteses e anterior aos estudos de intervenção terapêutica ou profilática.
- Biologia da Descoberta: Facilita a validação da presença viral em amostras biológicas, apoiando estudos mecanicistas da patogênese do TiLV.
- Triagem: Permite a avaliação rápida do status de infecção em coortes de amostras, melhorando a prontidão do ensaio para avaliação de compostos antivirais.
- Análises: Fornece resultados quantitativos ou semi-quantitativos por meio de turbidez visual, fluorescência ou eletroforese em gel, auxiliando na análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Apoia a continuidade desde a detecção inicial até a avaliação pré-clínica de estratégias de intervenção em modelos relevantes de doenças.
- Reutilização Empresarial: Representa uma plataforma modular de detecção de ácidos nucleicos adaptável a outros patógenos emergentes em sistemas de aquicultura ou pecuária.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação do alvo por meio da detecção específica e sensível de RNA viral.
- Valor Operacional: Oferece compatibilidade com uso em ponto de atendimento, sem necessidade de equipamentos, com resultados legíveis a olho nu ou com transiluminador simples.
- Valor Estratégico: Reduz o tempo para obtenção de resultados em triagem de infecções, permitindo decisões mais rápidas sobre continuidade ou interrupção de estudos.
- Impacto no Portfólio: Melhora a avaliação de risco em programas pré-clínicos ao fornecer dados confiáveis sobre o status de infecção, reduzindo variáveis interferentes.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em biologia molecular e no design de primers para ensaios baseados em LAMP.
- Exige acesso a kits de extração de RNA, banho-maria ou bloco térmico e ferramentas de visualização (por exemplo, luz UV ou eletroforese em gel).
- Exige padronização dos protocolos de preparação de amostras entre diferentes tipos de tecidos (por exemplo, fígado, muco) para resultados reprodutíveis.
- Envolve a validação da especificidade do ensaio frente a patógenos relacionados para evitar falsos positivos.
- Limitado pela necessidade de conjuntos de primers otimizados e pela possível inibição proveniente de matrizes biológicas complexas.
