Métodos padronizados para medir a indução da resposta de choque térmico em elegans caenorhabditis

A resposta ao choque térmico é uma via essencial de resposta ao estresse celular que mantém a proteostase citoplasmática e pode ser caracterizada nos níveis molecular, celular e organismo nos níveis de elegans do mar. Apresentamos uma série de protocolos padronizados e melhores práticas que geram indução robusta da resposta ao choque térmico em elegans marítimos, a fim de ajudar a melhorar a reprodutibilidade no campo de resposta ao choque térmico. Mostramos que a tolerância termo, um ensaio organismo comumente usado, não depende da resposta ao choque térmico.

Em vez disso, recomendamos o uso de recuperação térmica, um ensaio organismo que é dependente de resposta ao choque térmico. A resposta ao choque térmico fica atenuada com o aparecimento da colocação de ovos. Portanto, o tempo de desenvolvimento é uma variável crítica que deve ser contabilizada em experimentos de resposta a choque térmico.

Comece criando uma população sincronizada de vermes. Use uma picareta de fio de platina para transferir aproximadamente 10 vermes adultos gravid para uma placa fresca. Certifique-se de remover quaisquer ovos ou larvas que possam ter sido transferidos com os adultos.

Deixe os vermes colocarem ovos por uma hora e, em seguida, remova os adultos da placa. Mantenha os vermes sincronizados a 20 graus Celsius até o estágio de desenvolvimento desejado, levando em conta que o tempo de desenvolvimento varia com cada cepa e a temperatura em que os vermes são levantados. Quando os vermes estiverem prontos para o choque térmico, enrole as placas com filme de parafina e use um rack de tubo de ensaio com um peso de chumbo para submergir em um banho de água circulante a 33 graus Celsius por uma hora.

Recupere os pratos do banho de água e seque-os com uma toalha de papel. Remova o filme de parafina e permita que os vermes se recuperem a 20 graus Celsius por seis a 24 horas, o que será um tempo suficiente para a síntese de GFP. Para preparar slides para imagens, posicione um slide de microscópio entre dois outros slides que têm uma tira de fita de laboratório sobre eles.

Faça uma solução de 3% de agarose na água e aqueça-a no micro-ondas até que as agaroses se dissolvam. Em seguida, use uma pipeta de um mililitro para colocar cerca de 150 microliters da agarose no centro do slide. Cubra imediatamente o slide com um slide em branco, colocando-o perpendicularmente para que ele repouse sobre a fita de laboratório, em seguida, remova-o cuidadosamente.

Para imobilizar os vermes, adicione uma pequena gota de um leveisole mililitro, um tampão M9, ao centro da almofada de agarose e transfira 10 vermes para a queda usando uma picareta de fio de platina. Opcionalmente, espalhe o levamisole para fora da almofada de agarose e alinhe os vermes com a picareta quando eles ficam paralisados. Cubra os vermes com um deslizamento de tampa e exploda-os o mais rápido possível usando um microscópio de fluorescência.

Para realizar um ensaio de termorecovery, sincronize os vermes e mantenha-os a 20 graus Celsius até o estágio de desenvolvimento desejado. Então o calor os choca por seis horas. Retire as placas do banho de água e deixe-as se recuperar a 20 graus Celsius por 48 horas.

Após a recuperação, conte o número de vermes que podem imediatamente arrancar após a estimulação mecânica sem movimento irregular ou paralisia. Para visualizar a indução da resposta ao choque térmico ao nível celular, foram analisadas duas cepas fluorescentes de elegans do mar. Nas amostras de controle negativo sem choque térmico, o repórter hsp-16.2 mostrou fluorescência automática normal, mas o repórter hsp-70 tinha fluorescência constitutiva no músculo depressor anal.

Após uma hora de choque térmico, a fluorescência robusta foi observada em ambos os repórteres quando a RNAi foi usada para derrubar o HSF-1 antes de medir a indução do repórter. A fluorescência de ambas as cepas foi severamente reduzida, indicando que esses repórteres são dependentes do HSF-1. Para quantificar a indução da resposta ao choque térmico a nível molecular, duas proteínas de choque térmico indígena foram medidas com pcr chave rt.

Verificou-se que um choque térmico de uma hora e 33 graus Celsius resulta em mais de 2.000 vezes de aumento na expressão relativa dos dois genes de choque térmico. Um ensaio de termorecovery demonstrou que a exposição a um choque térmico de seis horas levou a uma redução de 20% nos vermes com movimento normal após uma recuperação de 48 horas. O knockdown do HSF-1 causou uma queda drástica no movimento normal, com mais de 95% dos vermes mostrando movimento ou paralisia depois de serem empurrados.

Em contraste, o knockdown do hsf-1 não teve um efeito significativo sobre os resultados de um ensaio de tolerância termo, no qual os vermes são expostos a uma temperatura contínua de 35 graus Celsius e a porcentagem de vermes vivos é medida em vários pontos de tempo. Ao executar esta técnica pela primeira vez, certifique-se de envolver as placas com filme de parafina duas vezes para evitar que a água entre nas placas e arruine o experimento. Ensaios moleculares podem ser estendidos em análises genômicas usando RNA-seq.

Outros ensaios organismos afetados pela resposta ao choque térmico podem ser incluídos, como a vida útil. A habilidade única de correlacionar ensaios de resposta a choque térmico molecular, celular e organismo em elegans marinhos tem se mostrado inestimável para a compreensão do papel desse caminho no desenvolvimento e na doença.