Name: Dupla em Eletroporação utero para atingir populações celulares temporais e espacialmente separadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprenda a técnica de dupla eletroporação in utero para estudar interações entre populações neuronais em diferentes estágios do desenvolvimento cerebral em camundongos. Este método permite visualizar alterações no circuito neural relacionadas a distúrbios como autismo e esquizofrenia.

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Os autores agradecem a Cristina Andrés Carbonell e aos membros da unidade de Cuidados com Animais da Universidad de Valência pela assistência técnica. Também queremos agradecer a Isabel Fariñas e Sacramento R. Ferrón pelos reagentes e pelo compartilhamento de seus equipamentos conosco. A I.M.W é financiada por um contrato da Garantía Juvenil da Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221), a D.d.D é financiada pelo Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz detém um Ramón y Cajal Grant (RYC-2015-19058) do Ministério espanhol de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN). Este Trabalho foi financiado RYC-2015-19058 e SAF2017-82880-R (MICINN).

O procedimento aqui descrito foi aprovado pelo comitê de ética responsável pela experimentação, pelo bem-estar animal da Universidad de Valência e da Conselleria de Agricultura, Desarrollo Rural, Emergencia Climática y Transición Ecológica da Comunidad Valenciana, e adere às diretrizes do Conselho Internacional de Ciência Animal Laboratorial (ICLAS) revisado no Real Decreto 53/2013 da legislação espanhola, bem como na Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho.
NOTA: Este protocolo envolve dois propósitos diferentes: 1) o primeiro estudo, chamado de "estratégia A", permite a análise das interações entre as células de Cajal-Retzius (células CR) e os neurônios de projeção cortical de nascimento precoce dentro do mesmo hemisfério cerebral; 2) o segundo estudo, "estratégia B", é realizado a fim de examinar a inervação dos neurônios de projeção calosal da camada superior para o lado contralateral do neocórtex.
1. Preparação pré-cirurgia
<ol><li>Preparação de DNA<ol>
<li>Transforme as células E. coli DH5α quimicamente ou eletrocompetente com os plasmídeos de interesse, emplaque-as em placas de ágar LB com o antibiótico apropriado e incuba-as durante a noite a 37 °C. NOTA: Todos os plasmídeos utilizados aqui contêm o promotor geral para frango β-actin (CAG) conduzindo a expressão de uma proteína fluorescente-repórter (CAG-mCherry e CAG-EGFP para a estratégia A e CAG-BFP e CAG-nEGFP-2A-mtdTomato para a estratégia B). Todos eles contêm resistência à ampicilina (AMP).</li>
		<li>Escolha colônias individuais de cada transformação plasmida e inicie uma cultura líquida inicial em 2 mL de caldo de Luria + ampicilina (LB+AMP) em tubos de cultura bacteriana durante 3-4 h a 37 °C com agitação vigorosa (200 rpm). Depois, defina uma cultura bacteriana maior em um frasco de 500 mL Erlenmeyer adicionando 200 mL de LB+AMP e 1 mL da cultura inicial. Incubar durante a noite a 37 °C no agitador orbital a 200 rpm.</li>
		<li>Use um kit maxi-prep livre de endotoxinas(Tabela de Materiais)seguindo as instruções do fabricante para obter DNA plasmídeo puro e concentrado das culturas líquidas. Resuspenque o DNA em ~50-100 μL de tampão Tris-EDTA (TE) livre de endotoxina para obter concentrações de pelo menos 5 μg/μL.</li>
		<li>Para cada cirurgia, prepare uma solução com um volume final de 10 μL contendo 1 μL de corante verde rápido, solução de DNA plasmida de interesse para uma concentração final de 1 μg/μL para cada plasmídeo e tampão de TE livre de endotoxina. Por exemplo, misture 1 μL de corante verde rápido, 2 μL de uma solução de DNA plasmídeo de 5 μg/μL e 7 μL de tampão de TE.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pipeta puxando<ol>
<li>Puxe capilares de vidro borossilicato (1/0,58 mm de diâmetro externo/interno) em um puxador de micropipette vertical até que a ponta atinja um comprimento de 1-1,5 cm e corte-o usando fórceps dissecando em um ângulo de aproximadamente 30° sob um escopo dissecando.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configuração da sala de cirurgia<ol>
<li>Coloque todo o equipamento na mesa de operação (ou seja, pinças, tesouras, fórceps, micropipettos, agulha e porta-agulhas). Ligue a almofada de aquecimento e cubra-a com uma almofada absorvente cirúrgica estéril. Certifique-se de que o reservatório na máquina para anestesia de inalação esteja cheio de isoflurane, o tanque de oxigênio contém oxigênio suficiente, e o sistema funciona corretamente. NOTA: A sala de cirurgia e o material resistente devem ser mantidos o mais estéril possível (ou seja, todo o material deve ser autoclavado antes da cirurgia e as superfícies devem ser higienizadas com 70% de etanol). Os eletrodos de platina precisam ser cuidadosamente desinfetados primeiro com sabão germicidal e segundo com 70% de etanol antes da cirurgia.</li>
		<li>Prepare 100 mL de solução salina estéril de 0,9% (p/v) contendo penicilina-estreptomicina 1:100 e encha uma placa de Petri de 10 cm. Coloque a placa em cima da almofada aquecida para aquecer a solução.</li>
		<li>Encha uma seringa de 1 mL com 150 μL de solução analgésico (por exemplo, 0,1 mg/kg buprenorfina).</li>
		<li>Carregue a pipeta puxada com 5 μL da solução final de DNA plasmídeo preparada na etapa 1.1.4. Conecte o capilar a um tubo aspirador controlado pela boca.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Primeiro na cirurgia de eletroporação do útero
<ol><li>Coloque um e11.5 (estratégia A) ou E13,5 (estratégia B) C57BL/6 mouse gestante dentro de uma câmara de indução fechada com isoflurane de 2,5% (v/v) a 0,8 L/min e espere até que seja anestesiado. Transfira o mouse para a almofada de aquecimento e coloque seu nariz em uma máscara para entrega constante de isoflurane. Verifique a ausência de um reflexo do pedal como um indicador de anestesia adequada. NOTA: Aidade e mbryônica é determinada com base no dia em que o plugue vaginal é observado (E0.5).</li>
	<li>Injete subcutânea a gestante com a solução analgésico (0,1 mg/kg buprenorfina). Para evitar que os olhos sequem durante o procedimento, aplique uma gota de pomada ocular em cada olho usando um cotonete.</li>
	<li>Raspe a área abdominal do rato com uma navalha elétrica e lave-a 2x com 70% (v/v) lenços de etanol, uma vez com lenços de iodo, e uma última vez com uma limpeza de etanol.</li>
	<li>Use uma tesoura para fazer uma incisão de 30 mm de comprimento através da pele no lado direito do animal e separar cuidadosamente a pele adjacente do músculo com uma espátula cega. Depois, faça uma segunda incisão na parede abdominal.</li>
	<li>Cubra o abdômen com um pedaço de papel de tecido dobrado anteriormente desinfetado com 70% de etanol contendo uma fenda de 40 mm de comprimento em seu centro. Puxe cuidadosamente o útero da cavidade abdominal com fórceps do anel. NOTA: O útero deve ser mantido molhado com a solução salina quente preparada na etapa 1.3.2 durante todo o procedimento.</li>
	<li>Précar as pipetas puxadas com a solução de DNA preparada na etapa 1.1.4. Injete ~0,5 μL da solução de DNA por embrião no ventrículo lateral do hemisfério selecionado usando o tubo aspirador controlado pela boca até que o corante verde rápido seja perceptível dentro do ventrículo.</li>
	<li>Coloque eletrodos de platina do tipo fórceps lateralmente ao redor da cabeça do embrião injetado (como mostrado na Figura 1A e Figura 2A). Oriente os eletrodos para atingir a região cerebral desejada. Direcione o polo positivo para a parede medial para eletroporar a baça cortical (estratégia A) ou para o córtex lateral (estratégia B) para rotular células geradas nessa área. NOTA: Em todos os casos, o coração e a placenta devem ser evitados para garantir a sobrevivência embrionária.</li>
	<li>Aplique a sequência específica de pulsos elétricos com um eletroporador de ondas quadradas seguindo as indicações mostradas na Tabela 1 (estratégia A E11.5 embriões: quatro pulsos de 25 V e 40 ms, separados por intervalos de 950 ms; estratégia B E13,5 embriões: cinco pulsos de 35 V e 60 ms, com intervalos de 950 ms).</li>
	<li>Coloque cuidadosamente o útero de volta na cavidade abdominal com fórceps, preencha-o com solução salina quente e feche a parede abdominal com uma agulha 6-0 sutura. Junte-se aos dois lados da incisão inicial feita na pele usando uma agulha 6-0 sutura ou clipes de sutura.</li>
	<li>Mantenha o animal na almofada de aquecimento e monitore-o até sua recuperação da anestesia. Forneça uma dose extra de analgesia (150 μL)   em uma solução de hidrogel colocada em sua gaiola doméstica.</li>
	<li>24 horas após a cirurgia, administre uma dose extra de analgesia (150 μL). Continue o monitoramento diário por inspeção visual para possíveis dores e angústias. Observe o comportamento do animal, teste seus reflexos normais do membro traseiro e inspecione a sutura em busca de possíveis sinais de dano devido à lambida ou arranhão da ferida.</li>
</ol>3. Segundo em eletroporação uteróptero
<ol><li>Dois dias após a cirurgia inicial, repita os passos 2.1-2.3. Embora a recuperação das gestantes após a cirurgia seja muito boa, verifique se elas apresentam comportamento normal e não apresentam sinais de dor ou angústia antes de realizar a segunda cirurgia (embriões E13,5 para a estratégia A e E15,5 para a estratégia B).</li>
	<li>Faça uma incisão de 30 mm de comprimento através da pele como na etapa 2.4 e uma segunda incisão na parede abdominal, desta vez no lado esquerdo do animal. Expor cuidadosamente o útero em cima de um tecido desinfetado como descrito na etapa 2.5. NOTA: Tenha cuidado para não interferir com a incisão feita anteriormente no outro lado.</li>
	<li>Injete cerca de 0,5 μL por embrião da solução de DNA no ventrículo cerebral lateral do hemisfério previamente eletroporado no caso da estratégia A e no ventrículo cerebral lateral do hemisfério contralateral para a estratégia B. NOTA: Utilize apenas embriões que mostem desenvolvimento normal e sem sinais de reabsorção.</li>
	<li>Coloque os eletrodos ao redor da cabeça do embrião conforme descrito na etapa 2.7, Direcionando o eletrodo positivo para o córtex lateral e aplique os pulsos apropriados seguindo as indicações apresentadas na Tabela 1 (estratégia A E13.5 embriões: cinco pulsos de 35 V e 60 ms separados por intervalos de 950 ms; estratégia B E15,5 embriões: cinco pulsos de 50 V e 80 ms separados por intervalos de 950 ms).</li>
	<li>Continue e termine a cirurgia conforme descrito nas etapas 2.8-2.10.</li>
</ol>4. Colheita e secção de tecidos
<ol><li>Estratégia A<ol>
<li>Quatro dias após a segunda eletroporação (E17.5), realizar deslocamento cervical da gestante e colocá-la em posição supina.</li>
		<li>Usando uma tesoura, faça uma incisão ventral para extrair os chifres uterinos e com fórceps coloque-os em uma placa de Petri cheia de 1x salina tamponada com fosfato (PBS) colocada no gelo. NOTA: A baixa temperatura torna possível a anestesia dos embriões.</li>
		<li>Usando pinças, extraia os embriões do saco amniótico e transfira-os com fórceps para uma nova placa de Petri cheia de PBS sob um escopo dissecando. Segure cuidadosamente a cabeça dos embriões usando fórceps e conduza a dissecção cerebral com pinças para primeiro remover a pele sobre a cabeça e, em seguida, o crânio. Use uma espátula para arrancar os cérebros expostos.</li>
		<li>Colete os cérebros com uma colher e deposite-os em uma placa de 48 poços preenchida com a solução fixa (4% [w/v] paraformaldeído [PFA] em 1x PBS). Teste imediatamente para o resultado bem sucedido de ambas as eletroporações examinando os cérebros usando um microscópio de epifluorescência invertida, por exemplo.</li>
		<li>Fixar os cérebros embrionários durante a noite a 4 °C em um agitador orbital. Lave com 1x PBS para eliminar traços de PFA. Em seguida, transfira-os para a PBS com conservantes antifúngicos (1x PBS-0,05% (w/v) azida de sódio). ATENÇÃO: PFA e azida de sódio são compostos citotóxicos que requerem precaução especial durante sua utilização.</li>
		<li>Incorpore os cérebros fixados em 4% (w/v) ponto de fusão baixo surgiu em 1x PBS e espere ~10 min até que se solidifique. Coloque-os no suporte do tecido vibratome usando cola cianoacrilato com as lâmpadas olfativas voltadas para cima para obter seções coronais.</li>
		<li>Inicie o vibratome e selecione os parâmetros desejados: 100 μm de largura, 0,60 μm/s de velocidade e 0,60 mm de amplitude.</li>
		<li>Fixar o cérebro dentro do recipiente de vibratome, preenchê-lo com solução pbs 1x e começar a coletar seções coronárias com a ajuda de um pincel em uma placa de 48 poços preenchido com 1x PBS-0,05% (w/v) azida de sódio para ter uma representação completa do cérebro (por exemplo, cerca de sete seções por poço e seis poços por embrião).</li>
		<li>Monte as seções desejadas em lâminas de vidro de microscópio usando uma escova fina. Cubra-os com tampas de vidro. Para o armazenamento de longo prazo adicione meio de montagem, o que evita fotobleaching e fotooxidação. Observe os slides sob um microscópio de epifluorescência vertical para avaliar a eficácia da eletroporação.</li>
	</ol></li>
	<li>Estratégia B<ol>
<li>Que os filhotes previamente eletroporados em E13.5 e E15.5 nasçam e esperem até P15 para realizar a perfusão transcárdia utilizando a mesma solução fixativa utilizada na etapa 4.1.4.</li>
		<li>Pouco antes da perfusão, administram intraperitonealmente uma dose de 75/1 mg/kg de cetamina/medetomidina. Quando o reflexo do pedal for perdido, fixe o mouse em uma posição supina e faça uma incisão ventral seguindo a linha média usando uma tesoura para expor tanto a caixa torácica quanto o diafragma.</li>
		<li>Corte o diafragma e abra a caixa torácica para ter acesso ao coração. Segure a caixa torácica usando um hemosta e faça uma incisão no átrio direito com uma tesoura fina.</li>
		<li>Penetre o ventrículo esquerdo com uma agulha conectada com um tubo flexível a uma bomba de perfusão peristáltica. Inicie a perfusão transcárlica, entregando pelo menos 25 mL de 4% pfa a um fluxo constante de 5,5 mL/min (tempo total ~5 min).</li>
		<li>Dissecar o cérebro de animais perfumados. Primeiro, remova a pele sobre a cabeça com tesouras e fórceps. Comece a cortar o crânio usando uma tesoura e retire cuidadosamente seções dos ossos do crânio até que eles sejam completamente removidos. Finalmente, extrair o cérebro com a ajuda de uma espátula.</li>
		<li>Transfira os cérebros para uma placa de 24 poços e fixe-os com 4% de PFA durante a noite a 4 °C em um agitador orbital. Pare a fixação substituindo pfa por 0,05% (w/v) azida de sódio em PBS. NOTA: Conforme indicado na etapa 4.1.5, é aconselhável realizar uma lavagem intermediária com 1x PBS.</li>
		<li>Repetir passos 4.1.6−4.1.9, alterando os parâmetros vibratome para cérebros pós-natais (40 μm de largura, 1,20 μm/s de velocidade e 0,5 mm de amplitude). NOTA: A imunohistoquímica ou a imunofluorescência podem ser realizadas para detectar marcadores celulares específicos ou melhorar o sinal de proteínas fluorescentes usadas na eletroporação.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Imagem e análise de fluorescência confocal
<ol><li>Ligue o microscópio confocal, coloque os slides do microscópio contendo as seções cerebrais montadas no suporte de slides do microscópio e selecione os canais nos quais as imagens de fluorescência serão tiradas (ou seja, 420-460 nm para BFP, 490-540 nm para GFP e 570-620 nm para mCherry e tdTomato).</li>
	<li>Realize a varredura de amostras para obter imagens de mapa de cada seção cerebral em dois comprimentos de onda diferentes para uma visão geral da saída de eletroporação dupla. Uma vez concluída, selecione a lente 10x e o modo de observação timelapse multi-área-Z-stack-timelapse. Isso permitirá a programação da aquisição automática de imagens de fluorescência em diferentes localizações XYZ dentro de seções cerebrais.</li>
	<li>Em cada uma das regiões escolhidas (XY), defina parâmetros adequados de imagem (ou seja, intensidade do laser, sensibilidade fotomultiplier e resolução mínima de 1.024 x 1.024), bem como a profundidade da varredura (Z) de acordo com os planos da amostra onde a fluorescência é visível.</li>
	<li>Obtenha imagens de baixa ampliação (10x) de todas as regiões escolhidas e exporte-as do formato OIF para TIFF usando o software de visualizador de microscópio.</li>
	<li>Mude para a lente 60x, repita o passo 5.3 e capture imagens de alta ampliação para observar as interações célula-célula de forma mais detalhada. Exportá-los conforme indicado na etapa 5.4.</li>
	<li>Abra as imagens adquiridas com qualquer software de imagem (por exemplo, Fiji) para análise posterior.</li>
</ol>

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<li>Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+loss+of+Cajal-Retzius+cells+does+not+disrupt+neocortical+layer+order%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order.</a> Development. 133, 537-545 (2006).</li>
<li>Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+radial+migration+in+early+development+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex.</a> Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).</li>
<li>Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+specification%2C+and+diversity+of+callosal+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Development, specification, and diversity of callosal projection neurons.</a> Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).</li>
<li>Thomson, A. M., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interlaminar+Connections+in+the+Neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Interlaminar Connections in the Neocortex.</a> Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).</li>
<li>Zarrinpar, A., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+connections+to+specific+types+of+layer+6+neurons+in+the+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).</li>
<li>Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+Transcallosal+Projections+Are+Present+throughout+the+Mouse+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36(2017).</li>
<li>DeFelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+the+brain%2C+the+human+nature+of+cortical+circuits%2C+and+intellectual+creativity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29(2011).</li>
<li>Velmeshev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genomics+identifies+cell+type%E2%80%93specific+molecular+changes+in+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism.</a> Science. 364, 685-689 (2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O estudo das interações célula-células in vivo em regiões com alta densidade celular como o córtex cerebral é uma tarefa complexa. Abordagens tradicionais, incluindo o uso de anticorpos para rotular neurites, não são adequadas devido à falta de marcadores específicos para diferentes populações celulares. O uso de modelos transgênicos de murina, onde um determinado tipo de célula expressa uma proteína fluorescente, é útil para visualizar os processos neuronais, mas isso depende da disponibilidade de tais modelos. Essa tar...

O córtex cerebral é uma estrutura muito complexa e intrincadamente organizada. Para alcançar tal grau de organização, os neurônios de projeção cortical passam por processos complexos de desenvolvimento que requerem sua geração temporal, migração para seu destino final na placa cortical e o estabelecimento de conexões de curto e longo alcance1,,2. Por muito tempo, a maneira clássica de estudar corticogênese foi baseada no uso de modelos murinos de nocaute ou knock-in de genes de interesse. No entanto, essa estratégia, e particularmente o uso de camundongos eliminatórios condicionais, é demorada e cara, e às vezes apresenta problemas adicionais quanto à existência de redundância genética ou à falta de drivers específicos de CRE, entre outras questões. Uma das abordagens que surgiram para tentar resolver esses problemas e que hoje é amplamente utilizada para estudar o desenvolvimento cortical está na eletroporaçãoutero 3,4. No útero a eletroporação é uma técnica usada para transgênese somática, permitindo o direcionamento in vivo de células-tronco neurais e sua prole. Este método pode ser usado para rotular células pela expressão de proteínas fluorescentes5,6, para manipulação genética in vivo (ou seja, ganho ou perda de ensaios de função)7,8,9, para isolar cortices eletroporados in vitro e cultura de células8,,10. Além disso, no útero a eletroporação permite o controle temporal e regional da área alvo. Esta técnica possui inúmeras aplicações e tem sido amplamente utilizada para estudar migração neuronal, divisão de células-tronco, conectividade neuronal e outros sujeitos8,,9,,11,12.
O manuscrito atual descreve o uso de uma variante de eletroporação uteral, denominada dupla em eletroporação uteral, para analisar as interações das células no córtex cerebral com diferentes origens temporais e espaciais. Esses estudos são extremamente complexos de serem concluídos ao empregar modelos murinos porque requerem o uso combinado de várias linhas transgênicas. Algumas das aplicações do protocolo descrito neste artigo incluem o estudo de interações próximas entre células vizinhas, bem como interações entre células distantes através de projeções de longo alcance. O método requer a realização de duas cirurgias de eletroporação uteral, separadas temporal e espacialmente, nos mesmos embriões para atingir diferentes populações celulares de interesse. A vantagem dessa abordagem é a possibilidade de manipular a função genética em um ou ambos os tipos de neurônios usando animais do tipo selvagem. Além disso, esses experimentos funcionais podem ser combinados com a expressão de proteínas fluorescentes citoplasmáticas ou marcadas por membrana para visualizar a morfologia fina das células-alvo, incluindo dendritos e axônios, e analisar possíveis diferenças nas interações celulares em comparação com um controle (ou seja, células apenas rotuladas com a proteína fluorescente).
O protocolo delineado aqui é focado no estudo das interações celulares dentro do neocórtex, mas essa estratégia também poderia ser usada para examinar interações com áreas extracorticais que podem ser direcionadas usando na eletroporação utero, como o subpallium ou o tálamo13,14, ou interações célula-células em outras estruturas, como o cerebelo15. O direcionamento de diferentes áreas baseia-se na orientação dos eletrodos e no ventrículo onde o DNA é injetado (lateral, terceiro ou quarto). Com a estratégia descrita aqui, podemos rotular um número substancial de células, o que é útil para avaliar mudanças gerais na conectividade/inervação em experimentos funcionais. No entanto, para estudar mudanças finas na conectividade, pode-se usar versões modificadas de eletroporação uteróptero para obter rotulagem mais esparsa e identificar células únicas16. Em resumo, o dobro da eletroporação uteral é um método versátil que permite direcionar populações celulares temporais e espacialmente separadas e estudar suas interações em detalhes, seja em condições de controle ou combinadas com experimentos funcionais, reduzindo consideravelmente os custos temporais e econômicos.

<table><tbody><tr><td>Sal de ampicilina sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de aspiração</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Hemostático misturador de bebês (perfusão)</td><td>Ferramentas de Ciências Finas (FST)</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidro borossilicato</td><td>WPI</td><td>1B100-6</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina (BUPREX 0,3 mg/ml)</td><td>Rb Pharmaceuticals Limited</td><td></td><td></td>921425</tr><tr><td>plasmídeo CAG-BFP</td><td>Gentilmente fornecido pela U.M&uuml; Laboratório de Laboratório</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CAG-EGFP plasmídeo</td><td>gentilmente fornecido pela U.M&uuml; Laboratório ller Plasmídeo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CAG-mCherry</td><td>Gentilmente fornecido pela U.M&uuml; ller Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid</td><td>Gentilmente fornecido pela U.M&uuml; Microscópio confocal de laboratório</td><td></td><td></td>ller</tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>FV10i</td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes</td><td>BFHCVDF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cola de cianoacrilato</td><td>B. Braun Escopo de</td> dissecação <td>de 1050044</td><td></td>cirúrgico</tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>stemi 305</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Fórceps # 5 Fine</td><td>Science Tools (FST)</td> <td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>ECM830 Square Wave Electroporator</td><td>BTX</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Barbeador Elétrico</td><td>Oster</td><td>76998</td><td></td></tr><tr><td>Tampão TE sem endotoxinas</td><td>QIAGEN</td><td>1018499</td><td></td></tr><tr><td>Toalhetes de etanol</td><td>BFHCVDF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinça Graefe Extra Fina</td> Ferramentas <td>de Ciências Finas (FST)</td> <td>11150-10</td><td></td></tr><tr><td>Pomada para os olhos</td><td>Alcon</td><td>682542.6</td><td></td></tr><tr><td>Corante verde rápido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Fina</td><td>Ferramentas de Ciência Fina (FST)</td> <td>14069-09</td><td></td></tr><tr><td>LEDs de fluorescência</td><td>CoolLED</td><td>pE-300-W</td><td></td></tr><tr><td>Genopure Plasmid Maxi Kit</td><td>Roghe</td><td>3143422001</td><td></td></tr><tr><td>Halsted-Mosquito Hemostáticos (sutura)</td> <td>Ferramentas de Ciência Fina (FST)</td> <td>91308-12</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de Aquecimento</td><td>UFESA</td><td>AL5514</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de epifluorescência invertida</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE2000-S</td><td></td></tr><tr><td>Toalhetes de iodo</td><td>Vaporizador</td> de isofluorano Lorsoul <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Medidor de vazão</td><td>A15B5001</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Karizoo</td><td>586259</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina (Anastemina)</td> <td>Fatro Ib&eacute; rica SL</td><td>583889-2</td><td></td></tr><tr><td>Toalhetes de precisão Kimtech</td><td>Kimberly-Clark</td><td>7252</td><td></td></tr><tr><td>LB (Lennox) Agar GEN</td><td>Labkem</td><td>AGLB-00P-500</td><td></td></tr><tr><td>LB (Lennox) caldo GEN</td><td>Labkem</td><td>LBBR-00P-500</td><td></td></tr><tr><td>Baixo ponto de fusão agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidina (Sedador)</td> <td>Dechra</td><td>573749.2</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de microscópio</td><td>Menel-Gl&auml; Lâminas de microscópio ser</td><td>15747592</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Labbox</td><td>SLIB-F10-050</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem</td><td>Microscopia eletrônica Sciences</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Placas Mutiwell (24)</td><td>Placas SPL Life Sciences</td><td>32024</td><td></td></tr><tr><td>Mutiwell (48)</td><td>SPL Life Sciences</td><td>32048</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (para solução salina)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10112640</td><td></td></tr><tr><td>Agulha 25 G (BD Microlance 3)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora orbital S150</td><td>Stuart Scientific</td><td>5133</td><td></td></tr><tr><td>P Incubadora</td><td>Selecta J. P. Selecta, s.a.</td><td></td><td></td>0485472</tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>PanReac AppliedChem</td><td>A3813</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de perfusão peristáltica</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07522-30</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de platina, 5 mm de diâmetro</td><td>Btx</td><td>45-0489</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de fechamento de pele reflexo - Clipes de 7mm, caixa de 100</td><td>AgnThos</td><td>203-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Fechamento de Pele Reflexo - Aplicador de Clipe, 7mm</td><td>AgnThos</td><td>204-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de Anel</td><td>Ferramentas de Ciência Fina (FST)</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>PanReac AppliedChem</td><td>122712-1608</td><td></td></tr><tr><td>Almofada absorvente cirúrgica (estéril)</td><td>HK Sutura</td><td>Cirúrgica PD-M</td><td></td></tr><tr><td>(Surgicryl PGA 6-0)Materiais de</td> <td>Sutura SMI</td><td></td><td>Seringa BYD11071512</td></tr><tr><td>1ml (BD plastipak)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Tecidos 100 x 20 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de Micropipeta Vertical</td><td>Microscópio vertical Sutter Instrument Co</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ni</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

dupla em eletroporação utero para atingir populações celulares temporais e espacialmente separadas

Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations

No útero a eletroporação é uma técnica de transferência de DNA in vivo amplamente usada para estudar os mecanismos moleculares e celulares subjacentes à corticogênese dos mamíferos. Este procedimento aproveita os ventrículos cerebrais para permitir a introdução do DNA de interesse e usa um par de eletrodos para direcionar a entrada do material genético para as células que revestem o ventrículo, as células-tronco neurais. Este método permite que os pesquisadores rotulem as células desejadas e/ou manipulem a expressão de genes de interesse nessas células. Possui várias aplicações, incluindo ensaios direcionados à migração neuronal, rastreamento de linhagem e localização axonal. Uma característica importante deste método é o seu controle temporal e regional, permitindo a evasão de potenciais problemas relacionados com a letalidade embrionária ou a falta de ratos condutores de CRE específicos. Outro aspecto relevante dessa técnica é que ela ajuda a reduzir consideravelmente as limitações econômicas e temporais que envolvem a geração de novas linhas de camundongos, que se tornam particularmente importantes no estudo de interações entre tipos celulares que se originam em áreas distantes do cérebro em diferentes idades de desenvolvimento. Aqui descrevemos uma estratégia de eletroporação dupla que permite o direcionamento de populações celulares que são separadas espacial e temporalmente. Com essa abordagem podemos rotular diferentes subtipos de células em diferentes locais com proteínas fluorescentes selecionadas para visualizá-las, e/ou podemos manipular genes de interesse expressos por essas diferentes células nos momentos apropriados. Essa estratégia aumenta o potencial da eletroporação uteral e fornece uma poderosa ferramenta para estudar o comportamento de populações celulares temporais e espacialmente separadas que migram para estabelecer contatos próximos, bem como interações de longo alcance através de projeções axonais, reduzindo custos temporais e econômicos.

As interações entre as células vizinhas originaram-se em locais distais e em diferentes épocas: células de Cajal-Retzius (células CR) e neurônios de projeção cortical migratórios precoces (estratégia A)
A interação das células de CR e dos neurônios de projeção cortical precoce foi descrita anteriormente como necessária para regular a translocação somal via moléculas de adesão de néctina e cadherina usando uma estratégia de eletroporação dupla8. As célul...

O dobro na eletroporação uteral permite atingir populações celulares que são separadas espacial e temporalmente. Esta técnica é útil para visualizar interações entre essas populações celulares usando proteínas fluorescentes em condições normais, mas também após experimentos funcionais para perturbado genes de interesse.

Dupla em Eletroporação utero para atingir populações celulares temporais e espacialmente separadas

In utero electroporation is an in vivo DNA transfer technique extensively used to study the molecular and cellular mechanisms underlying mammalian ...

O dobro na eletroporação utero é um método poderoso para estudar os aspectos importantes da corticogênese dos mamíferos, como a interação entre células neurônios, gerada em diferentes locais e idades de desenvolvimento. A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de examinar interações não perturbadas entre essas diferentes populações celulares de forma rápida, detalhada e barata. Uma implicação impressionante do nosso método é que ele facilita uma melhor compreensão de quão semelhante nossa fiação é alterada em distúrbios neuronais como autismo e esquizofrenia.Este estudo não se restringe ao neocórtex, mas também pode ser empregado para analisar interações celular a célula, em áreas exocorticais como o sepalium ou cerebelo. Um dos passos mais desafiadores é a injeção de DNA nos ventrículos laterais dos embriões primitivos. O uso de uma fonte de luz brilhante é essencial para injeções bem sucedidas.Para cada cirurgia, primeiro prepare uma solução de 10 microliter contendo um microliter de corante verde rápido, um micrograma por microliter plasmid DNA solução de interesse para cada plasmídeo, e o volume apropriado no tampão de TE livre de endotoxina. E pré-carregar uma pipeta

double-utero-electroporation-to-target-temporally-spatially-separated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

In Utero injeção intraventricular e eletroporação de embriões de camundongos E15

Na eletroporação utero é um método valioso para transfecting células progenitoras neuronal in vivo. Dependendo da colocação dos eletrodos e do ponto no tempo de desenvolvimento de eletroporação, certos subgrupos de células corticais podem ser alvo. Células-alvo podem então ser analisados ​​in vivo ou in vitro para efeitos da alteração genética.

No útero Eletroporação seguido por Cultura Neuronal primário para estudar a função do gene no subconjunto dos neurônios corticais

Na eletroporação útero permite a entrega rápida em um gene espacialmente e temporalmente maneira controlada no desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC). Aqui nós descrevemos um adaptável altamente in utero protocolo de eletroporação que pode ser usado para entregar constrói expressão em vários domínios embrionário do SNC, incluindo o telencéfalo diencéfalo e retina.

Entrega Gene eficiente em múltiplos territórios CNS Usando In Utero Eletroporação

Um método de transferência de genes no cérebro do rato em desenvolvimento é descrito usando um único método cirúrgico ea forma especial de eletrodos. Esta técnica exclusiva permite a transfecção de DNA plasmídeo temporal e espacialmente, o que ajudará muitos neurocientistas em estudar o desenvolvimento do cérebro.

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

Este vídeo demonstra a entrega de DNA de plasmídeo em células neuronais cerebelares de embriões murinos usando eletroporação in utero. Este método é útil para obter compreensão da função in vivo dos genes no desenvolvimento normal do cérebro e as mudanças na expressão gênica das células dos neurônios durante a progressão do tumor.

Entrega de genes baseada em eletroporação in utero: uma técnica para injetar DNA de plasmídeo em células cerebelares embrionárias de embriões murinos

Este procedimento mostra como direcionar interneurônios no prosencéfalo de camundongo em desenvolvimento por meio de eletroporação in utero. Essa técnica foi particularmente eficiente para alcançar a expressão gênica seletiva em subtipos de interneurônios destinados às camadas superficiais do córtex.

Subtipo seletivo Eletroporação de Cortical Interneurônios

Demonstramos um método para enxertar células cultivadas em locais definidos de embriões de camundongos iniciais para determinar seu potencial in vivo. Também introduzimos um método de eletroporação otimizado que usa capilares de vidro de diâmetro conhecido, permitindo a entrega precisa de DNA exógeno em algumas células dos embriões.

Métodos de Transferência Precisamente localizada de células ou DNA em adiantado postimplantation embriões de camundongos

Este protocolo descreve em detalhes como transfectar especificamente diferentes regiões do sistema nervoso central C57BL/6 por meio de eletroporação in utero. Incluídas neste protocolo estão instruções detalhadas para transfecções de regiões que se desenvolvem no córtex, hipocampo, tálamo, hipotálamo, núcleo septal lateral e estriado.

Específicos do Striatum Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- e<em&gt; In Utero</em&gt; A electroporação em ratinhos C57BL / 6 mouse

Este manuscrito fornece protocolos que usam in utero eletroporação (IUE) para descrever a conectividade estrutural dos neurônios no nível de uma única célula e a excitabilidade dos neurônios marcados com fluorescência. A histologia é utilizado para caracterizar dendrítica e projecções axonais. a gravação de célula inteira em fatias agudas é usado para investigar a excitabilidade.

In Utero Eletroporação Abordagens para estudar a excitabilidade neuronal subpopulações e Conectividade uma única célula

Apresentado aqui é um protocolo para realizar manipulação genética no cérebro de furão embrionário usando na eletroporação uterónica. Este método permite o direcionamento de células progenitoras neurais no neocórtex in vivo.

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Aprenda a técnica de dupla eletroporação in utero para estudar interações entre populações neuronais em diferentes estágios do desenvolvimento cerebral em camundongos. Este método permite visualizar alterações no circuito neural relacionadas a distúrbios como autismo e esquizofrenia.

Dupla em Eletroporação utero para atingir populações celulares temporais e espacialmente separadas

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