Quantificando partículas semelhantes a vírus norovírus humanos ligando-se a bactérias commensal usando citometria de fluxo

Interações vírus-bacterianas podem ser importantes para infecção viral bem sucedida e estimulação de uma resposta imune hospedeira. Mas atualmente, o estoque altamente concentrado e purificado de norovírus humano não pode ser produzido em laboratório. Esta técnica pode ser usada com qualquer vírus que se ligue a bactérias, para as quais partículas semelhantes a vírus ou vírus vivos estão disponíveis.

Isso nos permite quantificar as interações entre esses vírus e bactérias. Inocular cinco mililitros de meio líquido com uma única colônia isolada de Enterobacter cloacae a partir de uma placa de ágar diretamente do estoque de glicerol congelado. Cresça as bactérias durante a noite.

No dia seguinte, transfira 1,3 mililitros da cultura em dois tubos de centrífuga separados de 1,5 mililitro. Centrifugar os tubos a 10.000 x g por cinco minutos. Remova os sobrenantes e lave as amostras duas vezes usando um mililitro de PBS 1X estéril para cada lavagem.

Centrifugar as amostras novamente a 10.000 x g por cinco minutos. Remova o supernasciente e resuspenque a pelota em 1,3 mililitros de PBS 1X estéril. Começando com 0,5 mililitros de cultura lavada, diluir a bactéria em 1X PBS de 10 para menos um a 10 para menos quatro.

Usando um espectótmetro, meça a densidade óptica da cultura não diluída lavada e cada uma das quatro diluições a 600 nanômetros. Realize diluições seriais de 10 vezes em 1X PBS para cada uma das diluições anteriores. Espalhe 100 microlitres das últimas três diluições para cada série em placas de ágar para determinar o número de unidades formadoras de colônias por mililitro para cada amostra.

Deixe as placas secarem à temperatura ambiente por cinco minutos. Inverta as placas e incuba-as na incubadora. Depois de preparar os reagentes, anticorpos e bactérias como descrito no manuscrito, monte todos os materiais em um armário de biossegurança BSL-2.

Partículas semelhantes a vírus para norovírus humano são listadas como patógenos BSL-2 e todo o trabalho realizado usando VLP deve ser conduzido em um gabinete de biossegurança certificado. Adicione 10 microgramas de VLPs de norovírus humanos a cada tubo de bactérias e misture bem por pipetação. Incubar os tubos por uma hora a 37 graus Celsius com rotação constante.

Após a incubação, centrifufique os tubos a 10.000 x g durante cinco minutos. Aspire e descarte o supernasce e resuspenque a pelota bacteriana em um mililitro de PBS. Depois de repetir as etapas de lavagem uma vez, centrifufique os tubos novamente a 10.000 X g por cinco minutos.

Descarte o supernatante e resuspenque a pelota de bactérias VLP em 150 microliters de 5% de tampão de bloqueio. Um erro comum que ocorre é que os tubos são trocados e o tratamento errado é adicionado. Para evitar isso, organize todos os tubos em linhas que correspondam ao tratamento correto e adicione um tratamento de uma só vez aos tubos.

Para cada amostra bacteriana, prepare 50 microliters de anticorpos norovírus humanos diluídos. Usando tampão de bloqueio de 5%, dilua o anticorpo de um a 125 para amostras de E.cloacae. Prepare 50 microliters de anticorpo isótipo diluído para cada amostra bacteriana usando as mesmas razões de diluição.

Divida cada amostra de ensaio de fixação em 350 alíquotas de microliter transferindo-as para tubos de centrífuga de 1,5 mililitro limpos. Para criar controles não manchados, adicione 50 microliters de tampão de bloqueio à primeira alíquota de cada amostra bacteriana. Para as amostras manchadas, adicione 50 microliters da diluição de anticorpos GII ao segundo conjunto de alíquotas.

Crie os controles isótipos adicionando 50 microlitadores do anticorpo isótipo diluído ao terceiro conjunto de alíquotas. Incubar todas as amostras no gelo e no escuro por 30 minutos. Em seguida, centrifugar todas as amostras a 10.000 X g por cinco minutos.

Descarte os supernantes e resuspenque cada amostra em 150 microliters de FCSB. Novamente, centrifugar todas as amostras a 10.000 X g durante cinco minutos. Novamente, descarte os supernacantes e resuspenja as amostras em 100 microliters de FCSB.

Depois de centrifugar as amostras uma última vez e descartar os supernantes, resuspende as amostras em 150 microliters de FCSB. Transfira cada amostra para um tubo contendo 400 microliters de FCSB para um volume total de 550 microliters. Armazene as amostras a 4 graus Celsius até que sejam analisadas por citometria de fluxo.

O acessório VLP foi medido por citometria de fluxo. Primeiro, parcelas de densidade foram usadas para gate out detritos celulares, seguido por subsequente gráfico de pontos gating para remover doublets bacterianos e aglomerados celulares. Histogramas representativos demonstram a falta de sinal de PE em amostras bacterianas e uma mudança na intensidade do sinal de PE em amostras de VLP:bacterium em comparação com controles não manchados e isótipos.

Após uma hora de incubação com 10 microgramas de VLP, a citometria de fluxo detectou ligação de partículas tanto para E.colacae quanto para L.gasseri. Para determinar o limite de quantificação vinculante para este ensaio, uma série de diluição dos VLPs foi gerada antes da adição à bactéria. Reduções na quantidade de VLP resultaram em reduções correspondentes às bactérias por cento vinculadas pelo VLP.

Conhecer a relação vírus:bactéria e manter a razão consistente entre os experimentos é importante na interpretação dos resultados. Mutantes bacterianos e virais podem ser gerados para determinar especificamente as estruturas de superfície microbiana que mediam essa interação. Essa técnica permite que os pesquisadores respondam a perguntas sobre circunstâncias e condições que impactam as interações norovírus-bacterianas, incluindo como mudanças no genótipo do vírus, condições de crescimento bacteriano e alterações nas estruturas bacterianas da superfície alteram a ligação viral.