Name: Um ensaio baseado em eletroquimiluminescência para variantes de proteína MeCP2 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Aprenda a quantificar variantes da proteína MeCP2 usando o ensaio de eletroquimiluminescência (ECLIA) em placa de 96 poços. Este método oferece alta sensibilidade e reprodutibilidade para pesquisas em neurociência.

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Somos muito gratos à Dra.

A aprovação para aquisição de biópsias de pele para fins de pesquisa foi obtida do Comitê de Ética em Pesquisa Humana do Hospital Infantil de Westmead, Austrália. O consentimento para experimentos em animais foi obtido do Ministério da Ciência, Pesquisa e Economia da Áustria, realizado de acordo com as normas locais de bem-estar animal (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
NOTA: O princípio do sistema ECLIA é retratado na Figura 1.
1. Seleção de anticorpos
<ol><li>Avalie a relação sinal-ruído para uma gama de vários anticorpos MeCP2 e identifique a melhor resistência ao sinal e a maior especificidade dentro da combinação de um anticorpo MeCP2 monoclonal do mouse primário (clone Mec-168) e anticorpo de detecção de coelclonal MeCP2 (feito sob medida). Para o anticorpo secundário, use um anticorpo específico do sistema(Table of Materials),que também foi verificado experimentalmente. NOTA: A Tabela 1 fornece uma visão geral de todos os anticorpos verificados durante o desenvolvimento do MeCP2-ECLIA e suas faixas de diluição testadas.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Função</td>
			<td>Nome</td>
			<td>Clone</td>
			<td>Diluição</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primária</td>
			<td>Mouse, anti-MeCP2</td>
			<td>MEC-168</td>
			<td>1:500-1:10.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primária</td>
			<td>Mouse, anti-MeCP2</td>
			<td>4B6</td>
			<td>1:250-1:4.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primária</td>
			<td>Mouse, anti-MeCP2</td>
			<td>Homens-8</td>
			<td>1:500-1:4.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primária</td>
			<td>Mouse, anti-MeCP2</td>
			<td>1B11</td>
			<td>1:500-1:4.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primária</td>
			<td>Coelho, anti-MeCP2</td>
			<td>D4F3</td>
			<td>1:500-1:4.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Secundário</td>
			<td>Coelho, anti-MeCP2</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>1:2.000-1:20.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Secundário</td>
			<td>Coelho, anti-MeCP2</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>1:2.000-1:20.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Detecção</td>
			<td>SULFO-TAG rotulado anti-coelho</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>1:500-1:1.000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Lista de anticorpos e diluições de trabalho utilizadas.
<ol start="2"><li>Alternativamente, use cada par de anticorpos MeCP2 que funcionem bem com o ELISA convencional.</li>
</ol>2. Tratamento de HDFs com proteína de fusão TAT-MeCP2
NOTA: TAT-MeCP2 foi recombinantemente expresso em Escherichia coli e purificado usando técnicas cromatográficas padrão como descrito anteriormente8 e armazenado a -80 °C.
<ol><li>Placa 1 x 106 células humanas de fibroblasto dérmico (HDF) em pratos de 100 mm e crescer as células durante a noite a 37 °C com 5% de CO2 até atingirem cerca de 90% de confluência.</li>
	<li>Tire um frasco de proteína de fusão TAT-MeCP2. Descongele no gelo e misture delicadamente.</li>
	<li>Diluir TAT-MeCP2 para uma concentração final de 500 nM em 50 mL de mídia de cultura HDF.</li>
	<li>Retire a mídia de pratos de 100 mm e incuba as células com 500 nM TAT-MeCP2 a 37 °C para vários períodos de incubação até 24 h.</li>
	<li>Remova a solução TAT-MeCP2 das células. Lave as células 2x com o salino pré-aquecido de Dulbecco com fosfato tampão (DPBS).</li>
	<li>Tratar as células com 2 mL de 0,05% de solução trypsin-EDTA por 5 min a 37 °C10.</li>
	<li>Adicione 6 mL de mídia de cultura HDF para inativar a tripsina e coletar as células em tubos de 15 mL.</li>
	<li>Pelota as células por centrifugação a 500 x g por 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remova o sobrenadante e lave as células 2x com DPBS frio. Armazene a pelota no gelo e prossiga com a preparação da amostra.</li>
</ol>3. Preparação da amostra
<ol><li>Lysates HDF<ol>
<li>Determinar os mais altos níveis de proteína de MeCP2 utilizando o método REAP para fracionamento subcelular nos compartimentos subcelulares citoplasmáticos e nucleares de acordo com Suzuki et al.11. Limitar o fracionamento a não mais de seis amostras por experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lysates cerebrais de camundongos<ol>
<li>Prepare 100 mL de cada reagente de lyse hipotônica e tampão de extração.<ol>
<li>Para o reagente de lise hipotônica, misture bem 10 mM HEPES, 1,5 mM cloreto de magnésio e cloreto de potássio de 10 mM.</li>
			<li>Para o tampão de extração, misture bem 20 mM HEPES, 1,5 mM cloreto de magnésio, 0,42 M cloreto de sódio, 0,2 mM EDTA e 25% (v/v) glicerol.</li>
			<li>Ajuste o pH de ambos os buffers para 7,9.</li>
			<li>Adicione 1 mM dithiothreitol (DTT) e 1x coquetel inibidor de protease a ambos os buffers recentemente. Esfrie no gelo antes de usar.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Suspender 100 mg de cérebro total do rato (cepa: C57BL/6J, macho e fêmea selvagem e B6.129P2(C)-Mecp2tm1.1Bird/J, hemizygous masculino e heterozigoso feminino; idade: 4-8 semanas de idade) em 1 mL de reagente de llysis hipotônica gelada.</li>
		<li>Homogeneize o cérebro com um homogeneizador de tecido dounce pré-refrigerado por 15 golpes de homogeneizador A (solto, para grande folga) e B (apertado, para pequena folga), respectivamente.</li>
		<li>Transfira as células homogeneizadas para um tubo limpo e centrífuga a 10.000 x g por 20 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante (ou mantenha-o como fração citoplasmática para uso posterior).</li>
		<li>Ressuspensão da pelota em 140 μL de tampão de extração por 100 mg de material inicial. Coloque o tubo em um termobloco pré-resfriado e misture suavemente por 30 min a 4 °C.</li>
		<li>Centrifugar o tubo a 16.000 g por 10 min a 4 °C. Transfira o sobrenadante (ou seja, a fração nuclear) para um novo tubo pré-refrigerado e armazene a -80 °C até o uso. NOTA: A concentração proteica de lysates derivados do cérebro do camundongo e hdfs pode ser avaliada pelo ensaio de proteína BCA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Protocolo MeCP2-ECLIA
<ol><li>Preparação da solução de lavagem, bloqueio do tampão e solução diluente de ensaio (dia 1)<ol>
<li>Adicione 500 μL de Tween 20 a 1 L de PBS para preparar uma solução De 0,05% Tween 20 na solução PBS, misture vigorosamente e rotule como "solução de lavagem". NOTA: Certifique-se de que apenas o tampão de lavagem recém-preparado é usado.</li>
		<li>Prepare uma solução de bloqueio de 3% do bloqueador A (Tabela de Materiais)em solução salina tampoprotetora da fosfato (PBS). Misture com agitação suave, filtre esterilize e mantenha-os na geladeira até usar por no máximo duas semanas.</li>
		<li>Adicionar 5 mL de solução de bloqueio a 10 mL de PBS para preparar a solução diluente de ensaio (1% de bloqueador A na PBS).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Revestimento de placas de alta ligação<ol>
<li>Pegue uma placa de ligação de 96 polegadas de 96 polegadas. NOTA: As placas de ligação elevada têm maior capacidade de ligação e, portanto, um alcance dinâmico maior do que as placas padrão com superfícies hidrofóbicas.</li>
		<li>Descongele o anticorpo anti-MeCP2 do rato monoclonal no gelo e misture 0,67 μL do anticorpo com 4 mL de PBS (diluição de anticorpos 1:6.000 no PBS). Vórtice a solução de anticorpos para misturar bem e rotular o tubo como "solução de revestimento".</li>
		<li>Dispense cuidadosamente 25 μL de solução de revestimento no canto inferior de cada poço usando um pipettor multicanal; isso é chamado de método de revestimento de solução. Toque suavemente na placa de 96 poços de cada lado para garantir que a solução de revestimento cubra a parte inferior de cada poço.</li>
		<li>Sele a placa com uma folha de adesivo e incubar a placa na geladeira a 4 °C durante a noite (12-16 h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bloqueio (dia 2)<ol>
<li>Retire o prato da geladeira e retire a folha.</li>
		<li>Remova a solução de revestimento de anticorpos, apertando-a no cesto de resíduos e bata a placa em uma toalha de papel para remover toda a solução de revestimento dos poços.</li>
		<li>Adicione 125 μL de solução de bloqueio por poço. Sele a placa novamente e coloque-a em um agitador de microplacas orbitais.</li>
		<li>Incubar a placa por 90 min em temperatura ambiente com agitação constante a 800 rpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparações de normas e amostras<ol>
<li>Durante o tempo de incubação, prepare os padrões de proteína MeCP2 e/ou TAT-MeCP2 e várias amostras. NOTA: O tampão de lyse utilizado para diluição padrão deve ser o mesmo utilizado nas amostras analisadas.</li>
		<li>Retire um frasco de solução de estoque de proteína MePC2 e/ou TAT-MeCP2 (250 μg/mL), lysates cerebrais de camundongos e lysates HDF de -80 °C. Descongelá-los no gelo.</li>
		<li>Diluir a solução padrão de estoque (MeCP2 e/ou TAT-MeCP2) em tubos limpos de acordo com a Tabela 2.</li>
		<li>Diluir as amostras no tampão de lysis da seguinte forma: 1−20 μg de lysate cerebral de camundongos por 25 μL de tampão de lysis, e 0,25-1 μg de hdf lysate por 25 μL de tampão de lysis. Prepare volume suficiente de cada amostra para realizar a análise em triplicado.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Padrão</td>
			<td>Concentração</td>
			<td>Diluição</td>
		</tr>
<tr>
<td>Padrão 1</td>
			<td>1.800 ng/mL</td>
			<td>1,08 μL Solução de estoque padrão + tampão de lysis de 148,92 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Padrão 2</td>
			<td>600 ng/mL</td>
			<td>Tampão de lysis padrão de 50 μL + 100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Padrão 3</td>
			<td>200 ng/mL</td>
			<td>Tampão de lysis padrão de 50 μL + 100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Padrão 4</td>
			<td>66,67 ng/mL</td>
			<td>Tampão de lysis padrão de 50 μL 3 + 100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Padrão 5</td>
			<td>22.22 ng/mL</td>
			<td>Tampão de lysis padrão de 50 μL 4 + 100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Padrão 6</td>
			<td>7.41 ng/mL</td>
			<td>Tampão de lysis padrão de 50 μL 5 + 100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Padrão 7</td>
			<td>2,47 ng/mL</td>
			<td>Tampão de lysis padrão de 50 μL 6 + 100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Padrão 8</td>
			<td>0,82 ng/mL</td>
			<td>Tampão de lysis padrão de 50 μL 7 + 100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Padrão 9</td>
			<td>0,27 ng/mL</td>
			<td>Tampão de lysis padrão de 50 μL 8 + 100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Padrão 10</td>
			<td>0 ng/mL</td>
			<td>Tampão de lysis de 150 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Série padrão de 0 a 1.800 ng/mL.
<ol start="5"><li>Adicionando as amostras e soluções padrão<ol>
<li>Remova a solução de bloqueio, apertando-a no cesto de resíduos e bata na placa em uma toalha de papel para remover toda a solução de bloqueio dos poços.</li>
		<li>Lave a placa 3x com 150 μL de solução de lavagem adicionando a solução de lavagem e removendo-a imediatamente.</li>
		<li>Adicione 25 ul de padrões e amostras ao canto inferior do poço usando uma pipeta de canal único.</li>
		<li>Sele a placa e incuba a placa por 4 h em temperatura ambiente com agitação constante a 800 rpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anticorpo de detecção não rotulado<ol>
<li>Descongele o anticorpo policlonal anti-MeCP2 no gelo. Diluir o anticorpo 1:6.000 em solução diluída de ensaio.</li>
		<li>Remova as normas e amostras, apertando-as no cesto de resíduos e bata a placa em uma toalha de papel.</li>
		<li>Lave a placa 3x com 150 μL de solução de lavagem adicionando a solução de lavagem e removendo-a imediatamente.</li>
		<li>Adicione 25 μL de anticorpo de detecção não rotulado a cada poço com o pipettor multicanal. Sele a placa e incuba-a por 1h com agitação constante a 800 rpm à temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anticorpo conjugado específico<ol>
<li>Retire o anticorpo secundário específico(Tabela de Materiais)da geladeira e coloque-o no gelo. Diluir o anticorpo 1:666.67 na solução diluída do ensaio e misturar suavemente.</li>
		<li>Remova o anticorpo secundário livre sem rótulo, apertando-o no cesto de lixo e bata o prato em uma toalha de papel.</li>
		<li>Lave a placa 3x com 150 μL de solução de lavagem adicionando a solução de lavagem e removendo-a imediatamente.</li>
		<li>Adicione 25 μL de anticorpos conjugados específicos(Tabela de Materiais)a cada poço com o pipettor multicanal. Sele a placa e incuba por 1 h com agitação constante a 800 rpm à temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lendo a placa<ol>
<li>Remova o anticorpo conjugado livre(Table of Materials)apertando-o no cesto de resíduos e bata a placa em uma toalha de papel.</li>
		<li>Lave a placa 3x com 150 μL de solução de lavagem.</li>
		<li>Adicione 150 μL de 1x tampão de leitura de ouro baseado em Tris(Tabela de Materiais)com surfactante contendo tripropylamina como co-reandré para a geração de luz para a placa. Evite bolhas de ar utilizando técnicas de pipetting reversa.</li>
		<li>Coloque a placa na plataforma de detecçãode microplacas (Tabela de Materiais)e inicie a medição imediatamente. Use as configurações para aquisição de placas de 96 poços.</li>
		<li>Capture os sinais de eletroquímicailuminescência por uma câmera CCD embutida em um sistema de detecção de eletroquímicailuminescência (Tabela de Materiais) e registre as contagens de sinais, que correspondem a unidades de luz relativa (RLU) e são diretamente proporcionais à intensidade da luz. NOTA: Após a estimulação eletroquímica, o rótulo de rutênio ligado ao eletrodo de carbono emite luz de luminescência a 620 nm. Analisar dados com o software acompanhado por instrumentos (Tabela de Materiais).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Para medir os níveis endógenos de MeCP2, MeCP2 recombinante e TAT-MeCP2, foi desenvolvida uma placa eclia de 96 poços. Foi demonstrado que a perda da função proteica MeCP2 leva à síndrome de TRT6, para a qual o tratamento está atualmente limitado ao gerenciamento de sintomas e fisioterapia. Um caminho promissor para o tratamento é a chamada terapia de reposição de proteínas, onde os níveis de MeCP2 podem ser titulados até a concentração necessária12,<sup class="x...

O imunoensaio eletroqueiluminescência (ECLIA) baseia-se em um processo que utiliza rótulos projetados para emitir luminescência quando estimulados eletroquimicamente. É uma técnica amplamente aplicável para a detecção quantitativa de analitos biológicos na indústria básica e na pesquisa acadêmica, na indústria alimentícia, bem como nos diagnósticos clínicos1. Comumente, uma placa descartável de 96 poços com eletrodos de tinta de carbono é usada. Estes eletrodos agem como um portador de fase sólida para o imunoensaio. Um anticorpo secundário é conjugado a um rótulo eletroquímico e quando a eletricidade é aplicada ao sistema, a emissão de luz da etiqueta química é acionada. Um dispositivo de carga de ruído ultra-baixo (CCD) registra a intensidade da luz que é diretamente proporcional ao antígeno ligado ao anticorpo de captura, resultando na quantificação do analito alvo da amostra2. Em comparação com o ensaio imunosorbent ligado à enzima (ELISA), o ECLIA é considerado vantajoso, pois oferece maior sensibilidade e reprodutibilidade, bem como melhor automação e consistência3.
Aqui analisamos os níveis de proteína de ligação metil-CpG 2 (MeCP2) em amostras de origem humana e murina, bem como diferentes variantes da proteína recombinante usando o recém-desenvolvido sistema ECLIA. MECP2 é uma proteína de ligação de ácido nucleico ligada a X conhecida por interagir com seqüências de DNA metilados. Esta proteína foi implicada na regulação da expressão genética4,5. Mutações de perda de função no gene que codifica essa proteína são os principais culpados pela síndrome de Rett (TRT), uma grave desordem neurodesenvolvimentista6. Outro distúrbio relacionado ao MECP2, a síndrome da duplicação do MECP2, também leva a sintomas neurológicos que podem se sobrepor aos da TRT7. Notavelmente, as fêmeas são mais afetadas pela TT, enquanto os machos são mais acometidos pela síndrome de duplicação MECP2 6,7.
Esses transtornos estão associados a níveis insuficientes ou excessivos de MeCP2, respectivamente, no sistema nervoso central (SNC). Assim, as opções de tratamento para tRT que envolvem o aumento dos níveis de MeCP2 no CNS precisariam evitar os efeitos prejudiciais associados ao excesso de MECP27. Devido a esse fato, uma quantificação altamente sensível e precisa dos níveis de proteína MeCP2, conforme fornecido pelo sistema ECLIA, é crucial para o avanço da TRT, bem como a pesquisa da síndrome da duplicação mecp2. As medidas precisas dos níveis endógenos e exógenos de MeCP2 de linhas de células humanas e amostras de tecido de camundongos, bem como uma proteína recombinante composta pelo isoform ebeuco B humano MeCP2 (também conhecido como isoform e1), e um domínio mínimo de transdução n-terminal HIV-TAT (TAT-MeCP2) que tem o potencial de atravessar abarreirahemato-cérebro-8,9 são apresentadas neste trabalho.

<table><tbody><tr><td>1,4-Ditiotreitol (DTT)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td>Reagente de lise hipotônica, tampão de extração</td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td>500-0006</td><td>Detecção de preparação de amostra</td></tr><tr><td>AB SULFO-TAG rotulado como anti-coelho</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>R32AB-1</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>Discovery workbench 4.0</td><td>Meso Scale Discovery</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>DMEM (1X)</td><td>gibco por Life Technologies</td><td>41966-029</td><td>Preparação de amostra</td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (estéril)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>Preparação de amostras, solução de lavagem, solução de revestimento</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>Tampão de extração Soro</td></tr><tr><td>bovino fetal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td>Preparação de amostras</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td>Tampão</td></tr> de <tr><td>extração Gold Read Buffer T (1x) com surfactante</td><td>Meso Scale Diagnóstico</td><td>R92TG</td><td>MeCP2 Protocolo ECLIA</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Reagente de lise hipotônica, tampão de extração</td></tr><tr><td>KIMBLE Conjunto de moedor de tecido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8938</td><td>Preparação de amostras</td></tr><tr><td>Agitador de laboratório, movimento de balanço (baixa velocidade)</td> <td>GFL</td><td>3014</td><td>MeCP2 Protocolo ECLIA</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado (MgCl * 6H20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>Reagente de lise hipotônica, Tampão de extração</td></tr><tr><td>MeCP2 (Humano) Proteína recombinante (P01)</td><td>Abnova Corporation</td><td>H00004204-P01</td><td>Tratamento celular</td></tr><tr><td>Microseal B seal</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td>MSB1001</td><td>para selagem de placas</td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-MeCP2, produzido em camundongo, clone Mec-168, imunoglobulina purificada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6818-100UL; RRID:AB_262075</td><td>Anticorpo, solução de revestimento</td></tr><tr><td>MSD Blocker A</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>R93BA-4</td><td>Blocker</td></tr><tr><td>MSD SECTOR Imager 2400</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>I30AA-0</td><td>MeCP2 Protocolo ECLIA</td></tr><tr><td>Multi-Array 96-well Plate</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>L15XB-3/L11BX-3</td><td>MeCP2 ECLIA protocol</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>gibco da Life Technologies</td><td>15140122</td><td>Preparação de amostras</td></tr><tr><td>Anti-MeCP2 policlonal, produzido em coelhos</td><td>Eurogentec S.A.</td><td>cloreto de potássio de</td><td>anticorpo</td>personalizado</tr><tr><td>(KCl)</td> <td>Merck KGaA</td><td>1049361000</td><td>Reagente de lise hipotônica</td></tr><tr><td>Primário AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB1404063; RRID: AB_10737296</td><td>Camundongo</td></tr><tr><td>AB primário de anticorpo, anti-MeCP2 (4B6)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>WH0004204M1; RRID: AB_1842411</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo AB primário de anticorpo, anti-MeCP2 (Mec-168)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M6818; RRID: AB_262075</td> Camundongo AB primário de <td>anticorpo</td></tr><tr><td>, anti-MeCP2 (Men-8)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M7443; RRID: AB_477235</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>Primário AB Coelho, anti-MeCP2 (D4F3)</td> <td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>3456S; RRID:AB_2143849</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel de inibidor de protease de anticorpo (100X)</td><td>Reagente de lise hipotônica</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>8340</td>, tampão de extração</tr><tr><td>secundário AB, coelho, anti-MeCP2</td><td>Eurogentec S.A.</td><td>AB secundário feito sob encomenda</td> do <td>anticorpo</td></tr><tr><td>, coelho, anti-MeCP2</td><td>Merck</td><td>07-013</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Tampão da extração</td>de <td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td></tr><tr><td>SULFO-TAG Marcado Anticorpo do Anti-coelho (cabra)</td><td>Meso Scale Diagnósticos</td><td>W0015528S</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>TAT-MeCP2</td><td>produção</td><td></td> interna da proteína da fusão <td>Tratamento celular</td></tr><tr><td>Tripsina EDTA 0,25% (1X)</td> <td>gibco da Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>Tratamento celular</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td>Solução de lavagem</td></tr></tbody></table>

um ensaio baseado em eletroquimiluminescência para variantes de proteína mecp2

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

O ECLIA é um método versátil que é capaz de quantificar quantidades de proteínas endógenas e recombinantes em um formato de 96 poços. Para demonstrar a eficiência do ECLIA, este ensaio foi utilizado para analisar os níveis intrínsecos de MeCP2 no tecido cerebral do camundongo e a captação de TAT-MeCP2 em fibroblastos dérmicos humanos. O MeCP2-ECLIA produz medidas altamente precisas e reprodutíveis com baixo erro intra e interensaio. Em resumo, desenvolvemos um método quantitativo para a avaliação de variantes proteicas MeCP2 que podem ser utilizadas em telas de alto throughput.

O princípio do sistema ECLIA é descrito na Figura 1. As curvas padrão para duas variantes MeCP2 são mostradas na Figura 2. A quantificação precisa foi possível em uma ampla gama de concentrações (1-1.800 ng/mL). Na Figura 3,foram analisados os níveis de Lnadameado derivados do cérebro do rato e dos HDFs. A expressão mecp2 em lisatos nucleares cerebrais de camundongos heterozigos, selvagens e camundongos nocauteados foi comparada na ...

O imunoensaio eletroqueiluminescence (ECLIA) é uma nova abordagem para detecção quantitativa de variantes de proteína MeCP2 endógenas e exógenamente aplicadas, que produz medições altamente quantitativas, precisas e reprodutíveis com baixo erro intra e interensaio sobre uma ampla gama de trabalho. Aqui, o protocolo para o MeCP2-ECLIA em um formato de 96 poços é descrito.

Um ensaio baseado em eletroquimiluminescência para variantes de proteína MeCP2

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

O ECLIA é um método simples, mas eficiente, para quantificar os níveis celulares de MeCP2. O ECLIA é rápido, mais sensível e mais fácil de manusear em comparação com outros métodos de quantificação, como a mancha ocidental e a ELISA. Para preparar a solução de lavagem, que é 0,5%Tween 20 em PBS, adicione 500 microliters de Tween 20 a um litro de PBS e misture vigorosamente.Prepare uma solução de bloqueio de 3% Bloqueador A e PBS e mexa suavemente. Esterilize a solução de bloqueio por filtragem. Para preparar a solução diluente de ensaio, 1%Blocker A e PBS, adicione cinco mililitros de solução de bloqueio a 10 mililitros de PBS.Em seguida, descongele o anticorpo anti-MeCP2 do rato monoclonal no gelo. Misture 0,67 microliters do anticorpo com quatro mililitros de PBS, depois vórtice da solução. Para a solução revestir a placa de ligação de 96 poços, dispense cuidadosamente 25 microliters de solução de revestimento no canto inferior de cada poço, usando um pipetter multicanal.Dab a placa de 96 poços suavemente de cada lado para garantir que a solução de revestimento cubra a parte inferior de cada poço. Sele a placa com papel alumínio adesivo e incuba durante a noite a quatro graus Celsius. Retire a placa de 96 poços da geladeira e retire a folha.Remova a solução de revestimento de anticorpos nos poços, jogando-a em um recipiente de resíduos. Em seguida, toque na placa em uma toalha de papel para remover qualquer solução restante. Em seguida, adicione 125 microliters de solução de bloqueio a cada poço.Em seguida, sele novamente a placa com papel alumínio. Coloque a placa em um agitador de microplaco orbital, fixado em 800 RPM, e incuba-a por 90 minutos em temperatura ambiente. Descongele no gelo um frasco de solução de estoque de proteínas MeCP2 ou Tat-MeCP2, lises cerebrais de camundongos e lisess hdf.Diluir a solução de estoque de proteínas em tubos limpos, conforme descrito na tabela dois do manuscrito. Em seguida, diluir as amostras de lise. Para os lises cerebrais do camundongo, use de um a 20 microgramas por 25 microliters de tampão de lise.Para o hdf lysate, adicione 0,25 a um micrograma por 25 microliters de tampão de lise. Depois que a placa de 96 poços estiver incubada por 90 minutos, remova a solução de bloqueio dos poços, jogando-a em um recipiente de lixo. Em seguida, toque na placa em uma toalha de papel para remover qualquer solução restante.Em seguida, lave a placa três vezes com 150 microliters de solução de lavagem, adicionando a solução de lavagem e removendo-a imediatamente. Adicione 25 microliters de padrões e amostras aos poços da placa de 96 poços. Sele a placa e incuba-a por mais quatro horas em temperatura ambiente com constantes tremores de 800 RPM.Descongele o anticorpo de detecção não rotulado, coelhinho policlonal anti-MeCP2, no gelo. Utilizando solução diluída de ensaio, diluir o anticorpo em uma proporção de um a 6.000. Quando a placa de 96 poços terminar de incubar no agitador, remova os padrões e amostras, jogando a placa em um recipiente de resíduos.Em seguida, toque na placa em uma toalha de papel para remover qualquer solução restante. Lave a placa três vezes com 150 microliters de solução de lavagem adicionando a solução de lavagem e removendo-a imediatamente. Adicione 25 microliters de solução de anticorpos de detecção sem rótulo para cada poço com o pipetter multicanal.Sele a placa e incuba-a por uma hora em temperatura ambiente com agitação constante a 800 RPM. Obtenha o anticorpo secundário específico da geladeira e coloque-o um gelo. Diluir o corpo secundário na solução diluída do ensaio e misture suavemente.Para remover o anticorpo de detecção sem rótulo livre da placa de 96 poços, entre no recipiente de resíduos e, em seguida, bata a placa em uma toalha de papel. Depois de lavar a placa três vezes como descrito perviosamente, adicione 25 microliters de anticorpo secundário a cada poço com o pipetter multicanal. Sele a placa e incuba-a por uma hora em temperatura ambiente com agitação constante a 800 RPM.Remova o anticorpo secundário livre, clicando no recipiente de lixo e batendo na placa em uma toalha de papel e, em seguida, lave a placa três vezes, como descrito anteriormente. A cada poço da placa, adicione 150 microlitadores de 1X Tris base Gold Read Buffer com surfactante, contendo tripropilamina como um coreactante para geração de luz. Para evitar produzir bolhas de ar, use técnicas de tubulação reversa.Coloque a placa de 96 poços na plataforma de microplaca com sistema de detecção de eletroquimiluminascência. Usando a câmera CCD incorporada, comece imediatamente a capturar dados. Contagem de sinais de registro que correspondem a unidades de luz relativas e são diretamente proporcionais à intensidade da luz.As curvas padrão MeCP2 foram geradas a partir de MeCP2 humano em múltiplas medições. O ECLIA pode quantificar com precisão meCP2 humano recombinante sobre uma faixa de um nanograma por mililitro a 1800 nanogramas por mililitro. Usando ECLIA, os níveis de proteína MeCP2 foram medidos em lises nucleares cerebrais de camundongos heterozigosos e fêmeas e de um rato-nocaute MeCP2.O ECLIA foi conduzido em lisescelulares a partir de um controle saudável e da linha celular c. 806delG usada como modelo para síndrome de Rett. Nenhuma proteína MeCP2 foi detectada nas linhas celulares mutantes pela ECLIA ou por imunofluorescência.O ECLIA também foi usado para investigar a absorção de Tat-MeCP2 pela linha de celular deficiente MeCP2 horas extras. A precisão eclia inter e intra ensaio foi determinada ao longo de três dias consecutivos. Para futura terapia de substituição de proteínas, a entrega de MeCP2 pode ser repetidamente otimizada após a avaliação do nível de proteína pela ECLIA.

an-electrochemiluminescence-based-assay-for-mecp2-protein-variants

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Um barato, o método de elevada capacidade para detecção simultânea de até 43 alvos moleculares é descrito. Aplicações de mPCR / RLB incluem digitando microbiana e detecção de patógenos múltiplos a partir de amostras clínicas.

Multiplex PCR e hibridação reversa Linha Assay Blot (mPCR / RLB)

Neste vídeo, demonstramos o imunoensaio de eletroquimioluminescência para a quantificação dos níveis de proteína-alvo em diferentes amostras. Este ensaio é baseado na luminescência produzida na reação eletroquímica. A intensidade da luz emitida é proporcional à quantidade da proteína alvo na amostra.

Ensaio de eletroquimioluminescência para quantificação dos níveis de proteína-alvo no lisado cerebral

Este vídeo descreve o western blotting baseado em quimioluminescência de lisados imunoprecipitados. A técnica ajuda a determinar o processamento e a ativação de proteínas. O sinal quimioluminescente detectado é proporcional ao nível de processamento da proteína durante sua ativação.

Ensaio de Western Blot Quimioluminescente para Processamento de Proteínas

Biomarcadores de medição em amostras biológicas complexas é cada vez mais guiando tomada de decisão clínica. Nós descrevemos um método altamente sensível para medir simultaneamente miosina cardíaca binding protein-C, MB da creatina quinase e troponina I em amostras de soro de pacientes com infarto do miocárdio e controle de indivíduos saudáveis.

Um método de quantificação sensível e específico para Determinação do Serum miosina cardíaca Binding Protein-C por Imunoensaio electroquimioluminescência

Nós descrevemos um de alto rendimento, multiplex, e ensaio de líquido cefalorraquidiano proteômica alvo (CSF) desenvolvido com potencial para a tradução clínica. O teste pode quantificar potenciais marcadores e os factores de risco para a neurodegeneração, tais como as variantes de apolipoproteína E (E2, E3 e E4), e medir a sua expressão alélica.

A High Throughput, multiplexados e alvejado proteômica CSF Ensaio para quantificar Neurodegenerativas Biomarkers e apolipoproteína E isoformas Estado

Nós relatamos um gancho de cabelo pequeno RNA (shRNA) e a próxima geração baseada no sequenciamento protocolo identificando os reguladores da inativação do cromossomo x em uma linha de celular murino com luciferase de vaga-lume e genes de resistência de hptII fundiram para o metil CpG ligação proteína 2 ( MeCP2) Gene no cromossomo X inativo.

Em pool shRNA tela para reativação de MeCP2 no cromossomo X inativo

Aqui, apresentamos um protocolo para uma purificação eficiente passo a passo do ativo humano sem marcas de formatação a translocação de 10-11-2 (TET2) 5-metilcitosina dioxigenase usando cromatografia de permuta iónica e seu ensaio usando uma massa em tandem-cromatografia líquida espectrometria (LC-MS/MS)-com base em abordagem.

Purificação eficiente e desenvolvimento de ensaio baseado no LC-MS/MS para dez-onze translocação-2 5-metilcitosina dioxigenase

Aqui, nós descrevemos um protocolo para gerar um modelo murino fêmea viável com inactivation não-aleatório do cromossoma de x, isto é, o cromossoma de x maternally-herdado é inativo em 100% das pilhas. Nós igualmente descrevemos um protocolo para testar a viabilidade, a tolerabilidade, e a segurança da reactivação farmacológica do cromossoma de X inativo in vivo.

Um modelo de camundongo não aleatório para reativação farmacológica de Mecp2 no cromossomo X inativo

A ubiquização CENP-A é um importante requisito para a deposição do CENP-A no centromere, herdada por dimerização entre divisão celular e indispensável à viabilidade celular. Aqui descrevemos a análise da espectrometria em massa para identificar a ubiquização da proteína CENP-A (EYFP-CENP-A) marcada pela EYFP.

Análise de espectrometria de massa para identificar a ubiquização do CENP-A marcado pelo EYFP (EYFP-CENP-A)

As metiltransferases de DNA são potenciais alvos de drogas contra o câncer. Aqui, um protocolo é apresentado para avaliar pequenas moléculas para inibição da DNA metiltransferase. Este ensaio utiliza uma endonuclease para acoplar a metilação do DNA à geração de fluorescência e permite que a atividade enzimática seja monitorada em tempo real.

Ensaio de metilação de DNA acoplado à endonuclease à base de fluorescência contínua para triagem de inibidores da DNA metiltransferase

Aprenda a quantificar variantes da proteína MeCP2 usando o ensaio de eletroquimiluminescência (ECLIA) em placa de 96 poços. Este método oferece alta sensibilidade e reprodutibilidade para pesquisas em neurociência.

Um ensaio baseado em eletroquimiluminescência para variantes de proteína MeCP2

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