Name: Otimização para Sequenciamento e Análise de Amostras de RNA FFPE-RNA degradadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Aprenda a otimizar o sequenciamento de RNA degradado de amostras FFPE para melhorar a qualidade dos dados de expressão gênica. Este método avalia a qualidade do RNA em tecidos fixados em formalina e parafina, permitindo a caracterização de transcritos em amostras biológicas e clínicas subótimas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Somos gratos à Dra. Danielle Carrick (Divisão de Controle do Câncer e Ciências Populacionais do Instituto Nacional de Câncer) por ajuda contínua, especialmente por iniciar este estudo, fornecendo-nos as amostras e sugestões úteis durante a análise de dados. Agradecemos sinceramente a todos os membros do Centro de Sequenciamento da CCR no Laboratório Nacional de Pesquisa do Câncer de Frederick por sua ajuda durante a preparação e sequenciamento da amostra, especialmente Brenda Ho pela assistência na amostra QC, Oksana German para a biblioteca QC, Tatyana Smirnova para executar os sequenciadores. Também gostaríamos de agradecer a Tsai-wei Shen e Ashley Walton no Sequencing Facility Bioinformatics Group por ajudar na análise de dados e na implementação do pipeline RNA-seq. Agradecemos também à CCBR e à NCBR pela assistência com o pipeline de análise da RNaseq e o desenvolvimento de melhores práticas.

<ol><li>Carrick, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+Next+Generation+Sequencing+on+Older+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue.</a> PLoS One. 10 (7), 0127353(2015).</li>
<li>Hedegaard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+of+RNA+and+DNA+isolated+from+paired+fresh-frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+samples+of+human+cancer+and+normal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing of RNA and DNA isolated from paired fresh-frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples of human cancer and normal tissue.</a> PLoS One. 9 (5), 98187(2014).</li>
<li>Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Utilization+of+Formalin+Fixed-Paraffin-Embedded+Specimens+in+High+Throughput+Genomic+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Genomics%22%5BJournal%5D)">The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies.</a> International Journal of Genomics. 2017, 1926304(2017).</li>
<li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids.</a> American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li>
<li>von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+RNA+quality+from+FFPE+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Determinants of RNA quality from FFPE samples.</a> PLoS One. 2 (12), 1261(2007).</li>
<li>Esteve-Codina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+RNA-Seq+Results+from+Paired+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+and+Fresh-Frozen+Glioblastoma+Tissue+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Comparison of RNA-Seq Results from Paired Formalin-Fixed Paraffin-Embedded and Fresh-Frozen Glioblastoma Tissue Samples.</a> PLoS One. 12 (1), 0170632(2017).</li>
<li>Vukmirovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+differentially+expressed+transcripts+by+RNA-sequencing+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+%28FFPE%29+lung+tissue+from+patients+with+Idiopathic+Pulmonary+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pulmonary+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of differentially expressed transcripts by RNA-sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) lung tissue from patients with Idiopathic Pulmonary Fibrosis.</a> BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 15(2017).</li>
<li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li>
<li>Sinicropi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+transcriptome+RNA-Seq+analysis+of+breast+cancer+recurrence+risk+using+formalin-fixed+paraffin-embedded+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Whole transcriptome RNA-Seq analysis of breast cancer recurrence risk using formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissue.</a> PLoS One. 7 (7), 40092(2012).</li>
<li>Altekruse, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEER+cancer+registry+biospecimen+research%3A+yesterday+and+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology%2C+Biomarkers+%26+Prevention%22%5BJournal%5D)">SEER cancer registry biospecimen research: yesterday and tomorrow.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 23 (12), 2681-2687 (2014).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+RNA+sequencing+on+older+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+from+high-grade+ovarian+serous+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Robustness of RNA sequencing on older formalin-fixed paraffin-embedded tissue from high-grade ovarian serous adenocarcinomas.</a> PLoS One. 14 (5), 0216050(2019).</li>
<li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22(2017).</li>
<li>Amini, P., Nassiri, S., Ettlin, J., Malbon, A., Markkanen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+RNA+sequencing+of+FFPE+subsections+reveals+highly+conserved+stromal+reprogramming+between+canine+and+human+mammary+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Next-generation RNA sequencing of FFPE subsections reveals highly conserved stromal reprogramming between canine and human mammary carcinoma.</a> Disease Models and Mechanisms. 12 (8), (2019).</li>
<li>Wimmer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA+quality%2C+microarray+data+reliability+and+pathway+analysis+in+fresh%2C+fresh+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA quality, microarray data reliability and pathway analysis in fresh, fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6351(2018).</li>
<li>Babraham Bioinformatics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2019).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet.journal%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Babraham Bioinformatics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/</a> (2019).</li>
<li>Wood, D. E., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kraken%3A+ultrafast+metagenomic+sequence+classification+using+exact+alignments%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments.</a> Genome Biology. 15 (3), 46(2014).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Broad Institute. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://broadinstitute.github.io/picard/">http://broadinstitute.github.io/picard/</a> (2019).</li>
<li>Wang, L., Wang, S., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RSeQC%3A+quality+control+of+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RSeQC: quality control of RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).</li>
<li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Kaller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiQC%3A+summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).</li>
<li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RSEM%3A+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323(2011).</li>
<li>Son, K., Yu, S., Shin, W., Han, K., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Guideline+to+Assess+the+Characteristics+of+RNA-Seq+Data%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">A Simple Guideline to Assess the Characteristics of RNA-Seq Data.</a> BioMed Research International. 2018, 2906292(2018).</li>
<li>McCarthy, D. J., Chen, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+analysis+of+multifactor+RNA-Seq+experiments+with+respect+to+biological+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation.</a> Nucleic Acids Research. 40 (10), 4288-4297 (2012).</li>
<li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((edgeR%3A+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li>
<li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47(2015).</li>
<li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+set+enrichment+analysis%3A+a+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 102 (43), 15545-15550 (2005).</li>
<li>Mootha, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGC-1alpha-responsive+genes+involved+in+oxidative+phosphorylation+are+coordinately+downregulated+in+human+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes.</a> Nature Genetics. 34 (3), 267-273 (2003).</li>
<li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+ontology%3A+tool+for+the+unification+of+biology.+The+Gene+Ontology+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium.</a> Nature Genetics. 25 (1), 25-29 (2000).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nature Protocols. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Research. 37 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Evaluating RNA Quality from FFPE Samples. Illumina. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf">https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf</a> (2016).</li>
</ol>

Esse trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional do Câncer (NCI), Instituto Nacional de Saúde (NIH). Leidos Biomedical Research, Inc. é a empreiteira de operações e suporte técnico do Laboratório Nacional de Pesquisa do Câncer de Frederick, que é totalmente financiado pelo NIH. Vários autores (YZ, MM, KT, YL, JS, BT) são afiliados à Leidos Biomedical Research, Inc., mas todos os autores são totalmente financiados pelo Instituto Nacional do Câncer, incluindo salários de autores e materiais de pesquisa. Leidos Biomedical Research, Inc. não forneceu salário para os autores (YZ, MM, KT, YL, JS, BT) ou material para o estudo, nem teve qualquer papel no desenho do estudo, coleta de dados, análise, decisão de publicar ou preparar o manuscrito.

O método descrito aqui descreve as principais etapas necessárias para obter bons dados de sequência de amostras de FFPE-RNA. Os principais pontos a serem considerados com este método são: (1) Certifique-se de que o RNA seja preservado da melhor forma possível após a extração, minimizando os ciclos de manuseio e congelamento e descongelamento da amostra. Alíquotas separadas do QC são muito úteis. (2) Use uma métrica QC que seja melhor para o conjunto amostral dado. Os valores rin e DV200 muitas vezes não são út...

O uso de abordagens de sequenciamento de última geração nos permitiu obter uma riqueza de informações de vários tipos de amostras. No entanto, amostras antigas e mal preservadas permanecem inviáveis para os métodos comumente utilizados de geração de dados de sequência e muitas vezes requerem modificações em protocolos bem estabelecidos. Os tecidos FFPE representam um tipo de amostra que tem sido amplamente utilizado para as amostras clínicas1,,2,3. Enquanto a preservação do FFPE mantém a morfologia tecidual, os ácidos nucleicos nos tecidos FFPE geralmente exibem uma ampla gama de danos e degradação, dificultando a recuperação das informações genômicas que podem levar a importantes insights sobre mecanismos moleculares subjacentes a vários distúrbios.
Os dados de expressão genética gerados pelo sequenciamento de RNA são frequentemente fundamentais no estudo de mecanismos de doença e resistência e complementam a análise da mutação do DNA. No entanto, o RNA é mais suscetível à degradação, tornando mais desafiador gerar dados precisos de expressão genética a partir de tecidos FFPE. Além disso, como a ampla disponibilidade e a acessibilidade do sequenciamento são relativamente recentes, os espécimes mais antigos muitas vezes não eram armazenados em condições necessárias para preservar a integridade do RNA. Algumas das questões para amostras de FFPE incluem a degradação do RNA devido à incorporação em parafina, modificação química do RNA levando à fragmentação ou refractoridade a processos enzimáticos necessários para sequenciamento, e perda das caudas poli-A, limitando a aplicabilidade do oligo-dT como uma cartilha para transcrição reversa4. Outro desafio é o manuseio/armazenamento de amostras de FFPE em condições subótimas, o que pode levar a uma maior degradação de moléculas labile, como o RNA nos tecidos5. Isso é especialmente relevante para amostras mais antigas que podem ter sido coletadas em um momento em que a análise da expressão genética pelo sequenciamento de RNA não foi antecipada para as amostras. Tudo isso leva à diminuição da qualidade e quantidade do RNA extraído disponível para gerar dados de sequência úteis. A baixa probabilidade de sucesso, combinada com o alto custo do sequenciamento, dissuadiu muitos pesquisadores de tentar gerar e analisar dados de expressão genética a partir de amostras de FFPE potencialmente úteis. Alguns estudos nos últimos anos demonstraram a usabilidade dos tecidos FFPE para análise de expressão genética2,,6,,7,,8,9, embora para amostras menores e/ou mais recentes.
Como estudo de viabilidade, utilizamos o RNA extraído de amostras de tecido tumoral FFPE de três repositórios de tecido residual de registros de câncer de Vigilância, Epidemiologia e Resultados Finais (SEER) para sequenciamento de RNA e análise de expressão genética10. Obtidos a partir de laboratórios de patologia clínica, os tecidos FFPE de adenocarcinomas sêmulas ovarianas de alto grau foram armazenados de 7 a 32 anos em condições variadas antes da extração do RNA. Como na maioria dos casos esses blocos foram armazenados em diferentes locais durante anos sem a expectativa de qualquer análise genética sensível no futuro, pouco cuidado havia sido tomado para preservar os ácidos nucleicos. Assim, a maioria das amostras apresentava RNA de má qualidade, com grande proporção de amostras contaminadas com bactérias. No entanto, conseguimos realizar quantificação genética, medir a uniformidade e a continuidade da cobertura genética e realizar a análise de correlação de Pearson entre réplicas biológicas para medir a reprodutibilidade. Com base em um conjunto de painéis genéticos de assinatura chave, comparamos as amostras em nosso estudo com os dados do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA) e confirmamos que aproximadamente 60% das amostras tinham perfis de expressão genética comparáveis11. Com base na correlação entre vários resultados de QC e metadados amostrais, identificamos métricas-chave de QC que têm bom valor preditivo para identificar amostras mais propensas a gerar dados de sequência utilizáveis11.
Descrevemos aqui a metodologia utilizada para avaliação da qualidade ffpe-RNA, geração de bibliotecas de sequenciamento a partir de amostras de RNA extraídas e análise bioinformática dos dados de sequenciamento.

<table><tbody><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent DNA 7500 Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1506</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Kit de DNA de Alta Sensibilidade</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA FFPE Kit</td><td>Qiagen</td><td>80234</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Touch System</td><td>Kit de</td> Quantificação <td>de Biblioteca 1855195</td><td></td>Bio-Rad</tr><tr><td>v2-Illumina</td><td>KapaBiosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>NEBProto Ultra II Direcional RNA Kit de Preparação para Biblioteca para Illumina</td><td>New England Biolabs</td><td>E7765S</td><td>https://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit</td></tr><tr><td>NEBPróximo Kit de Depleção de rRNA (Humano/Camundongo/Rato)</td><td>New England Biolabs</td><td>E6310L</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500 Sistema de Sequenciamento</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1001</td><td>NextSeq 500 Guia do sistema: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf</td></tr><tr><td>NextSeq PhiX Control Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3002</td><td></td></tr><tr><td>NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS)</td><td>Illumina</td><td></td><td></td>20024907</tr><tr><td>10X Separador Magnético Genomics 10X</td><td>Genomics</td><td>120250</td><td></td></tr><tr><td>Rotator Multimixer</td><td>VWR</td><td>13916-822</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Termociclador</td> Kit de reagentes de sequenciamento <td>de 1851197</td><td></td><td>Bio-Rad</td></tr> Pacote de células <tr><td></td><td>Illumina</td><td>20024907</td><td></td></tr><tr><td>Flow Illumina</td><td></td><td>20024907</td><td></td></tr><tr><td>Cartucho tampão e cartucho de reagente</td><td>Illumina</td><td>20024907</td><td></td></tr><tr><td>Solução de hidróxido de sódio (0,2N)</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0607D-6</td><td></td></tr><tr><td>TRIS-HCL Tampão 1,0M, pH 7,0</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-151-871</td><td></td></tr></tbody></table>

otimização para sequenciamento e análise de amostras de rna ffpe-rna degradadas

Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples

A análise da expressão genética pelo sequenciamento de RNA (RNA-seq) permite insights únicos em amostras clínicas que podem potencialmente levar à compreensão mecanicista da base de várias doenças, bem como mecanismos de resistência e/ou suscetibilidade. No entanto, os tecidos FFPE, que representam o método mais comum para preservar a morfologia tecidual em amostras clínicas, não são as melhores fontes para a análise de perfil de expressão genética. O RNA obtido a partir dessas amostras é muitas vezes degradado, fragmentado e quimicamente modificado, o que leva a bibliotecas de sequenciamento subótimo. Por sua vez, estes geram dados de sequência de baixa qualidade que podem não ser confiáveis para análise de expressão genética e descoberta de mutação. Para aproveitar ao máximo as amostras de FFPE e obter os melhores dados possíveis a partir de amostras de baixa qualidade, é importante tomar certas precauções enquanto planeja o projeto experimental, preparando bibliotecas de sequenciamento e durante a análise de dados. Isso inclui o uso de métricas apropriadas para controle preciso de qualidade de amostra (QC), identificando os melhores métodos para várias etapas durante a geração da biblioteca de sequenciamento e o QC cuidadoso da biblioteca. Além disso, a aplicação de ferramentas e parâmetros de software corretos para análise de dados de sequência é fundamental para identificar artefatos em dados RNA-seq, filtrar a contaminação e leituras de baixa qualidade, avaliar a uniformidade da cobertura genética e medir a reprodutibilidade dos perfis de expressão genética entre as réplicas biológicas. Essas etapas podem garantir alta precisão e reprodutibilidade para o perfil de amostras de RNA muito heterogêneas. Aqui descrevemos as várias etapas para a amostra QC, preparação da biblioteca e QC, sequenciamento e análise de dados que podem ajudar a aumentar a quantidade de dados úteis obtidos a partir de RNA de baixa qualidade, como o obtido a partir de tecidos FFPE-RNA.

A metodologia descrita acima foi aplicada a 67 amostras de FFPE armazenadas sob uma variedade de condições diferentes durante 7-32 anos (o tempo médio de armazenamento amostral foi de 17,5 anos). Os resultados de conjunto de dados e análise aqui apresentados foram previamente descritos e publicados em Zhao et al.11. Ao verificar a qualidade da amostra descrita anteriormente (ou seja, traços de exemplo na Figura 2), o DV100 foi considerado mais útil do que o...

Este método descreve as etapas para melhorar a qualidade e a quantidade de dados sequenciais que podem ser obtidos a partir de amostras de RNA incorporadas à parafina fixa-formalina (FFPE). Descrevemos a metodologia para avaliar com mais precisão a qualidade das amostras de FFPE-RNA, preparar bibliotecas de sequenciamento e analisar os dados das amostras de FFPE-RNA.

Otimização para Sequenciamento e Análise de Amostras de RNA FFPE-RNA degradadas

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding ...

Nosso protocolo pode ser usado para melhorar a qualidade e a quantidade de dados de expressão genética gerados a partir de amostras de RNA derivadas do FFPE, especialmente em amostras de qualidade subótima. Esta técnica avalia a qualidade do RNA dentro das amostras de tecido FFPE e permite a otimização de seu processamento a jusante para melhorar a quantidade e a qualidade dos dados de sequenciamento da amostra. Este método permite a caracterização abrangente de uma transcrição em amostra biológica e clínica e pode fornecer insights sobre elementos funcionais do genoma em desenvolvimento e doenças.A degradação do FFPE-RNA e a seleção dos métodos para QC amostral, preparação da biblioteca e análise de dados podem ser muito complicadas. Seja meticuloso ao selecionar os métodos certos e controles apropriados. A demonstração visual permite que os espectadores observem as pequenas modificações sutis e precauções necessárias durante o planejamento, avaliação e o processo de sequenciamento especialmente para amostras de FFPE mal preservadas.Para verificar a qualidade da amostra de RNA, execute a amostra em um sistema RNA QC de acordo com as instruções do fabricante e use o software de bioanálise apropriado para analisar a distribuição dos fragmentos de RNA dentro da amostra e calcular a proporção de fragmentos maiores que 100 e 200 nucleotídeos. Com base nas métricas do QC, identifique as amostras com menos de 40% dos fragmentos com mais de 100 nucleotídeos para permitir a exclusão dessas amostras do processamento. Para sequenciamento, descongele os kits apropriados de sequenciamento de reagente de acordo com os parâmetros de execução em um banho de água de temperatura ambiente e coloque a bandeja de reagente a quatro graus Celsius após o descongelamento.Coloque o pacote da célula de fluxo em temperatura ambiente por 30 minutos. Enquanto o pacote estiver aquecendo, abra o aplicativo Illumina Experiment Manager e selecione Criar folha de amostra. Selecione o sequenciador a ser usado e clique em Next.Digite o código de barras do kit de reagente e os outros parâmetros apropriados de fluxo de trabalho. Em seguida, carregue uma folha de amostra criada de acordo com os critérios de sequência de Illumina. Para preparar a biblioteca de amostras e a biblioteca de controle PhiX, desnaturar e diluir as bibliotecas para as concentrações apropriadas e misturar as bibliotecas de controle amostral e PhiX para obter uma razão de volume de controle PhiX de 5%.Quando as células de fluxo estiverem prontas, remova o embrulho, limpe a superfície do vidro com um lenço de álcool sem fiapos e seque o vidro com um tecido de laboratório de fiapos baixos. Remova o cartucho de reagente de quatro graus Celsius de armazenamento e inverta o cartucho cinco vezes para misturar os reagentes. Toque suavemente o cartucho no banco para reduzir as bolhas de ar e carregue a amostra desnaturada e diluída no cartucho de reagente no reservatório designado.Carregue a célula de fluxo, o cartucho tampão e o cartucho do reagente no sistema. Em seguida, realize uma verificação automatizada e revise a saída para garantir que os parâmetros de execução passem pela verificação do sistema. Quando a verificação automatizada estiver concluída, selecione iniciar a execução de sequenciamento.Para visualizar os resultados de QC pré-processamento e QC pós-alinhamento, execute vários QCs para gerar um relatório agregado em formato HTML. Para determinar os efeitos em lote e avaliar o mapa de qualidade do conjunto de dados dado, use um script R para executar uma análise de componente principal. A análise da correlação amostral pode então ser realizada utilizando-se a correlação de Pearson entre diferentes amostras.A estimativa da proporção de fragmentos com mais de 100 nucleotídeos é mais útil do que uma estimativa dos fragmentos com mais de 200 nucleotídeos, pois é mais sensível para medir com precisão a proporção de tamanhos de fragmentos menores para amostras de RNA altamente degradadas. Dado o alto grau de degradação no conjunto amostral, recomenda-se um método total de preparação da biblioteca de RNA. Por exemplo, aqui são mostradas bibliotecas de sequenciamento preparadas a partir de quatro amostras diferentes.Aqui, são mostradas visões gerais da qualidade de sequenciamento de arquivos FastQ bruta e conteúdo do adaptador de amostra. A triagem fastqc pode ajudar a detectar contaminação, como contaminação bacteriana ou de camundongos dentro das amostras. O alinhamento estelar pode ser usado para determinar a proporção de leituras mapeadas para o genoma de referência, a porcentagem de leituras mapeadas exclusivamente para o genoma de referência, e a proporção de leituras que não foram mapeadas, ou que foram mapeadas para vários loci.As estatísticas do cartão e do RSeQC podem ser usadas para determinar a porcentagem de RNAs mensageiros, bases intronicas e intergênicas presentes nas leituras mapeadas. Para essas análises representativas, algumas bibliotecas degradadas tinham um viés de três primos em que mais leituras foram mapeadas mais perto dos três primos do que do fim cinco primos. Além disso, a análise dos componentes principais pode ser realizada para determinar a porcentagem da variação total capturada pelos componentes principais para as réplicas biológicas de cada amostra.Tome cuidado para evitar a degradação da amostra, prepare réplicas e vários casacos para cada amostra, use as métricas apropriadas para avaliar a qualidade da amostra e use o método de preparação da biblioteca correta. Utilizando essa metodologia, estudos maiores de NGS podem ser realizados com amostras de FFPE anteriormente inutilizáveis com diferentes tempos de armazenamento e condições para obter insights sobre uma variedade de diferentes estados da doença. Essa técnica abriu caminho para os pesquisadores estudarem grandes arquivos existentes da amostra FFPE com informações clínicas ricas e podem melhorar muito os estudos sobre câncer de base populacional.

optimization-for-sequencing-and-analysis-of-degraded-ffpe-rna-samples

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

RNA-de sequenciamento e bioinformática análises foram utilizados para identificar fatores de transcrição significativamente e diferencialmente expressos em subpopulações Lin-CD34 + e Lin-CD34 @ de EMLcells do mouse. Estes fatores de transcrição pode desempenhar um papel importante na determinação da chave entre as células Lin-CD34 @ auto-renovação Lin-CD34 + e parcialmente diferenciados.

Identificação dos fatores chave que regula a auto-renovação e diferenciação em células precursoras hematopoéticas EML por Análise RNA-seqüenciamento

Descrevemos um método baseado em sequenciamento de RNA direcionado que inclui a preparação de bibliotecas de cDNA indexadas, hibridização e captura com sondas personalizadas e análise de dados para interrogar transcritos selecionados quanto à expressão gênica, mutações e fusões gênicas. O RNAseq direcionado permite uma avaliação rápida e econômica de transcritos selecionados em um sequenciador de desktop.

Targeted RNA Sequenciação Ensaio para Caracterizar expressão gênica e genômica Alterações

Este protocolo descreve a utilização combinatória de ChIP-seq, seq-4sU, RNA total-seq e Ribossoma profiling para linhas de células e as células primárias. Permite rastreamento de alterações em fator de transcrição vinculativas, novo de transcrição, processamento de RNA, volume de negócios e tradução ao longo do tempo e exibindo o curso geral dos acontecimentos nas células ativadas e/ou rápida mudança.

Análise em tempo real do fator de transcrição, ligação, transcrição, tradução e volume de negócios para exibir eventos globais durante a ativação celular

Fixada em formol parafina espécimes representam uma fonte valiosa de biomarcadores moleculares de doenças humanas. Aqui nós apresentamos um protocolo de preparação de biblioteca de base laboratorial do cDNA, inicialmente projetado com RNA congelado fresco e otimizado para a análise de microRNAs arquivados de tecidos armazenados até 35 anos.

Sequenciação de MicroRNA retrospectiva: Biblioteca de DNA complementar preparação protocolo usando amostras de RNA de parafina fixada em formol

Este protocolo fornece aos pesquisadores uma nova ferramenta para monitorar a fidelidade da transcrição em vários organismos modelo.

Vigilância de todo o genoma de erros de transcrição em organismos eucarióticos

Nós apresentamos um protocolo pequeno detalhado da reparação da biblioteca do RNA com menos viés do que métodos padrão e uma sensibilidade aumentada para 2 '-O-methyl RNAs. Este protocolo pode ser seguido usando reagentes caseiros para economizar custos ou usar kits para conveniência.

Melhorando O RNA-Seq pequeno: menos polarização e melhor deteção de 2 '-O-methyl RNAs

A resistência terapêutica muitas vezes se desenvolve em pacientes com câncer de próstata avançado e, em alguns casos, o câncer progride para um subtipo letal chamado câncer de próstata neuroendócrino. Avaliar as pequenas alterações moleculares mediadas por RNA não codificadoras que facilitam essa transição permitiria uma melhor estratificação e identificação de mecanismos causais que levam ao desenvolvimento de câncer de próstata neuroendócrino.

Sequenciamento de RNA não codificador de tecidos reparados em formalina e exossomos derivados do soro de pacientes com câncer de próstata resistentes à castração

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para um método de sequenciamento baseado em LC-MS que pode ser usado como um método direto para sequenciar RNA curto (&lt;35 nt por execução) sem um intermediário de cDNA e como um método geral para sequenciar diferentes modificações de nucleotídeos em um único estudo com precisão de base única.

2D-HELS MS Seq: Um método geral baseado em LC-MS para sequenciamento direto e de novo de misturas de RNA com diferentes modificações de nucleotídeos

O protocolo fornece instruções para modificar o RNA com sulfato de dimetilo para experimentos de perfil mutacional. Inclui sondagem in vitro e in vivo com dois métodos alternativos de preparação de bibliotecas.

Sondando a estrutura do RNA com perfil mutacional de sulfato de dimetilo com sequenciamento in vitro e em células

Este protocolo permite o controle de qualidade inicial para experimentos de RNA-seq para biólogos de laboratório úmido com experiência limitada em bioinformática.

Rup (RNA-seq Usability Assessment Pipeline) - Controle de qualidade para experimentos de RNA-seq em massa em eucariotos

Aprenda a otimizar o sequenciamento de RNA degradado de amostras FFPE para melhorar a qualidade dos dados de expressão gênica. Este método avalia a qualidade do RNA em tecidos fixados em formalina e parafina, permitindo a caracterização de transcritos em amostras biológicas e clínicas subótimas.

Otimização para Sequenciamento e Análise de Amostras de RNA FFPE-RNA degradadas

Explorar mais vídeos