Name: Imunostaining de Testes Drosophila de Monte Inteiro para Análise Confocal 3D de Grandes Espermatocitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda imunostaining de monte inteiro em testes de Drosophila melanogaster para análise confocal 3D de espermatócitos. Este protocolo otimizado com NP40 e heptano permite penetração profunda de anticorpos e quantificação confiável de colocalização proteica.

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Agradecemos p. Verrijzer, J. Johansen H., Okhura por anticorpos e A. Debec, os centros de ações bloomington e viena para moscas. Obrigado a C. Jackson por sugestões e discussões estimulantes.

1. Coleção de testículos de Drosophila
NOTA: Machos jovens (0-15 h pós-eclosão) são necessários para examinar células germinativas diploides (ou seja, espermatogonia e espermatocitocitos).
<ol><li>Selecione moscas jovens o máximo possível para minimizar a interferência do desenvolvimento de espermatóides.</li>
	<li>Anesthetize voa por breve exposição ao dióxido de carbono e transferência para uma plataformade moscas 14,15.</li>
	<li>Sob um microscópio dissecando (ampliação de 10x), use fórceps para remover a cabeça.</li>
	<li>Transfira 5 a 10 moscas decapitadas para 100 μL do buffer de Ringer (183 mM KCI, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, inibidor completo de proteína, pH 6.8) em uma lâmina de vidro revestida de silicone em um suporte de fundo preto.</li>
	<li>Com microscópio dissecado em uma ampliação de 40x, use um par de fórceps número 5 para segurar uma mosca entre o tórax e o abdômen, e, com outros fórceps, puxe o abdômen para longe do tórax. Isole rapidamente os testículos e tecidos adjacentes da carcaça15 e coloque em uma nova gota do tampão de Ringer no mesmo slide.</li>
	<li>Quando todos os testículos estiverem prontos, limpe os testículos dos tecidos restantes (glândula acessório e genitália externa).</li>
	<li>Remova o excesso de tampão da gota contendo os testículos dissecados. Normalmente, use uma pipeta p200 com uma ponta de 10 μL instalada em cima de uma ponta de 200 μL. Isso permite a remoção do excesso de líquido através de uma pequena abertura. Coloque uma queda de 4% de paraformaldeído fixador em cima da gota contendo os testículos dissecados e, em seguida, transfira rapidamente os testículos para um tubo contendo solução fixativa fresca.</li>
</ol>2. Fixação de paraformaldeído
<ol><li>Prepare 2 mL de solução fixa pouco antes do uso: 600 μL de 4% de paraformaldeído diluído em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) com 30 μL de NP40 20% mais 1200 μL de heptano em um tubo de microcentrifuge siliconado de 2 mL. Use 4% de paraformaldeído em PBS preparado em alíquotas de 600 μL e armazenado a -20°C. Atenção: Heptano e paraformaldeído são tóxicos e devem ser manuseados em um capô de fumaça. Elimine-os de acordo com as normas do instituto anfitrião.</li>
	<li>Transfira os testículos usando uma micropipette p200 com uma ampla ponta de abertura para a solução PFA/NP40/heptane. Aperte o tubo para cima e para baixo por 30 s à mão. Continue consertando os testículos em uma batedeira rotativa à temperatura ambiente por 30 minutos.</li>
	<li>Pare a batedeira rotativa e coloque o tubo em um rack de tubo para permitir a separação de fase e para que os testículos se acomodem na parte inferior do tubo.</li>
	<li>Remova todo o heptano e a solução fixa e enxágue os testículos rapidamente três vezes com 1x PBS.</li>
	<li>Transfira para um tubo individual limpo de 200 μL. Realizar todas as incubações nestes pequenos tubos para minimizar as quantidades de anticorpos empregados.</li>
	<li>Remova o excesso de tampão usando uma micropipette de 200 μL com uma p200 e uma ponta P10 anexada. Tome cuidado para não aspirar testículos.</li>
	<li>Mantenha os testículos em 1x PBS no gelo até que todas as amostras estejam prontas.</li>
</ol>3. Coloração de anticorpos em solução
<ol><li>Descarte o PBS e deixe testículos em 0,3% PBS-T por 30 minutos à temperatura ambiente para permeabilizar as membranas celulares.</li>
	<li>Pré-incubação no mesmo tampão mais 5% de soro de cabra normal (NGS) por 1 h.</li>
	<li>Adicionar 200 μL do anticorpo primário diluído em 0,3% PBS-T mais 5% NGS(Tabela de Materiais).</li>
	<li>Incubar o anticorpo primário durante a noite a 4 °C (ou temperatura ambiente) com agitação suave em um roqueiro.</li>
	<li>Lave 3 vezes em 0,3% PBS-T por 15 minutos em um roqueiro à temperatura ambiente. Deixe os testículos se acomodarem na parte inferior do tubo pela gravidade.</li>
	<li>Adicione 200 μL de anticorpo secundário diluído 1:500 da série conjugada DyLight.</li>
	<li>Incubar o anticorpo secundário em uma câmara escura por 4h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave em 0,3% PBS-T por 15 minutos em um roqueiro à temperatura ambiente. Em seguida, repita com 0,2% PBS-T e 0,1% PBS-T, cada vez por 30 min em um roqueiro à temperatura ambiente. Faça uma lavagem final em 1x PBS por 30 minutos para remover o detergente.</li>
	<li>Adicione 180 μL de solução DAPI a 1 μg/mL em 1x PBS por 15 min. A solução de estoque é de 10 mg/mL em H2O. Evite fazer solução de estoque em PBS, o que pode reduzir o sinal de coloração da DAPI em cromatina difusa em espermatocitocitos maiores.</li>
	<li>Lave 3x por 5 min cada.</li>
	<li>Use uma caneta de barreira hidrofóbica para desenhar um círculo em um escorregador limpo.</li>
	<li>Aspirar testículos e colocá-los no slide. Pré-enxaguar a ponta de abertura larga com 0,1% pbs-t impede que os testículos grudem na ponta. Remova o excesso de PBS.</li>
	<li>Adicione uma gota (aproximadamente 100 μL) do Citifluor AF1.</li>
	<li>Coloque delicadamente uma tampa de vidro sobre o tecido, tomando cuidado para evitar a captura de bolhas de ar.</li>
	<li>Sele a mancha de cobertura no slide usando esmalte transparente.</li>
	<li>Observe slides em um microscópio.</li>
</ol>4. Análises de colocalização
<ol><li>Adquira imagens confocal. Utilizamos um microscópio confocal Zeiss LSM 710 (óleo apocromático plano 63x) com uma resolução z de 0,5 ou 1 μm.</li>
	<li>Selecione diferentes células de testículos independentes.</li>
	<li>Importar imagens para software de processamento (por exemplo, Imaris).</li>
	<li>Defina o núcleo por segmentação manual, a fim de excluir os núcleos vizinhos. Use o software Coloc; ele coleta os coeficientes de correlação (PCCs) do Pearson dentro de todo o volume entre 2 fluoroforos.</li>
</ol>

<ol><li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic%2C+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+assembly+in+Drosophila+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).</li>
<li>Fabbretti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+Analysis+of+Nuclear+Lamina+Behavior+during+Male+Meiosis+and+Spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 11 (3), 0151231(2016).</li>
<li>Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFuller%2C+MT+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinas-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-148 (1993).</li>
<li>Hiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testis-specific+TAF+homologs+collaborate+to+control+a+tissue-specific+transcription+program%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program.</a> Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).</li>
<li>Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+TAFs+counteract+Polycomb+to+turn+on+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation.</a> Science. 310 (5749), 869-872 (2005).</li>
<li>White-Cooper, H., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+aspects+of+transcription+regulation+in+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Unique aspects of transcription regulation in male germ cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).</li>
<li>Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAD1%3A+Kinetochore+Receptors+and+Catalytic+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51(2018).</li>
<li>Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+checkpoint+protein+Xmad1+recruits+Xmad2+to+unattached+kinetochores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).</li>
<li>Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+checkpoint+proteins+HsMAD1+and+HsMAD2+are+associated+with+nuclear+pore+complexes+in+interphase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase.</a> Journal of Cell Science. 114, Pt 5 953-963 (2001).</li>
<li>Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+Drosophila+nuclear+envelope+components%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).</li>
<li>Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mad1+influences+interphase+nucleoplasm+organization+and+chromatin+regulation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila.</a> Open Biology. 8 (10), (2018).</li>
<li>Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smurf-mediated+differential+proteolysis+generates+dynamic+BMP+signaling+in+germline+stem+cells+during+Drosophila+testis+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development.</a> Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).</li>
<li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+started%3A+an+overview+on+raising+and+handling+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting started: an overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).</li>
<li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2641(2011).</li>
<li>Gigliotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nup154%2C+a+new+Drosophila+gene+essential+for+male+and+female+gametogenesis+is+related+to+the+nup155+vertebrate+nucleoporin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene.</a> Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).</li>
<li>Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+lamina+regulates+germline+stem+cell+niche+organization+via+modulation+of+EGFR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).</li>
<li>Fawcett, D. W., Chemes, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+distribution+of+nuclear+pores+during+differentiation+of+the+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells.</a> Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).</li>
<li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).</li>
<li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue%2C+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonaccorsi%2C+S+%22Immunostaining+of+Drosophila+testes%22">Immunostaining of Drosophila testes</a>. 2011 (10), Cold Spring Harbor Protocols. 1273-1275 (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonaccorsi%2C+S+%22Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes%22">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes</a>. 2012 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 102-104 (2012).</li>
<li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis%3A+analysis+of+meiosis+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).</li>
<li>Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).</li>
<li>Theofel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tBRD-1+and+tBRD-2+regulate+expression+of+genes+necessary+for+spermatid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation.</a> Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).</li>
<li>Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+dany+is+essential+for+transcriptional+control+and+nuclear+architecture+in+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes.</a> Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo fornece um método para o bem sucedido imunolabeling de testículos de Drosophila adultos de montagem inteira. Conforme relatado em outros procedimentos, devem ser utilizados os machos jovens (até encurtamos a idade para menos de 20 horas após a eclosão) para minimizar a presença de espermatozoides em desenvolvimento, o que corre o risco de obstruir os espermatocitos. A dissecção deve ser rápida e a diluição do anticorpo deve ser ajustada para otimizar a relação sinal-ruído21,</s...

Os testículos de drosophila são um modelo valioso para o estudo da arquitetura nuclear. Em células espermatogoniais mitóticas, o volume nuclear é em grande parte ocupado por cromatina. Essas células passam por quatro rodadas de divisão, produzindo um cisto de 16 espermatos primários. Nos dias seguintes, os espermatocitos passam por 6 estágios de desenvolvimento (S1-S6), aumentando consideravelmente em volume, aproximadamente 20vezes 1,2. Eles também mudam sua morfologia nuclear. O contorno do núcleo, revelado pelo lamin Dm0, torna-se irregular e mostra profundas invaginações1,3. Isso é acompanhado por extensas alterações de expressão genética e modificações na organização cromatina1,4,5,6,7. Os cromossomos interfásicos são bem definidos no estágio S4-S5, formando três massas distintas correspondentes aos 2 principais autossomos bivalentes e o par X-Y ancorado com o nucleolus.
Mad1 foi originalmente isolado como um componente-chave do ponto de verificação mitótico (revisado em8). Na interfase, é descrito como localizado principalmente no envelope nuclear, mas também no nucleoplasma9,10,11. Em Drosophila testis, relatamos que Mad1 é proeminente no nucleoplasma, intimamente associado com as duas principais massas de cromatina autossômica e em menor grau com a cromatina XY. Definimos esta estrutura associada à cromatina como MINT (Território IntraNuclear contendo Mad1)12. Quatro outras proteínas foram associadas com MINTs em espermatotos: o nucleoporina Mtor/Tpr, o SUMO peptidase Ulp1, a proteína de checkpoint mitotístico Mad2 e uma subunidade de um complexo de Policomb Raf212.
Para completar a descrição dos MINTs, precisávamos usar anticorpos e fomos confrontados com os problemas técnicos geralmente encontrados com imunostendências em testículas: uma má permeabilidade resultando em uma significativa não uniformidade da coloração na profundidade dos testítes, particularmente nos grandes espermatocitos. Aspreparações anuladas aumentaram o acesso a anticorpos, mas levaram a imagens compactadas, restringindo as análises 3D e impedindo a medição da fluorescência quantitativa, incluindo a colocalização. O problema da penetração de anticorpos também poderia ser resolvido por agentes permeabilizadores como 0,3% Na desoxicolato13,mas este procedimento não resultou em nossas mãos resultados reprodutíveis. Como realizamos muitos experimentos de co-rotulagem, procuramos melhorar o protocolo de permeabilização. A combinação de 1% NP40 mais heptano resultou em mais reprodutibilidade, particularmente no estudo dos grandes espermatos.
Este protocolo realiza a fixação e a imunostenção de testículos na suspensão, melhorando a qualidade da amostra, bem como melhorando a reprodutibilidade, e tornando-a adequada para microscopia confocal. Usamos o protocolo para definir melhor as relações espaciais de certas proteínas de envelope nuclear com as estruturas nucleoplasmáticas de grandes espermatotos. Esse método permitirá melhores investigações das mudanças que acompanham o desenvolvimento de espermatotocitos, como por exemplo as dinâmicas mudanças estruturais do núcleo, incluindo cromatina, nucleoplasma e os poros nucleares.

<table><tbody><tr><td>Drosophila strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO</td><td></td><td></td><td>Presente de A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, França)</td></tr><tr><td>Mad1-GFP</td><td></td><td></td><td>J Cell Sci. 2011 15 de maio; 124 (Pt 10): 1664-71.</td></tr><tr><td>Mtor RNAi&nbsp;</td><td>VDRC</td><td>ID 110218</td><td>Vienna Drosophila RNAi Center</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td>A solução de estoque <td>Thermo</td><td>D1306</td><td>deve ser preparada em H2O</td></tr><tr><td>Dumont # 5 Fine Forseps&nbsp;</td>Pontas de Pipeta de Diâmetro Largo MBP da <td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisherbrand</td><td>11917744</td><td>Ponta de Abertura</td></tr><tr><td>Larga Thermo Scientific&nbsp; Tubo Individual de 0,2 mL</td><td>Thermo</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de micro centrífuga de 2 ml&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T3531-200EA&nbsp;</td><td>Tubo de 2ml siliconizado</td></tr><tr><td>Citifluor AF1</td><td>Citifluor</td><td>AF1</td><td></td></tr><tr><td>Dakopen&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Z377821-1EA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Cabra Normal (NGS)</td><td>Sigma</td><td>NS02L-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído 4%</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G&nbsp;</td><td>Paraformaldeído (4%) dissolvido em PBS 1X; alíquota por 600 ml;</td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Thermo</td><td>14190094</td><td>DPBS, sem cálcio, sem magnésio</td></tr><tr><td>0,1% (0,2 ou 0,3%) PBS-T&nbsp;</td><td></td><td></td><td>PBS 1X contendo 0,1% (0,2% ou 0,3%) Triton X-100</td></tr><tr><td>Triton X-100, para biologia molecular,&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP booster</td><td>Chromotek</td><td>gba488</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Mouse anti-Mtor</td><td></td><td></td><td>1/40 presente de J. Johansen, Universidade Estadual de Iowa</td></tr><tr><td>Rato anti-Nup62</td><td></td><td></td><td>1/200 presente de H. Ohkura (Universidade de Edimburgo, Reino Unido</td></tr><tr><td>cobaia anti-Ulp1</td><td></td><td></td><td>Presente de 1/200 de C. P. Verrijzer, Universidade Erasmus, Rotterdam</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Raf2</td><td></td><td></td><td>Presente de 1/200 de C. P. Verrijzer, Universidade Erasmus, Rotterdam</td></tr><tr><td>Série conjugada DyLight&nbsp;</td><td>Thermo</td><td></td><td>1/500 Donkey anti- (cobaia, camundongo, coelho ou rato) como segundos anticorpos</td></tr></tbody></table>

imunostaining de testes drosophila de monte inteiro para análise confocal 3d de grandes espermatocitos

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Os testículos de drosophila são um poderoso sistema modelo para estudar processos biológicos, incluindo biologia de células-tronco, arquitetura nuclear, meiose e desenvolvimento de espermatozoides. No entanto, a imunolabelação de todo o teste de Drosophila é frequentemente associada com significativa não uniformidade da coloração devido à penetração de anticorpos. As preparações esmagadas só superam parcialmente o problema, pois diminui a qualidade 3D das análises. Aqui, descrevemos um protocolo de montagem inteira usando NP40 e heptano durante a fixação, juntamente com a imunolabelagem em mídia líquida. Preserva o volume adequado para microscopia confocal juntamente com rotulagem reprodutível e confiável. Mostramos diferentes exemplos de reconstituição 3D de núcleos espermatocitocitos de seções confocal. A reprodutibilidade intra e inter-testes permite quantificação 3D e comparação da fluorescência entre células únicas de diferentes genótipos. Utilizamos diferentes componentes da estrutura de MINT intranuclear (Território Intra Nuclear Contendo Mad1), bem como dois componentes associados ao complexo de poros nucleares para ilustrar este protocolo e suas aplicações nas maiores células dos testis, os espermatozoides S4-S5.

O principal obstáculo para a obtenção de uma coloração adequada dos testículos de Drosophila é a penetrabilidade limitada dos anticorpos, que foi parcialmente resolvida por meio de preparações esmagadas, mas ao custo de induzir uma restrição das análises 3D (por exemplo, representação 3D ou medida de colocalização). O procedimento permite rotulagem uniforme e preserva o volume de todas as células do testis. Aqui focamos a ilustração do método na representação 3D dos espermatos S4-S5, pois são as maiores células e, portan...

Apresentamos aqui um protocolo aprimorado para a preparação e imunossagem completa de testículos Drosophila, adequados para microscopia confocal e também permitindo rotulagem reprodutível e confiável. Ilustramos este protocolo por representação 3D e quantificação de experimentos de colocalização nos grandes espermatos S4-S5.

Imunostaining de Testes Drosophila de Monte Inteiro para Análise Confocal 3D de Grandes Espermatocitos

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

A coloração de montagem total de tecidos de Drosophila, como amostras de testículos, é frequentemente problemática devido à penetração limitada de anticorpos. Nosso protocolo de fixação usando NP40 e heptano permite uma marcação uniforme e reprodutível. Ao manter a forma do tecido e permitir a penetração profunda do anticorpo, esse procedimento facilita a aquisição reprodutível e quantificável de imunocoloração em três dimensões, tanto isoladamente quanto em estudos de colocalização.Para avaliação de células germinativas diplóides, zero a 15 horas após a eclosão, anestesiar as moscas por uma breve exposição ao dióxido de carbono e transferir as moscas para uma almofada de mosca. Coloque a almofada sob um microscópio de dissecação com uma ampliação de 10X e use uma pinça para remover as cabeças de cinco a 10 moscas machos. Transfira os corpos das moscas decapitadas para 100 microlitros de tampão de Ringer em uma lâmina de vidro revestida de silicone em um suporte de fundo preto e use a ampliação de 40X e um par de pinças número cinco para segurar uma mosca entre o tórax e o abdômen.Em seguida, afaste o abdômen do tórax e isole rapidamente os testículos e os tecidos adjacentes da carcaça da mosca. Depois que todos os testículos forem coletados, limpe as amostras de qualquer tecido remanescente e use uma ponta de pipeta de 200 microlitros para remover o excesso de tampão ao redor dos testículos dissecados. Em seguida, coloque uma gota de paraformaldeído a 4% nos testículos e transfira rapidamente os tecidos para um tubo contendo dois mililitros de solução de paraformaldeído a 4% recém-preparada suplementada com 20% NP40 e heptano.Para uma fixação completa das amostras de testículos, agite o tubo verticalmente por 30 segundos antes de incubar os testículos em um misturador rotativo em temperatura ambiente por 30 minutos. No final da incubação, transfira o tubo para um suporte de tubos e deixe os testículos assentarem no fundo do tubo. Remova todo o heptano e a solução fixadora e enxágue rapidamente os testículos três vezes com PBS.Após a última lavagem, transfira os testículos para um novo tubo de 200 microlitros e use uma pipeta de 200 microlitros equipada com uma ponta de pipeta de 10 microlitros para remover qualquer excesso de tampão. Em seguida, adicione 200 microlitros de PBS-To fresco ao tubo e coloque os testículos no gelo. Para a marcação de anticorpos das amostras de testículos, substitua o PBS por 200 microlitros de 0,3% PBS-T para uma incubação de 30 minutos em temperatura ambiente.Após a permeabilização, bloqueie qualquer ligação não específica com 0,3% de PBS-T mais 5% de soro de cabra normal por uma hora em temperatura ambiente antes de adicionar 200 microlitros do anticorpo primário de interesse diluído em 0,3% de PBS-T mais 5% de soro de cabra normal para uma incubação noturna a quatro graus Celsius ou temperatura ambiente com balanço. Na manhã seguinte, lave as amostras com três lavagens de 15 minutos com 0,3% de PBS-T fresco e balançando em temperatura ambiente por lavagem e deixe os testículos assentarem no fundo do tubo por gravidade. Adicione 200 microlitros de um anticorpo secundário apropriado ao tubo para uma incubação de quatro horas com balanço em temperatura ambiente protegido da luz antes de lavar as amostras em 0,3% PBS-T fresco por lavagem, conforme demonstrado.Após a lavagem com 0,3% de PBS-T, lave as amostras uma vez em 0,2% de PBS-T e uma vez em 0,1% de PBS-T por 30 minutos por lavagem no balancim, seguido de uma lavagem final de 30 minutos apenas com PBS. Após a lavagem do PBS, rotule as amostras com 180 microlitros de uma solução de DAPI de um micrograma por mililitro em PBS por 15 minutos em temperatura ambiente protegida da luz, seguida de três lavagens de 5 minutos em PBS fresco por lavagem. Após a última lavagem, use uma caneta de barreira hidrofóbica para desenhar um círculo em uma lâmina limpa e use uma ponta de pipeta com primer 0,1% PBS-T para transferir os testículos para a lâmina.Aspire o excesso de PBS e adicione 100 microlitros de Citifluor AF1. Coloque suavemente uma lamínula de vidro sobre o tecido, tomando cuidado para evitar prender bolhas de ar, e use esmalte transparente para selar a lamínula na lâmina antes de observar as lâminas por microscopia de fluorescência confocal. Depois de adquirir imagens confocais das amostras, importe as imagens para um programa de software de análise de imagem apropriado.Em seguida, use a segmentação manual para definir o núcleo dentro de cada célula e determinar os coeficientes de correlação de Pearson dentro de todo o volume entre dois fluoróforos. Este protocolo permite a aquisição de imagens confocais de qualidade suficiente para serem tratadas para reconstituição 3D. Por exemplo, nessas quatro seções seriadas adjacentes de um espermatócito em estágio S5, um baixo nível de Mad1 é observado no envelope nuclear e um alto nível de acúmulo de Mad1 pode ser visualizado em conjunto com a coloração DAPI dentro do núcleo.nesta imagem reconstituída em 3D, a presença de baixo nível de Mad1 na superfície nuclear e o acúmulo de alto nível de Mad1 dentro do núcleo podem ser observados junto com o DNA. Nessas reconstituições 3D, podem ser observados grandes espermatócitos S5 corados com Nucleoporina 62 e Mad1 ou Importina-beta e DAPI. Em ambas as reconstruções, os componentes associados aos poros nucleares parecem estar distribuídos de maneira não uniforme sobre a borda nuclear como pontos de tamanho irregular.Ao mesmo tempo em que conserva o volume 3D das células, esse protocolo também facilita uma penetração uniforme de anticorpos de interesse na profundidade de cada célula, permitindo análises quantitativas, como a colocalização. Como o protocolo permite uma medição confiável de colocalizações de testículos independentes, ele também pode ser usado para comparar a coloração em diferentes genótipos de moscas. A quantidade de NP40 usada é crítica para permeabilização suficiente.Se o procedimento for seguido de perto, a rotulagem reprodutível e a preservação da estrutura nuclear 3D podem ser alcançadas. Embora a coloração de montagem total de tecidos dentro de Drosophila possa ser complicada, este protocolo pode ser facilmente adaptado para outras amostras.

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Aprenda imunostaining de monte inteiro em testes de Drosophila melanogaster para análise confocal 3D de espermatócitos. Este protocolo otimizado com NP40 e heptano permite penetração profunda de anticorpos e quantificação confiável de colocalização proteica.

Imunostaining de Testes Drosophila de Monte Inteiro para Análise Confocal 3D de Grandes Espermatocitos

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