Name: Silenciador de microRNA baseado em vírus de batata (VbMS) na batata. (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Aprenda a silenciar microRNAs em batatas usando o sistema VbMS baseado no vírus PVX. Este método rápido permite caracterizar funcionalmente microRNAs endógenos sem transformações estáveis em plantas diploides e tetraploides.

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Agradecemos ao Dr. Yule Liu, da Universidade de Tsinghua, por fornecer o vetor PVX-LIC. Este trabalho foi apoiado por um fundo inicial da Texas A&M AgriLife Research e do Projeto Hatch TEX0-1-9675 do Instituto Nacional de Alimentos e Agricultura do USDA para o JS.

1. Cultivar plantas de batata.
<ol><li>Propagar plantas de batata in vitro em tubos de cultura (25 x 150 mm) com mídia Murashige e Skoog (MS) mais vitamina Gamborg (mistura de sal basal de MS, vitamina Gamborg, 30 g/L de sacarose, 3,5 g/L de ágar, pH = 5,7). Coloque os tubos na sala de crescimento abaixo de 20-22 °C, 16 h de luz/8 h fotoperíodo escuro e intensidade de luz 120 μmol/m2∙s1. NOTA: Novas brotos e raízes normalmente se desenvolvem em 1-2 semanas a partir de plantas. Propagar plantas com mídia de vitaminas ms/Gamborg frescas todos os meses.</li>
	<li>Quatro semanas depois, transplante plantas in vitro no solo e as plante em uma estufa abaixo de 20-22 °C, 16 h de luz/8 h fotoperíodo escuro e intensidade de luz 120 μmol/m2∙s1. NOTA: As plantas com raízes e folhas recém-desenvolvidas são adequadas para transplante. Mantenha a umidade para as plantas recém-transplantadas durante os primeiros 3-4 dias.</li>
</ol>2. Construa os vetores VbMS.
<ol><li>Projete e clone as moléculas TM de tandem curto (STTM, Figura 1)22,53 para o miRNA de interesse. NOTA: Adquira sequências de miRNA com base em dados experimentais ou no banco de dados miRbase54,55,56,57,58,59. A sequência miR166 utilizada neste estudo foi descrita anteriormente60.<ol>
<li>Projete o módulo TM inserindo uma sequência de incompatibilidade, normalmente 5'-CTA-3', na sequência de complemento reverso do miRNA no local correspondente aos nucleotídeos 10-11 do miRNA. NOTA: Por exemplo, a sequência de Stu-miR160 é 5'-UGCCUCUCUCUGUAUGCC-3'61, onde o nucleotídeos 10-11 está em negrito. A sequência de complemento reverso (em desoxinucleotídeos) é de 5'-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3' e o local de inserção da protuberância é mostrado em negrito. A sequência de moléculas TM (desoxynucleotide) deve ser de 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3'.</li>
		<li>Projete primers para clonagem do fragmento STTM (Figura 1). Use oligonucleotídeos de DNA com a sequência espaçadora de 48 nt como modelo para clonagem PCR. O primer dianteiro consiste em um linker LIC1 (5'-CgACgACAAGACCgT-3'), a sequência dianteira do acima projetado para molécula TM e a sequência parcial de 5' do espaçador de 48 nt (5'-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'). O primer reverso consiste em um linker LIC2 (5'-gAggAgAgAgCCgT-3'), a sequência de complemento reverso da molécula TM e um complemento reverso parcial à sequência de 3' do espaçador de 48 nt (5'-ATTCTTCTTTTTTAGACCAT-3'). NOTA: A sequência de espaçadora de 48 nt é de 5'-GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAATGGTCTAAGAAGAAGAAT-3'. Por exemplo, para STTM-miR160, o primer para a frente deve ser 5'-CgACgACAAGCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'; o primer reverso deve ser de 5'-gAggAgAgAgCcgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTTTTTAGACCAT-3' (Figura 1).</li>
		<li>Amplie o fragmento STTM em um volume de 50 μL por PCR usando o espaçador universal 48-nt sintetizado como modelo e uma polimerase de DNA de alta fidelidade.<ol>
<li>Configure a reação do PCR misturando 0,5 μL de cada primer (40 μM), 0,5 μL de oligo espaçador de 48 nt (40 μM), 5 μL de tampão PCR 10x, 1 μL de mistura dNTP (10 mM cada), 0,1 μL de polimerase de DNA de alta fidelidade (10 U/μL ), e 43 μL de ddH2O a um volume total de 50 μL. Realize a amplificação padrão do PCR da seguinte forma: 94 °C para 3 min, 32 ciclos de 94 °C para 45 s, 60 °C para 45 s e 72 °C para 60 s.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Purificar o fragmento STTM por precipitação de etanol. Adicione 2,5 volumes de etanol e 1/10 de volume de acetato de sódio de 3 M (pH = 4,0) aos produtos pcr. Misture vigorosamente e centrífuga a 14.000 x g por 10 min. Retire o supernasce e enxágue a pelota com 1 mL de 70% de etanol. Seque a pelota e dissolva-a em 20 μL de ddH2O. NOTA: Use eletroforese de DNA para verificar a amplificação dos produtos PCR STTM.</li>
		<li>Configure a reação de polimerase de DNA T4 no gelo misturando 2,5 μL de produto PCR STTM purificado, 0,5 μL de 10x T4 tampão de polimerase de DNA, 0,05 μL de 1 M dithiothreitol (DTT), 0,25 μL de 100 mM dATP, 0,1 μL de polimerase de DNA T4 (3 U/μL) e 1,6 μL de ddH2O a um volume total de 5 μL. Incubar a mistura a 37 °C por 15 min, e trate os produtos a 75 °C por 20 minutos para inativar a polimerase de DNA T4.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare a construção VbMS baseada em PVX.<ol>
<li>Digerir 5 μg de plásmid PVX-LIC com 2,5 μL de SmaI (20 U/μL) em um volume de 100 μL.</li>
		<li>Adicione um volume igual de fenol:clorofórmio:isopropanol (25:24:1, pH = 6,7/8.0) aos produtos PVX-LIC digeridos e misture vigorosamente. Centrifugar a 14.000 x g por 10 min e transferir o supernatante para um novo tubo centrífuga. Adicione um volume igual de clorofórmio:isopropanol (24:1) e vórtice vigorosamente. Centrifugar a 14.000 x g por 10 min. NOTA: O vetor PVX-LIC abriga o LIC para clonagem. O LIC do vetor PVX-LIC contém um gene ccdB e um gene resistente a clororamfenicol e precisa ser mantido/propagado na cepa E. coli DB3.1 usando meio LB contendo kanamycina (50 μg/L) e clororamfenicol (15 μg/L).</li>
		<li>Transfira o supernatante para um novo tubo de centrífuga. Adicione 2,5 volumes de etanol e 1/10 de volume de acetato de sódio de 3 M (pH = 4,0) e misture vigorosamente. Centrifugar a 14.000 x g por 10 min e remover o supernatante.</li>
		<li>Enxágüe a pelota com 1 mL de 70% de etanol e vórtice vigorosamente. Centrifugar a 14.000 x g por 10 min e remover o supernatante. Seque a pelota e dissolva o plasmídeo PVX-LIC digerido com 100 μL de ddH2O.</li>
		<li>Configure a reação de polimerase de DNA T4 no gelo misturando 2,5 μL de DNA vetor PVX-LIC digerido, 0,5 μL de 10x tampão de polimerase de DNA T4, 0,05 μL de 1 M DTT, 0,25 μL de 100 mM dTTP, e 0,1 μL de polimerase de DNA T4 (3 U/μL) em um volume total de 5 μL. Incubar a mistura a 37 °C por 15 min e tratar os produtos a 75 °C por 20 min. inativar a polimerase de DNA T4.</li>
	</ol></li>
	<li>Clone a sequência STTM no vetor PVX-LIC usando uma reação LIC. Misture os produtos STTM PCR tratados com DNA T4 (5 μL) e os plasmídeos PVX-LIC tratados com DNA T4 (5 μL). Incubar a 70 °C por 5 min, esfriar até 22 °C em uma rampa de 0,1 °C/s, e manter a 22 °C por 30 min usando uma máquina PCR. NOTA: Estenda o tempo de incubação para durante a noite a 4 °C para obter maior eficiência da clonagem LIC.</li>
	<li>Transforme 5 μL dos produtos de reação LIC no E. coli DH5α e cresça em uma placa LB contendo 50 μg/mL kanamycin62,63. Escolha e verifique colônias positivas por PCR com os primers de clonagem e primer universal para o vetor PVX-LIC seguido de sequenciamento.<ol>
<li>Execute o PCR colônia com o primer dianteiro para PVX-LIC (5'-GTGTTGGCCAAACTAGAT-3') em combinação com o primer reverso para clonagem STTM para identificar clones positivos. O tamanho da banda PCR deve ser de ~300 bp. NOTA: Verifique as sequências de fragmentos STTM por sequenciamento do ciclo do exterminador64,65.</li>
	</ol></li>
	<li>Isole os plasmídeos PVX-STTM dos clones validados e transforme-os em cepas de Agrobacterium GV3101, GV2260 ou EHA10562,63. Verifique colônias de agrobacterium por PCR. NOTA: Confirme colônias de agrobacterium por PCR usando o primer dianteiro para PVX-LIC e o primer reverso para clonagem STTM.</li>
</ol>3. Realize o ensaio VbMS baseado em PVX em plantas de batata.
<ol><li>Transplante de 4 semanas de idade em plantas de batata in vitro no solo. As plantas transplantadas serão submetidas ao ensaio VbMS 3-4 dias depois.</li>
	<li>Plantas de batata inoculadas com Agrobacterium contendo os plasmídeos PVX-STTM. NOTA: Para o ensaio VbMS na batata, a infiltração mediada por Agrobacterium e a inoculação de arranhões de palito são realizadas simultaneamente.<ol>
<li>Escolha e inocula os transformadores positivos contendo vetores PVX-STTM em 50 mL de LB líquido contendo 50 μg/mL kanamycin e 50 μg/mL rifampicina. Cresça em uma incubadora de 28 °C a 220 rpm por 16 h até OD600 = 1,0.</li>
		<li>Ao mesmo tempo, cruze as colônias positivas de Agrobacterium em pelo menos duas novas placas LB contendo kanamycina de 50 μg/mL e 50 μg/mL rifampicina e crescem a 28 °C por 1 dia. Inclua o vetor PVX-LIC38,66 como controle e PVX-GFP67,68 para monitorar a propagação do vírus.</li>
		<li>Colete a cultura líquida agrobacterium por centrifugação a 3.400 x g por 10 min a temperatura ambiente. Resuspend Agrobacterium células com igual volume de tampão de infiltração (10 mM MgCl2, 10 mM MES e 200 μM acetosyringone, pH = 5,6) e ajustar-se a OD600 = 1,0. Incubar em temperatura ambiente por 6 h.</li>
		<li>Infiltrar-se na cultura Agrobacterium no lado abaxial de folhas totalmente expandidas com uma seringa sem agulha de 1 mL.<ol>
<li>Vire e segure uma folha com uma mão, em seguida, use um dedo para apoiar a folha lamina do lado adaxial no local de infiltração. Mantenha a seringa vertical à superfície da folha com a outra mão e infiltre-se na cultura Agrobacterium no lado abaxial da lamina.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Raspe a cultura Agrobacterium das placas LB e arranhe a superfície do caule do primeiro ou dois internos das plantas de batata infiltradas com um palito de dente. Coce suavemente a epiderme da haste. Evite perfurar através da haste, o que pode causar danos graves às plantas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cresça as plantas infiltradas a 22 °C com um fotoperíodo escuro de 16 h/8h e intensidade leve de 120 μmol/m2∙ s1 em uma estufa. NOTA: Fenótipos causados pelo silenciamento do miRNA geralmente aparecem em 2-4 semanas pós-incopulsão (Figura 2, Figura 3). Normalmente leva de 10 a 20 dias para que o fenótipo VbMS apareça após a infiltração. O fenótipo VbMS depende das propriedades do miRNA específico e dos genes-alvo específicos, condições de crescimento e variedades de batata.</li>
</ol>4. Realize a análise de expressão.
<ol><li>Quando os fenótipos aparecem em 2-4 semanas pós-inoculação, colete tecidos como brotos, folhas, flores ou raízes com fenótipos das plantas vbMS e tecidos das plantas de controle com tesouras. Isole o total de RNAs dos tecidos coletados.</li>
	<li>Verifique a qualidade do RNA por eletroforese62,63 e quantifique a concentração de RNA medindo a absorvância OD260 com um espectotômetro.</li>
	<li>Use o PCR de transcrição reversa em tempo real (RT-PCR) para analisar a expressão miRNA.<ol>
<li>Para miRNAs específicos, projete um primer de transcrição reversa de loop-tronco. Os primers RT de loop-tronco contêm uma espinha dorsal universal de 5' e uma extensão de 3' 6-nt de um miRNA específico. Projete uma espinha dorsal universal de 5''- GTCTCCTCTGGTGCaggccgaggtattcGCACCAGAGAGGAGAC-3') que forme uma estrutura de loop-tronco. (A caixa superior corresponde a uma sequência inversa repetida e a minúscula à região do loop).</li>
		<li>Parte da sequência de backbone de 5' que forma um loop serve como primer reverso para amplificação PCR subsequente (sequência em negrito-itálico na sequência backbone). Adicione uma sequência de extensão de 6-nt que seja inversa-complementar ao final de 3' do miRNA de interesse ao primer de loop-tronco para fornecer especificidade para transcrição reversa (Figura Suplementar 1A). NOTA: Projete o primer de transcrição reversa do loop-tronco, conforme descrito por Chen et al.69 e Erika Varkonyi-Gasic et al.70,71,72. Por exemplo, o primer de transcrição reversa de loop-tronco para Stu-miR160 foi projetado como 5'-GTCTCCCTGGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGAGGAGACGGCATA-3'. O primer de transcrição reversa do loop-de-haste para a família batata miR165/166 foi projetado como 5'-GTCTCCCTGGGGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGAGAGAGGAGACGGGG(A/G)A-3'. (As sequências maiússmenas em negrito fornecem a especificidade da transcrição reversa para miRNAs específicos).</li>
		<li>Configure a reação de transcrição reversa misturando 50-200 ng de RNA total, 1 μL do primer de transcrição reversa de alça-tronco (100 μM), 2 μL de buffer de 10x, 0,2 μL de inibidor de RNase (40 U/μL), 0,25 μL de dNTPs (10 mM cada) e 1 μL de transcriptase reversa (200 U/μL) no gelo. Adicione ddH2O sem nuclease a um volume total de 20 μL.</li>
		<li>Realize a transcrição reversa usando o procedimento de transcrição reversa pulsada. Incubar a mistura de reação de transcrição reversa a 16 °C por 30 min, realizar um ciclo de temperatura de 30 °C para 30 s, 42 °C para 30 s e 50 °C para 1 s, para um total de 60 ciclos, e inativar a transcriptase reversa por incubação a 85 °C por 5 min.</li>
		<li>Para análise pcr em tempo real da expressão miRNA, projete o primer dianteiro com base na sequência miRNA, mas não inclua sequências que se sobrepõem com o primer de transcrição reversa de loop de haste projetado acima. Adicione uma extensão de 3-7-nt aos 5' do primer dianteiro para otimizar o comprimento, a temperatura de fusão e o conteúdo gc (Figura Suplementar 1). NOTA: O primer reverso universal é de 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. Por exemplo, o primer de transcrição reversa de loop-tronco para Stu-miR160 foi projetado como 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3'. O primer de transcrição reversa do loop-tronco para a família miR165/166 é 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3'. As sequências ousadas servem como extensões de 5' para otimização do primer. Os primers de transcrição reversa do loop-tronco e os primers PCR em tempo real para miRNA podem ser projetados usando o miRNA Primer Design Tool73.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintetizar cDNAs dos mRNAs de destino por PCR de transcrição reversa padrão (RT-PCR). Incubar a mistura de reação de transcrição reversa a 37 °C por 60 min e inativar a transcriptase reversa aquecendo a 85 °C por 5 min. NOTA: (1) Prever mRNAs de destino usando o programa psRNATarget74 se os mRNAs de destino não forem conhecidos. (2) O primer de transcrição reversa universal para mRNA é um primer ancorado 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'.</li>
	<li>Configure a reação pcr em tempo real tanto para miRNA de interesse quanto para os mRNAs de destino. Misture 0,5 μL de modelo cDNA, 5 μL de 2x tampão PCR em tempo real com verde SYBR, 0,05 μL de cada primer para frente e reverso (40 μM) e 4,4 μL de ddH2O em um volume total de 5 μL no gelo.</li>
	<li>Incubar a 95 °C por 3 min, 40 ciclos de 95 °C para 3 s e 60 °C para 30 s. Realize uma análise subsequente da curva de fusão da seguinte forma: Incubar a 95 °C para 15 s, esfriar até 60 °C em uma rampa de 20 °C/s, manter a 60 °C para 60 s, aquecer a 95 °C em uma rampa de 0,2 °C/s, e manter a 95 °C para 15 s. Analise os valores Ct usando os métodos ΔΔCt76,77 e plote os meios com erros padrão. NOTA: (1) Os primers pcr em tempo real para mRNAs de destino podem ser projetados conforme descrito75. (2) A poliubiquitina de batata 10 pode servir como um controle interno para a normalização na batata. O primer dianteiro para o gene de poliubiquitina de batata 10 é 5'-ATGTTGCCTTTCTTATGTGTGGTTG-3' e o primer reverso 5'-TTATTTATTCACATAACAACGACAGTTCAACC-3'. (3) Para análise de PCR em tempo real, a contaminação e a formação de primer-dimer podem gerar resultados falsos positivos. Para monitorar a amplificação não específica e aumentar a responsabilidade da análise pcr em tempo real, recomenda-se incluir controles sem modelo e transcriptase reversa para ensaios PCR em tempo real.</li>
</ol>

Apresentamos um sistema de silenciamento miRNA baseado em PVX para caracterizar a função de miRNAs endógenos na batata, integrando o design STTM ao vetor PVX. O sistema VbMS mostrou-se eficaz no silenciamento do miRNA165/166 na batata, uma família de miRNA altamente conservada entre espécies vegetais.
A abordagem TM foi desenvolvida para interferir na expressão de miRNAs baseada em uma mímica de alvo miRNA artificial que foi projetada para criar um loop de incompatibilidade no local esperado d...

As microRNAs (miRNAs) são caracterizadas como RNAs1 regulatórias codificadas por 20 a 24 anos, codificadas por armas nucleares e desempenham papéis fundamentais em quase todos os aspectos dos processos biológicos das plantas, incluindo crescimento e desenvolvimento2,3, fotossíntese e metabolismo4,5,6,7, síntese hormonal e sinalização 8,9, respostas biográficas e abióticas10, 11,12,13, e regulação de nutrientes e energia14,15. Os papéis regulatórios das miRNAs vegetais são bem programados e cumpridos tipicamente em níveis pós-transcrição, apertando ou reprimindo translacionadamente os mRNAs alvo.
Foram feitos enormes progressos na identificação, perfil transcricional e previsão de metas de miRNAs em batata16,17,18,19,20,21. No entanto, a caracterização funcional de miRNAs em plantas, incluindo batata, tem ficado para trás de outros organismos devido à falta de abordagens genéticas eficientes e de alto rendimento. É desafiador realizar a análise funcional do miRNA individual por análise padrão de perda de função, pois a maioria dos miRNAs pertencem a famílias com considerável redundância genética22. Além disso, um único miRNA pode controlar múltiplos genes-alvo23 e vários miRNAs diferentes podem modular a mesma via molecular de forma colaborativa24,25. Essas propriedades dificultam a caracterização da função de um miRNA específico ou de uma família miRNA.
Grande parte da análise funcional das miRNAs tem se apoiado fortemente em abordagens de ganho de função que têm limitações óbvias. O método artificial miRNA (amiRNA) explora as transcrições primárias endógenas (pri-miRNAs) para produzir miRNAs em alto nível, levando à inibição da expressão genética alvo26,27,28,29. No entanto, a marcação de ativação e a superexpressão do miRNA usando um forte promotor 35S constitutivo muitas vezes levam a uma expressão aumentada de miRNAs que não são representativas de condições in vivo e, portanto, podem não refletir a função endógena do miRNAs30. Uma abordagem alternativa foi desenvolvida envolvendo a expressão de formas resistentes ao miRNA de genes-alvo que contêm mutações impuros nos locais de ligação e/ou decote31,32,33. Mas essa abordagem também pode potencialmente causar má interpretação do fenótipo derivado do transgene alvo resistente ao miRNA devido a artefatos transgênicos. Portanto, as conclusões desses estudos de ganho de função devem ser tomadas com cautela34. Outra grande limitação das abordagens acima descritas é que elas requerem transformação, que é intensiva em mão-de-obra e demorada. Além disso, as abordagens dependentes de transgene dificilmente são aplicáveis para espécies de plantas recalcitrantes de transformação. Portanto, é essencial desenvolver uma abordagem rápida e eficiente de perda de função para desvendar a função dos miRNAs.
Para contornar o pré-requisito do procedimento de transformação, o silenciamento microRNA baseado em vírus (VbMS) foi estabelecido combinando as estratégias de imitação de alvo (TM) com vetores derivados do vírus. No sistema VbMS, moléculas de TM projetadas artificialmente são expressas transitoriamente a partir de uma espinha dorsal do vírus, oferecendo uma poderosa ferramenta de alta produtividade e economia de tempo para dissecar a função de miRNAs 35,36 endógenos vegetais. O VbMS foi inicialmente desenvolvido em N. benthamiana e tomate com o vírus do chocalho de tabaco (TRV)35,36,37 e foi estendido para Arabidopsis, algodão, trigo e milho usando vários outros sistemas de expressão de vírus, incluindo o vírus da batata X (PVX)38, o vírus do crumple da folha de algodão (ClCrV)39, o vírus do mosaico de pepino (CMV)40,41,42, vírus do mosaico de trigo chinês (CWMV)43 , e o vírus do mosaico de listras de cevada (BSMV)44,45.
A batata (solanum tuberosum) é a quarta cultura alimentar mais importante e a cultura noncereal mais cultivada noncereal no mundo principalmente devido ao seu alto valor nutricional, alta produção de energia e requisitos relativamente baixos de insumos46. Várias características da batata fazem dele uma planta modelo dicotyledonous atraente. É uma cultura poliploide propagada vegetativamente com alta taxa de cruzamento, heterozigosidade e diversidade genética. No entanto, até o momento, não há nenhum relatório caracterizando a função de miRNAs na batata usando VbMS. Aqui, apresentamos uma clonagem independente de ligadura (LIC) adaptada à batata VbMS baseada em VbMS para avaliar a função de miRNAs em plantas de batata38. Selecionamos a família miR165/166 para ilustrar o ensaio VbMS porque a família miR165/166 e seus mRNAs alvo e os fatores de transcrição de homeodomína/leu classe III (HD-ZIP III) foram amplamente caracterizados22,47,48. Os genes HD-ZIP III são os principais reguladores do desenvolvimento de meristem e polaridade de órgãos, e a supressão da função miR165/166 leva ao aumento da expressão dos genes HD-ZIP III, resultando em defeitos de desenvolvimento pleotrópico, como a redução da dominância apical e padrões aberrantes de polaridade de folhas222,35,38,41 . Os fenótipos de desenvolvimento facilmente escoráveis correlacionados com o silenciamento do miRNA165/166 permitem uma avaliação precisa da eficácia do ensaio VbMS baseado em PVX.
Neste estudo, demonstramos que o sistema VbMS baseado em PVX pode efetivamente bloquear a função de miRNAs na batata. Como o sistema de silenciamento genético induzido por vírus (VIGS) baseado em PVX foi estabelecido em várias variedades de batata49,50,51,52, essa abordagem VbMS baseada em PVX pode provavelmente ser aplicada a uma ampla gama de espécies de batata diploide e tetraploide.

<table><tbody><tr><td>100 &micro; M dATP e 100 &micro; M dTTP</td><td>Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , EUA</td><td>TQAC136</td><td></td></tr><tr><td>3 M Acetato de sódio, pH 4.0.</td><td>Teknova, Hollister, CA 95023, EUA</td><td></td><td></td></tr>#S0297 <tr><td>Acetosiringona</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, EUA</td><td>Cepas D2666-25G</td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens: GV3101, GV2260 ou EHA105.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, EUA</td><td>VWRV0757-950ML</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido, DMSO</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, EUA</td><td>D0798-25G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, EUA</td><td>VWRV0281-25G</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DB3.1</td><td></td><td></td><td>para manutenção de PVX-LIC e pTRV2e contendo o gene ccdB</td></tr><tr><td>E. coli DH5&alfa;</td><td></td><td></td><td>para as construções de destino geradas pela clonagem LIC</td></tr><tr><td>Fertilizante: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed</td><td>ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, EUA</td><td>G99260</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes de PCR de alta fidelidade: KAPA HiFi DNA Polimerase com dNTPs</td><td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA, EUA</td><td>7958960001</td><td></td></tr><tr><td>Álcool</td> <td>isoamílicoVWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, EUA</td><td>VWRV0944-1L</td><td></td></tr><tr><td>Koptec Pure Ethanol &ndash; 200 Proof</td><td>Decon Labs, King of Prussia, PA 19406, USA</td><td>V1005M</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>M0606-250G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>MFCD00149781</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV Transcriptase</td> <td>ReversaNew England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 EUA</td><td>M0253L</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de nanogota: NanoDrop OneC Espectrofotômetro UV-Vis de microvolume com Wi-Fi</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, EUA</td> Máquina de PCR <td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>: Bio-Rad MyCycler PCR System</td><td>Bio-Rad, Hercules, Califórnia 94547, EUA</td><td>170-9703</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de PCR: Eppendorf Mastercycler pro</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, EUA</td><td>950030010 medidor de</td><td></td></tr><tr><td>pH</td><td>Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, EUA</td><td>Medidor de pH / mV de bancada - 860031</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25: 24: 1), pH 6,7 / 8,0.</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, EUA</td><td>VWRV0883-400ML</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel: Gellan Gum</td><td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, EUA</td><td>J63423-A1</td><td></td></tr><tr><td>PVX VIGS vetor: PVX-LIC</td><td></td><td></td><td>Zhao et al., 2016</td></tr><tr><td>Máquina de PCR em tempo real: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, EUA</td><td>4485697</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de PCR em tempo real: KAPA SYBR&reg; Kit FAST qPCR Master Mix (2x) Roche</td><td>Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA 01887, USA</td><td>7959389001</td><td></td></tr><tr><td>Enzima de restrição: SmaI</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes de transcrição reversa: qScript cDNA SuperMix</td><td>Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877, USA</td><td>95107-100</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extração de RNA: E.Z.N.A. Plant RNA Kit</td><td>Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071, EUA</td><td>SKU: D3485-01</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de RNase Murine</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 EUA</td><td>M0314L</td><td></td></tr><tr><td>RNAzol RT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, EUA</td><td>R4533</td><td></td></tr><tr><td>Solo: Metro-Mix 360</td><td>Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, EUA</td><td>Metro-Mix 360</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polimerase e tampão</td><td>New England BioLabs, Ipswich, miliampère 01938-2723 EUA</td><td>M0203S</td><td></td></tr></tbody></table>

silenciador de microrna baseado em vírus de batata (vbms) na batata.

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.

O silenciamento de microRNA baseado em vírus (VbMS) é uma ferramenta rápida e eficiente para caracterização funcional de microRNAs (miRNAs) em plantas. O sistema VbMS foi desenvolvido e aplicado para várias espécies vegetais, incluindo Nicotiana benthamiana, tomate, Arabidopsis, algodão e plantas monocotas, como trigo e milho. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado usando vetores VbMS baseados em PVX para silenciar miRNAs endógenas na batata. Para derrubar a expressão de um miRNA específico, moléculas de mímica-alvo (TM) de miRNA de interesse são projetadas, integradas em vetores de vírus vegetais, e expressas em batata pela infiltração de Agrobacterium para se ligar diretamente ao miRNA endógeno de interesse e bloquear sua função.

A Figura 2 mostra as plantas de batata PVX-STTM165/166 (Katahdin) com crescimento ectópico de tecidos de folhas do lado abaxial da folha de lamina ao longo das veias. Fenótipos mais severos, como a formação de folhas em forma de trompete, também foram observados. Em contraste, não foi observada anormalidade fenotípica nas plantas de controle PVX. Esses resultados mostram que o sistema VbMS foi eficaz na supressão da função miRNA endógena em plantas de batata tetraploide e o sistema PVX-VbMS ...

Apresentamos um protocolo detalhado para o sistema de silenciamento de microRNA baseado em vírus de batata X (PVX) para caracterizar funcionalmente microRNAs endógenas (miRNAs) na batata. As moléculas de mímica alvo (TM) de miRNA de interesse são integradas ao vetor PVX e transitavelmente expressas na batata para silenciar a família miRNA ou miRNA alvo.

Silenciador de microRNA baseado em vírus de batata (VbMS) na batata.

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has ...

A abordagem tradicional para analisar a função dos microRNAs em plantas depende principalmente da geração de plantas knockdown estáveis. Este sistema de silenciamento de microRNA baseado em vírus não requer transformação tediosa e demorada. O silenciamento de microRNAs baseado em vírus é uma ferramenta rápida e eficiente para a caracterização funcional de microRNAs em plantas que pode ser aplicada a uma ampla gama de espécies de batata diplóide e tetraplóide.Demonstrando o procedimento estará Jinping Zhao, um pesquisador associado de pós-doutorado do meu laboratório. Para projetar o módulo de imitação de alvo, insira uma sequência de incompatibilidade na sequência de complemento reverso do microRNA de interesse no local correspondente ao 10º ao 11º nucleotídeos do microRNA. Para amplificar o fragmento de imitação de alvo em tandem curto, configure uma reação de PCR com cada primer de interesse, um oligo de espaço de 48 nucleotídeos, 10 vezes o tampão de PCR, uma mistura dNTP, PCR DNA polimerase de alta fidelidade e água destilada dupla para um volume final de 50 microlitros.Em seguida, amplifique o microRNA por PCR padrão usando os parâmetros indicados. Para purificar os imitadores de alvo em tandem curto, adicione 2,5 volumes de etanol e 1/10 do volume de acetato de sódio de três molares ao produto de PCR. Misturar vigorosamente antes de centrifugar a reacção a 14 000 vezes G durante 10 minutos.Depois de remover o sobrenadante, enxágue o pellet com um mililitro de etanol 70% e deixe o pellet secar, depois dissolva o pellet em 20 microlitros de água bidestilada Para configurar uma reação de DNA polimerase T4, misture o produto de PCR de imitação de alvo em tandem curto purificado com 10 vezes tampão de DNA polimerase T4, um ditiotreitol molar, 100 milimolares dATP, DNA polimerase T4 e água destilada dupla para um volume final de cinco microlitros em gelo. Em seguida, incube a mistura por 15 minutos a 37 graus Celsius, seguido por uma incubação de 20 minutos a 75 graus Celsius para inativar a DNA polimerase T4.Para preparar a construção VBMS baseada em PVX, digerir cinco microgramas de plasmídeos de clonagem independentes de ligação PVX com 2,5 microlitros de SMA1 em um volume total de 100 microlitros. Adicionar um volume igual de fenol ao clorofórmio ao álcool isoamílico, adicionar uma proporção de 25 a 24 para um aos produtos de clonagem independentes de ligação PVX digeridos com mistura vigorosa e recolher o produto por centrifugação. Adicionar um volume igual de clorofórmio ao álcool isoamílico na proporção de 24 para um ao sobrenadante com vórtice antes de submeter o conteúdo do tubo a uma segunda centrifugação.No final da centrifugação, transferir o sobrenadante para um novo tubo de centrifugação e adicionar 2,5 volumes de etanol e 1/10 do volume de acetato de sódio de três molares com uma mistura vigorosa. Centrifugue o tubo e enxágue o pellet com um mililitro de etanol a 70% e vórtice vigoroso. Centrifugue novamente o tubo e remova o sobrenadante para permitir que o pellet seque ao ar.Em seguida, dissolva o grânulo de plasmídeo de clonagem independente de ligação PVX digerido em 100 microlitros de água bidestilada Para configurar a reação da DNA polimerase T4, misture o DNA do vetor de clonagem independente de ligação PVX digerido com 10 vezes o tampão da DNA polimerase T4, um ditiotreitol molar, 100 milimolares dTTP e T4 DNA polimerase até um volume final de cinco microlitros no gelo. Em seguida, incube a mistura a 37 graus Celsius por 15 minutos, seguida de uma incubação de 20 minutos a 75 graus Celsius para inativar a DNA polimerase T4.Para clonar a sequência de imitação de alvo em tandem curto no vetor de clonagem independente de ligação PVX, misture cinco microlitros do produto de PCR de imitação de alvo em tandem curto tratado com DNA polimerase T4 com cinco microlitros do plasmídeo de clonagem independente de ligação PVX tratado com DNA polimerase T4 e incube a mistura por cinco minutos a 70 graus Celsius. No final da incubação, resfrie o conteúdo do tubo a 22 graus Celsius em uma máquina de PCR a uma taxa de 0,1 graus Celsius por segundo, deixando o tubo no termociclador por 30 minutos assim que a temperatura alvo for atingida. No final da incubação, transforme cinco microlitros de produto de reação de clonagem independente de ligação em E.coli DH5 alfa usando protocolos de transformação padrão e cultive as bactérias transformadas em uma placa LB contendo 50 microgramas por mililitro de canamicina.Depois de verificar as sequências dos fragmentos de imitação de alvo em tandem curto por sequenciamento do ciclo terminador, isole os plasmídeos PVX VBMS dos clones validados e transforme-os nas cepas apropriadas de Agrobacterium. Para inocular plantas de batata in vitro de quatro semanas com Agrobacterium contendo os plasmídeos PVX VBMS, escolha transformantes positivos contendo vetores PVX VBMS e inocule os transformantes em 50 mililitros de LB líquido contendo 50 microgramas por mililitro de canamicina e 50 microgramas por mililitro de rifampicina por 16 horas a 28 graus Celsius e 220 rotações por minuto. Durante a incubação, coloque colônias de Agrobacterium positivas em pelo menos duas novas placas LB contendo canamicina e rifampicina e cultive as culturas a 28 graus Celsius por um dia.Quando a densidade óptica a 600 nanômetros atingir 1,0, colete a cultura líquida de Agrobacterium por centrifugação e ressuspenda o pellet em um volume suficiente de tampão de infiltração para ajustar a densidade óptica em 600 nanômetros para 1,0. Após uma incubação de seis horas em temperatura ambiente, carregue uma seringa sem agulha de um mililitro com a suspensão de Agrobacterium e use uma mão para virar e segurar uma folha expandida de uma planta de batata. Usando um dedo, apoie a lâmina foliar do lado adaxial no local desejado de infiltração.E segurando a seringa vertical à superfície da folha com a outra mão, infiltre 100 a 200 microlitros de cultura de Agrobacterium no lado abaxial da lâmina. Em seguida, use um palito para coletar colônias das placas de cultura de Agrobacterium e arranhar a superfície do caule dos primeiros um ou dois entrenós das plantas de batata infiltradas e a epiderme do caule e, em seguida, cultive as plantas infiltradas na estufa por duas a quatro semanas. Quando os fenótipos aparecerem, use uma tesoura para coletar amostras com fenótipos do VBMS e das plantas de controle.Isole o RNA total dos tecidos coletados e use PCR via transcriptase reversa para analisar o microRNA e a expressão de mRNA alvo em cada amostra. Nessas imagens, o alvo tandem curto PVX imita plantas de batata 165/166 com crescimento ectópico de tecidos foliares do lado abaxial da lâmina foliar ao longo das nervuras pode ser observado. Fenótipos mais graves, como a formação de folhas em forma de trombeta, também foram observados.Em contraste, nenhuma anormalidade fenotípica é observada em plantas controle de PVX, demonstrando que o sistema VBSM é eficaz na supressão da função endógena de microRNA em plantas de batata tetraplóide. As plantas de batata PVX alvo tandem curto imitam 165/166 exibem crescimento ectópico de folha para tecido do lado abaxial da lâmina foliar ao longo das nervuras da lâmina, demonstrando que o sistema PVX VBMS pode ser aplicado a outras variedades de batata, incluindo as principais cultivares de batata. É essencial infiltrar simultaneamente as folhas e inocular o caule da mesma planta com a mesma cultura de Agrobacterium.Abordagens transgênicas para a introdução estável de moléculas de imitação alvo em plantas de batata são recomendadas quando o estado de silenciamento dos microRNAs alvo precisa ser mantido nas gerações da prole.

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Agroinfiltração e agroinfecção PVX são ensaios funcionais de rotina para expressão ectópica transitória de genes nas plantas. Esses métodos são ensaios eficientes em estratégias de efeitoomia (resistência rápida e descoberta genética de avirulência) e cruciais para pesquisas modernas em patologia molecular vegetal. Eles atendem à demanda por uma análise funcional robusta de alto rendimento nas plantas.

Agroinfiltração e Agroinfecção PVX em Batata e Nicotiana benthamiana

Induzida por vírus silenciamento de genes é uma ferramenta útil para a identificação de genes envolvidos na resistência de plantas não hospedeiras. Nós demonstramos o uso de bactérias patogênicas que expressam GFPuv em identificar plantas silenciados genes suscetíveis a agentes patogênicos não hospedeiras. Esta abordagem é simples, rápido e facilita a triagem em grande escala e protocolo semelhante pode ser aplicado ao estudo de várias outras interacções planta-microorganismo.

VIGS Mediada frente Triagem Genética para identificação de genes envolvidos na resistência não hospedeiras

Descrevemos aqui um método para regular o tropismo do picornavírus incorporando sequências complementares a microRNAs específicos no genoma viral.  Este protocolo pode ser adaptado a todas as diferentes classes de vírus com modificações baseadas na duração e natureza de seu ciclo de vida.

Regulamento baseada MicroRNA de Picornavirus tropismo

Aqui, apresentamos dois protocolos para transformar plantas de batata. A transformação de Agrobacterium tumefaciens leva a uma planta transgénica completa enquanto o Agrobacterium rhizogenes produz raízes peludas transgênicas em uma selvagem tipo de fotos que podem ser propagados Self. Nós então detectar atividade de promotor por GUS coloração nas raízes transformadas.

Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes-transformação mediada de batata e a atividade de promotor de um Gene de suberina por GUS Staining

Aqui, apresentamos um método de triagem modificado que pode ser amplamente usado para triagem rapidamente de supressores de RNA em patógenos vegetais.

Triagem e Identificação de Supressores de Silenciamento de RNA de agentes secretos de patógenos vegetais

Este método demonstra o uso da técnica de hibridização do norte para detectar miRNAs a partir do extrato total de RNA.

Análise de blot de RNA para detecção e quantificação de MicroRNAs vegetais

Um protocolo de injeção à base de agrobacterium (agroinjeção) é apresentado para a inoculação do vírus do mosaico de rabo-de-raposa e do vírus do mosaico de cana-de-açúcar em mudas de milho. A inoculação dessa forma leva à infecção viral, silenciamento genético induzido por vírus de genes marcadores e superexpressão viral de GFP.

Agroinoculação direta de Mudas de Milho por Injeção com Vírus mosaico de rabo-de-cavalo recombinante e clones infecciosos do vírus do mosaico de cana-de-açúcar

Aqui apresentamos um protocolo para estudar a taxa de iniciação de morte celular programada por imagens contínuas de folhas inoculadas após indução de morte celular.

Estudando a iniciação da morte celular usando um microscópio digital

Aprenda a silenciar microRNAs em batatas usando o sistema VbMS baseado no vírus PVX. Este método rápido permite caracterizar funcionalmente microRNAs endógenos sem transformações estáveis em plantas diploides e tetraploides.

Silenciador de microRNA baseado em vírus de batata (VbMS) na batata.

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