Name: Descoberta de genes driver em tumores de câncer derivados de HT29 derivados do câncer colorretal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Descubra genes driver sobreexpressos em células-tronco de câncer colorretal derivadas de HT29 usando RNA-Seq e ferramentas de bioinformática. Este método computacional identifica vias de sinalização e alvos terapêuticos potenciais.

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Os autores agradecem ao Laboratório Central de Biologia da Radiação do Instituto de Pesquisa Radiológica, Chang Gung Memorial Hospital, pelo apoio técnico. Este estudo foi apoiado por subsídios do Hospital Memorial Chang Gung (CMRPD1J0321), Do Hospital Geral cheng Hsin (CHGH 106-06) e do Mackay Memorial Hospital (MMH-CT-10605 e MMH-106-61). Os órgãos financiadores não influenciaram na concepção do estudo e coleta de dados, análise e interpretação dos dados ou na redação do manuscrito.

1. Cultura celular e formação da tumorfera
<ol><li>Cultura HT29 células em um prato de 10 cm contendo o meio de águia modificada de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% antibiótico penicilina-estreptomicina (P/S).</li>
	<li>Cresça as células em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2 e 95% de umidade em condições assépticas, até atingirem 80% de confluência.</li>
	<li>Trippsinize células HT29 com 1 mL de 0,25% de trippsina por 5 min a 37 °C e, consequentemente, neutralizar a trippsina adicionando 2 mL de DMEM com 10% de FBS e 1% P/S.</li>
	<li>Conte as células HT29 usando um hemótmetro.</li>
	<li>Adicione 2.000 células/bem a uma baixa fixação de 6 placas de poço com 2 mL de DMEM sem soro com 1% de P/S e suplementada com 0,2% de B27, 20 ng/mL de fator de crescimento epidérmico (EGF), 20 ng/mL de fator de crescimento do fibroblasto (bFGF), 20 ng/mL de fator de crescimento hepatócito (HGF) e 20 ng/mL de interleucina 6 (IL6).</li>
	<li>Cresça as células a 37 °C com 5% de CO2 e 95% de umidade em condições assépticas.</li>
	<li>Adicione 0,5 mL de câncer de células-tronco a cada 2 dias até que os tumores meçam >100 μm de diâmetro por pelo menos 7 dias.</li>
	<li>Observe e meça o diâmetro da tumorfera usando um microscópio invertido com um sistema de imagem celular digital.</li>
	<li>Quando os tumores atingirem >100 μm de diâmetro, tentepsinizar os tumores com 0,25% de trippsina por 5 min a 37 °C e neutralizar a trippsina adicionando 2x o volume do meio de crescimento. Conte as células usando um hemócito.</li>
	<li>Centrifugar a 1.200 rpm por 10 min e remover o supernaspe.</li>
	<li>Incubar 5 x 104 células com 2 μL de anti-LGR5-PE e 2 μL de anti-CD133-PE em 100 μL de DMEM individualmente por 30 minutos à temperatura ambiente, tremendo a 200 rpm. NOTA: CD133 é um biomarcador geral de células-tronco de câncer que é altamente expresso em células HT29.</li>
	<li>Adicione 900 μL de PBS e analise a expressão LGR5 e CD133 usando citometria de fluxo. Uma mudança na fluorescência no canal FL2-H indica expressão genética.</li>
</ol>2. Isolamento do RNA
NOTA: Use um kit comercial (ver Tabela de Materiais) com uma coluna rápida para isolamento de RNA seguindo as instruções do fabricante.
<ol><li>Adicione 50 μL de PBS às células colhidas (2 x 105 células) e resuspense-as com pipetação.</li>
	<li>Adicione 200 μL de tampão de lise contendo 2 μL de beta-mercaptoetanol (β-ME). Vórtice rapidamente e deixe ficar por 5 minutos.</li>
	<li>Centrifugar a solução a 16.000 x g por 10 min. Colete o supernascido e misture com 200 μL de 70% de etanol.</li>
	<li>Use a coluna anexada para remover o solvente por centrifugação a 14.000 x g por 1 min.</li>
	<li>Lave usando a solução de lavagem 1 e 2 para remover completamente os não-RNAs por centrifugação a 14.000 x g por 1 min.</li>
	<li>Centrífuga novamente a 14.000 x g por 2 min para remover etanol residual.</li>
	<li>Adicione 50 μL de água destilada, centrífuga a 14.000 x g por 1 min, e colete a solução.</li>
	<li>Meça a concentração de RNA usando OD260 com um espectrofotômetro. Concentração de RNA (μg/mL) = (OD260) x (40 μg RNA/mL) e OD260/OD280 > 2. As amostras de RNA devem ter um número de integridade de RNA (RIN) > 7.</li>
</ol>3. Análise de perfil e bioinformática da RNAseq
NOTA: A análise rnAseq foi realizada comercialmente (ver Tabela de Materiais) para investigar os genes diferenciais nas tumores derivadas de HT29 em comparação com as células HT29 parentais.
<ol><li>Use serviços comerciais para etapas rnAseq, incluindo construção de biblioteca, controle de qualidade da biblioteca e sequenciamento de DNA.</li>
	<li>O relatório de dados deve conter informações importantes, incluindo as contagens de leitura, alteração de compartilhamento de log2 e valor p. Selecione os genes diferenciais de acordo com os seguintes parâmetros: genes com uma alteração de 1 2 dobras de log2 com contagem de leitura >100 no grupo tumorsphere HT29, e genes <-1 log2 dobra com contagem de leitura >100 no grupo parental HT29. Neste caso, foi considerado aceitável um valor p < 0,05 e utilizados os dados (Tabela 1). NOTA: Aqui, uma contagem genética >100 foi usada como limiar para continuar o estudo de um determinado gene e validar sua expressão.</li>
	<li>Use software de análise estatística (ver Tabela de Materiais),para mostrar um mapa de calor e identificar genes superexpressos >1 e genes regulados e downregulated < 1 em alteração de dobra de log2.</li>
	<li>Use o software R para desenhar o Gráfico do Vulcão com x: log2 fold change; y: -log10 (valor p) para mostrar os genes diferenciais.<ol>
<li>Instalar biblioteca R install.packages (biblioteca(calibrar))</li>
		<li>Leia os dados no RStudio com o seguinte programa: res <-read.csv("/Users/xxx.csv", header=T) cabeça(res) com(res, plot(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, main="HT29CSC vs HT29", xlim=c(-6,6), col="#C0C0C0")) com(subconjunto(res, pvalue<.05 & log2FoldChange>1), pontos(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="vermelho")) com (subconjunto(res, pvalue<.05 & log2FoldChange<(-1)), pontos (log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="azul")) com(subconjunto(res, pvalue>.05), pontos (log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="#444444")) abline(h=1,3, lty=2) abline (v=1, lty=2) abline(v=(-1), lty=2)</li>
		<li>Execute a corrida para obter o Enredo do Vulcão.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Seleção de genes de motorista
<ol><li>Selecione Entrada de gene único no NetworkAnalyst.</li>
	<li>Copie e cole os genes superexpressos selecionados da Tabela 1 com "humano" especificado como o organismo e o tipo de ID Official Gene Symbol. NOTA: Alternativamente, use o Ensembl Gene ID para copiar e colar.</li>
	<li>Insira os dados clicando em Upload e Proceder para analisá-los usando interação proteína-proteína (PPI) seguindo o PPI genético.</li>
	<li>Use o banco de dados interactome STRING com um corte de pontuação de confiança de 900 para mostrar os genes de sementes que cruzam os genes carregados. Os genes de sementes que se associam a mais genes individuais foram selecionados como genes condutores que podem estar envolvidos na manutenção da formação de tumores derivados de HT29. NOTA: Existem três conjuntos de dados interactome para uso: IMEx, STRING e Rolland. String contém evidências experimentais de maior confiança. Com números de genes mais baixos, o IMEx pode ser selecionado para prever e captar os genes do driver nas redes interactome.</li>
	<li>Selecione Prosseguir na visão geral do mapeamento.</li>
	<li>Selecione Branco no Plano de Fundo e Atlas de Força no botão Layout.</li>
	<li>Selecione PANTHER BP para analisar o grupo genético de regulação. NOTA: Isso mostra que o HSPA5 foi responsável pela antipoptose nas tumores derivados do HT29 neste estudo(Figura 3A). Para reduzir a classificação de campo funcional específico, a classificação KEGG, GO ou PANTHER pode ser usada alternativamente para selecionar os genes específicos do driver.</li>
</ol>

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<li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq%3A+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42(2014).</li>
</ol>

Os autores não têm divulgações financeiras relevantes.

Neste estudo, tumores semelhantes a câncer cultivados foram utilizados como modelo na análise dos dados rnAseq com bioinformática disponível. Para um modelo de doença, foram utilizadas tumores derivados de HT29. Como os tumores têm resistência a medicamentos contra terapias tumorais, o modelo estabelecido pode ser usado para investigar os mecanismos detalhados de resistência, investigando diferenças na expressão genética. Além disso, a tecnologia genômica usando rnAseq com bioinformática disponível fornece uma compreensã...

O câncer colorretal (C CRC) é uma das principais causas de morte com alta prevalência e mortalidade em todo o mundo1,2. Devido a mutações genéticas e amplificações, as células cancerígenas crescem sem controle proliferativo, o que contribui para a sobrevivência celular3, anti-apoptose4e câncer5,,6,7. Dentro de um tecido tumoral, a heterogeneidade tumoral permite que as células tumorais se adaptem e sobrevivam durante os tratamentos terapêuticos8. As células-tronco cancerígenas (CSCs), com maior taxa de autoconexão e pluripotência do que os tipos diferenciais de câncer, são as principais responsáveis pela recidiva do tumor9,,10 e CRC metastática11. Os CSCs apresentam mais resistência a medicamentos12,,13,14 e propriedades anti-apoptose15,16, sobrevivendo assim às quimioterapias tumorais.
Aqui, a fim de investigar o mecanismo potencial de stemness nas células-tronco CRC selecionadas, rnAseq foi realizado para tela de genes expressos diferencialmente em esferoides tumorais. As células cancerígenas podem formar esferoides (também chamados de tumores) quando cultivadas em condições de baixa adesão e estimuladas por fatores de crescimento adicionados ao meio cultivado, incluindo EGF, bFGF, HGF e IL6. Por isso, selecionamos células tumorais CRC HT29 que resistem às quimioterapias com aumento do STAT3 fosforilado quando tratadas com oxaliplatina e irinotecon17. Além disso, o HT29 expressou marcadores de maior caule quando cultivado nas condições de cultura descritas. O modelo CSC derivado do HT29 expressou maiores quantidades de receptor g-proteína-acoplado à proteína G 5 (LGR5)18, um marcador específico das células-tronco CRC19,,20. Além disso, o CD133, considerado um biomarcador geral para células-tronco cancerosas, também é altamente expresso na linha21 celular HT29. O objetivo deste protocolo é descobrir grupos de genes condutores nos tumores semelhantes a câncer estabelecidos com base em conjuntos de dados bioinformáticas em vez de investigar oncogenes individuais22. Investiga potenciais mecanismos moleculares através da análise RNAseq seguida de análises bioinformática disponíveis.
O sequenciamento da próxima geração é um método de sequenciamento de DNA de alta produtividade, facilmente disponível e confiável baseado na ajuda computacional, usado para rastrear abrangentemente genes do driver para orientar as terapias tumorais23. A tecnologia também é usada para detectar expressão genética a partir da transcrição reversa de uma amostra isolada de RNA24. No entanto, ao fazer a triagem com RNAseq, os genes mais importantes para atingir a terapia podem não ter o maior diferencial de expressão entre amostras experimentais e de controle. Assim, algumas bioinformáticas foram desenvolvidas para classificar e identificar genes com base em conjuntos de dados atuais como KEGG25, GO26,27ou PANTHER28, incluindo Ingenuity Pathway Analysis (IPA)29 e NetworkAnalyst30. Este protocolo mostra a integração do RNAseq e do NetworkAnalyst para descobrir rapidamente um grupo de genes nos esferoides derivados de HT29 selecionados em comparação com as células HT29 parentais. A aplicação desse método a outros modelos de doenças também é sugerida para descobrir diferenças em genes importantes.
Em comparação com a investigação da expressão genética individual, uma técnica de alto rendimento fornece vantagens para encontrar genes potenciais driver facilmente para a medicina de precisão tumoral. Com conjuntos de dados úteis como KEGG, GO ou PANTHER, genes específicos podem ser identificados com base nos modelos de doença, caminhos de sinalização ou funções específicas, e isso permite focar rapidamente em genes específicos e importantes, economizando tempo e custos de pesquisa. Uma aplicação semelhante é usada em estudos anteriores14,,18,31. Particularmente, um tumor é mais complicado porque diferentes tipos de tumores expressam genes e caminhos distintos para sobrevivência e proliferação. Portanto, este protocolo pode captar genes que distinguem diferentes tipos de tumores em diferentes circunstâncias. Há o potencial de encontrar estratégias eficazes contra os cânceres, entendendo o mecanismo de expressão genética específica.

<table><tbody><tr><td>Sistema de Imagem Celular Digital iRiS</td><td>Logos Biosystems, Inc</td><td>I10999</td><td>para observar a formação de esferas tumorais</td></tr><tr><td>Citometria de fluxo</td><td>BD biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td>para detecção de LGR5 e CD133 nas esferas tumorais</td></tr><tr><td>anti-LGR5-PE</td><td>Biolegend</td><td>373803</td><td>reagente de detecção LGR5</td></tr><tr><td>anti-CD133-PE</td><td>Biolegend</td><td>372803</td><td>detecção de CD133 reagente</td></tr><tr><td>EGF</td><td>GenScript</td><td>Z00333</td><td>para cultura de esferas tumorais</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>GenScript</td><td>Z03116</td><td>para cultura de esferas tumorais</td></tr><tr><td>HGF</td><td>GenScript</td><td>Z03229</td><td>para cultura de esferas tumorais</td></tr><tr><td>IL6</td><td>GenScript</td><td>Z03034</td><td>para cultura de esferas tumorais Kit de</td></tr><tr><td>extração de RNA PureLink Invitrogen</td><td></td><td>isolado de 12183025</td><td> RNA total para análise de RNAseq</td></tr><tr><td>Desempenho de RNAseq</td><td>Biotools, Taiwan</td><td></td><td>A análise de RNAseq é feita comercialmente pela Biotools, Ttaiwan</td></tr><tr><td>NetworkAnalyst</td><td>Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada</td><td></td><td>http://www.networkanalyst.ca/</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td>um software de análise estatística</td></tr></tbody></table>

descoberta de genes driver em tumores de câncer derivados de ht29 derivados do câncer colorretal

Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

As células-tronco cancerígenas desempenham um papel vital contra as terapias clínicas, contribuindo para a recaída do tumor. Há muitos oncogenes envolvidos na tumorigênese e no início das propriedades de câncer. Como a expressão genética na formação de tumores derivados do câncer colorretal não é clara, leva tempo para descobrir os mecanismos que trabalham em um gene de cada vez. Este estudo demonstra um método para descobrir rapidamente os genes condutores envolvidos na sobrevivência das células-tronco do câncer colorretal in vitro. Foram selecionadas e utilizadas neste estudo as células cancerígenas Colorretal HT29 que expressam o LGR5 quando cultivadas como esferoides e acompanham um aumento dos marcadores de caule CD133. O protocolo apresentado é usado para realizar o RNAseq com bioinformática disponível para descobrir rapidamente os genes de driver superexpressos na formação de tumores derivados de haste HT29 colorretais. A metodologia pode rapidamente rastrear e descobrir potenciais genes driver em outros modelos de doenças.

Para estabelecer o modelo de investigação do mecanismo em células-tronco cancerosas, as células colorretais HT29 foram usadas para cultivar tumores semelhantes a troncos de câncer in vitro em uma placa de baixa fixação contendo B27, EGF, bFGF, HGF e IL6. Os tumores &gt;100 μm de diâmetro foram formados em 7 dias(Figura 1A). Os tumores foram tentados em células únicas e analisados usando citometria de fluxo para detectar a expressão LGR5 e CD133. O LGR5 aumentou nos tumores HT29-drived de 1,1...

Apresentado aqui é um protocolo para descobrir os genes condutores superexpressos mantendo as células-tronco de câncer estabelecidas derivadas de células HT29 colorretais. RNAseq com bioinformática disponível foi realizado para investigar e tela redes de expressão genética para elucidar um mecanismo potencial envolvido na sobrevivência de células tumorais direcionadas.

Descoberta de genes driver em tumores de câncer derivados de HT29 derivados do câncer colorretal

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...

Nosso protocolo utilizou RNA-Seq e ferramentas bioinformaticas para descobrir rapidamente os genes de driver superexpressos que contribuem para a formação de tumores colorretais semelhantes a troncos. Este protocolo é usado para rastrear um gene expresso diferencialmente e caminhos de sinal para investigar um mecanismo molecular para a stemness do câncer em um câncer colorretal seletivo. No sétimo dia de cultura, use um microscópio invertido com um sistema de imagem celular digital para observar e medir o diâmetro dos tumores.Quando os tumores atingirem um diâmetro maior que 100 micrômetros, trate a cultura com 0,25% de trippsina. Após cinco minutos a 37 graus Celsius, neutralize o trippsin com duas vezes o volume do meio de crescimento e conte as células usando um hemócito. Recolher as células por centrifugação.E resuspenja a pelota em cinco vezes 10 para as quatro células por 100 microliters de concentração média. Adicione dois microliters do anticorpo primário de interesse a cada tubo e incuba as células por 30 minutos à temperatura ambiente e 200 revoluções por minuto. Ao final da incubação, lave cada tubo com 900 microlitadores de PBS e analise as células para expressão da proteína de interesse por citometria de fluxo de acordo com os protocolos padrão.Para o isolamento do RNA após a coleta de trippsina como apenas demonstrado, resuspenque as células em duas vezes 10 a 5 células por 50 microliters de concentração de PBS elise cada amostra com 200 microliters de tampão de lise suplementados com dois microliters de beta mercaptoetanol por tubo. Após um breve vórtice e uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente, colete os lises por centrifugação e adicione 200 microliters de 70% de etanol a cada tubo. Transfira as amostras para colunas rápidas e remova o solvente por centrifugação.Lave as amostras com 400 microlitadores de solução de lavagem uma e 600 microliters de solução de lavagem dois para remover completamente qualquer não-RNA por centrifugação, seguido por uma centrífuga adicional de dois minutos sob as mesmas condições centrífugas para remover qualquer etanol residual. Em seguida, resuspengue as pelotas em 50 microliters de água destilada por tubo e centrifugar a amostra por um minuto antes de coletar o RNA contendo supernantes. Para investigar a expressão genética diferencial entre as células tumorais em comparação com as células tumorais parentais após a análise de sequenciamento de RNA.Selecione genes com uma alteração maior que um a menos um log2 fold com contagem de leitura superior a 100 na tumorfera e grupos parentais. E use os comandos como indicado. Para obter um gráfico vulcâneo dos dados para determinar a expressão genética diferencial.Para a seleção de genes de unidade no analista de rede, selecione entrada de genes únicos e copie e cole os genes superexpressos selecionados com o humano especificado como o organismo e o símbolo genético oficial como o tipo de ID. Clique em Carregar e proceda. Para inserir e analisar os dados usando interação proteína-proteína, seguindo a interação genética proteína-proteína, use o banco de dados string interactome com um escore de confiança cortado de 900 para mostrar os genes das sementes.Cruzando os genes carregados. Os genes de sementes que se associam a mais genes individuais podem ser selecionados como genes condutores que podem estar envolvidos na manutenção da formação da tumorfera. Selecione Prosseguir na visão geral do mapeamento em branco no Atlas de Fundo e Força no botão Layout.Em seguida, selecione o par base PANTHER para analisar o grupo genético de regulação. Tumores de maiores de 100 micrômetros de diâmetro se formam dentro de sete dias de cultura. A análise citométrica do fluxo revela um aumento na expressão LGR5 e CD133 em tumores derivados de HT29 em comparação com as células HT29 parentais.Após o sequenciamento do RNA, os genes com uma variação maior que uma dobra de log2 em sua regulação para cima ou para baixo com um valor P inferior a 0,05, conforme determinado pelo mapa de calor, podem ser plotados para distinguir os genes significativos entre tumores derivados de HT29 e células HT29 parentais. Neste experimento representativo, a análise dos genes regulados com uma dobra maior que uma dobra de log2 resultou em 10 genes de sementes, cruzando as redes genéticas. A análise do par de bases PANTHER indicou que dois genes estavam associados à regulação negativa da apoptose.Além disso, os genes selecionados foram, consequentemente, validados pelo PCR quantitativo confirmando sua expressão aumentada em tumores derivados de HT29. A seleção diferencial de genes é o passo mais importante dos procedimentos. Lembre-se de usar uma alteração de 20 vezes maior que uma com recontagens superiores a 100 como critério.Usando este protocolo, os genes selecionados a partir das tumores derivados da colorretal podem ser derrubados ou superexpressos para descobrir seus potenciais papéis na formação da tumorfera.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este artigo descreve a preparação do tecido acabado de melanoma obtidas em culturas primárias de células, e como para remover contaminações de eritrócitos e fibroblastos a partir de células tumorais. Finalmente, descrevemos como...

Cultura de Células e Isolamento paciente Derivado de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Células-tronco de câncer putativos Melanoma

Os ensaios de esferas in vitro são comumente usados para identificar células-tronco cancerígenas. Aqui, comparamos ensaios de esferas únicas com multicélulas. Os ensaios baseados em células únicas mais trabalhosos ou a suplementação de metilcelulose fornecem resultados mais precisos, enquanto os ensaios baseados em várias células realizados em meio líquido podem ser altamente influenciados pela densidade celular.

Avaliação das Propriedades Stem Cell em carcinomas de células do ovário humano utilizar multi e individuais baseados em células Esferas Ensaios

Compreender o papel das células-tronco cancerígenas na recorrência tumoral e na resistência às terapias tornou-se um tópico de grande interesse na última década. Este artigo descreve o isolamento e a caracterização da subpopulação de células-tronco cancerígenas de linhagens celulares de carcinoma escamoso de cabeça e pescoço (CECP).

Isolamento e Caracterização de uma cabeça e pescoço carcinoma espinocelular subpopulação Tendo-tronco características celulares

Utilizando tumores derivados do paciente em um modelo pré-clínico subcutânea é uma excelente maneira de estudar a eficácia de novas terapias, a descoberta de biomarcadores preditivos, e vias resistentes aos medicamentos. Este modelo, no processo de desenvolvimento de medicamentos, é essencial para determinar o destino de muitas terapias anti-cancro novos antes da investigação clínica.

Desenvolvimento e manutenção de um tumor do paciente pré-clínica Derivado Xenoenxerto Modelo de Investigação de Novel Anti-Cancer Therapies

Descrevemos o estabelecimento de tumores colorretais ortotópicos através da injeção de células tumorais ou organoides no ceco de camundongos e o subsequente isolamento de células tumorais circulantes (CTCs) deste modelo.

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É apresentado um protocolo para o estabelecimento de um modelo de ratinho geneticamente modificado de câncer colorretal por infecção segmentar adeno-cre e sua vigilância através de colonoscopia de alta resolução.

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Nós descrevemos um protocolo detalhado para a isolação de pilhas tumor-iniciando dos xenoenxertos paciente-derivados do sarcoma humano pela seleção fluorescência-ativada da pilha, usando o antígeno-1 humano da leucócito (HLA-1) como um marcador negativo, e para a validação mais adicional e caracterização destas pilhas tumor-iniciando HLA-1-Negative.

Isolamento e caracterização de células iniciantes tumorais de sarcoma de xenoenxertos derivados do paciente

Para permitir a detecção altamente sensível do câncer colorretal humano divulgação células (CRC) colonizar os tecidos, mostramos aqui um protocolo para transdução eficiente de particulas de Lentivirus de proteína verde fluorescente (GFP) em células de organoides CRC PDX-derivado antes da sua injeção em ratos destinatários, com a observação microscópica de estéreo-fluorescência.

Deteção de alta sensibilidade de Micrometastases gerado pelo Organoids GFP de Lentivirus-transfectadas cultivadas de um Tumor de cólon derivado de paciente

O objetivo dessa metodologia é identificar células-tronco cancerígenas (CSC) em linhas de células cancerosas e amostras primárias de tumor humano com o protocolo de formação da esfera, de forma robusta, utilizando ensaios funcionais e caracterização phenotípica com citometria de fluxo e ocidental Borrão.

Obtenção de esferas de células-tronco cancerígenas de tumores ginecológicos e de câncer de mama

Neste protocolo, apresentamos um projeto experimental utilizando um sistema de knockdown condicional e um ensaio de formação de esfera adaptada para estudar o efeito da clusterina na haste dos GCSCs derivados do paciente. O protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar tanto a função in vitro quanto in vivo de genes associados à haste em diferentes tipos de CSCs.

Ensaio de formação de esferas condicionais combinadas e ensaio de formação de esfera adaptada para estudar um gene associado à haste de células-tronco de câncer gástrico derivados do paciente

Este protocolo apresenta um novo, robusto e reprodutível sistema cultural para gerar e cultivar esferoides tridimensionais a partir de células de adenocarcinoma de cólon caco2. Os resultados fornecem a primeira prova de conceito para a adequação dessa abordagem para estudar a biologia das células-tronco do câncer, incluindo a resposta à quimioterapia.

Um modelo tridimensional de esferoides para estudar células-tronco de câncer de cólon

Descubra genes driver sobreexpressos em células-tronco de câncer colorretal derivadas de HT29 usando RNA-Seq e ferramentas de bioinformática. Este método computacional identifica vias de sinalização e alvos terapêuticos potenciais.

Descoberta de genes driver em tumores de câncer derivados de HT29 derivados do câncer colorretal

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