Preparação de fatias hipocampais humanas agudas para gravações eletrofisiológicas

Usando nossa técnica, podemos testar potenciais substâncias antiepilépticas dentro de amostras cerebrais humanas para ajudar no desenvolvimento de medicamentos para epilepsia do lobo temporal. O tecido cerebral humano tem a vantagem de romper a tampa translacional entre pesquisas básicas e aplicações clínicas. No dia do procedimento ou o mais tarde possível no dia anterior, descongele 50 mililitros de uma solução de 10x de colina aCSF em um banho de água de 37 graus Celsius e adicione a solução descongelada e 50 mililitros de solução de 10x dois a aproximadamente 300 mililitros de água duplamente destilada.

Adicione as concentrações finais de glicose e cloreto de cálcio à mistura e mexa até dissolver. Em seguida, adicione água duplamente destilada a um volume final de 500 mililitros. Meça a osmolaridade.

E encha uma garrafa com aproximadamente 100 mililitros da colina 1x aCSF. No dia do procedimento, esfrie a 1x de colina aCSF no gelo e use um distribuidor de gás de vidro conectado ao gás carbogen para carbogenar a solução por pelo menos 10 a 15 minutos. Pelo menos 10 a 15 minutos antes do procedimento, pré-aquecimento do armazenamento aCSF, potássio alto mais 4-aminopirridina aCSF, e baixo magnésio mais bicuculina a 35 graus Celsius com carbogenação.

Para preparar a câmara de interface, corte dois pedaços de papel filtro de quatro por dois centímetros para cada compartimento de retenção de fatias e empilhe as peças em cima uma da outra. Em seguida, coloque cordas finas de algodão ao redor dos pedaços de papel filtro dentro dos compartimentos para quebrar a tensão da solução e garantir um fluxo uniforme. E coloque três a quatro pedaços de papel filtro de 1,5 por um centímetro em cima do pedaço maior de papel filtro em cada compartimento.

Antes de adquirir as fatias de tecido, use 70% de etanol para limpar a área de preparação e coloque uma cobertura sobre a área. Coloque super cola, duas pinças afiadas, uma espátula, um bisturi com lâminas, e uma lâmina para corte áspero do tecido cerebral perto do vibratome. Limpe a bandeja tampão e a placa do vibratome com 70% de etanol.

Quando a bandeja de tampão estiver totalmente seca, cubra-a com papel alumínio e coloque a bandeja no banho de gelo. Encha o banho de gelo com gelo esmagado e mantenha o banho a menos 20 graus Celsius até a preparação. Em seguida, limpe o vibratome e a lâmina com 70% de etanol e calibrar o vibratome para minimizar quaisquer vibrações verticais e danos teciduais durante o procedimento de corte.

Imediatamente após a aquisição da amostra de tecido, remova o tecido da colina de transporte aCSF e corte todas as porções queimadas de tecido. Corte uma superfície uniforme para facilitar a colagem da peça de tecido na placa da amostra e use o vibratome para cortar o tecido cerebral em fatias de 400 micrômetros de espessura, ajustando a amplitude e a velocidade do vibratome conforme necessário durante o corte. Algumas partes do hipocampo humano podem ser mais resistentes ao corte do que outras.

Tomar cuidado extra e tempo pode melhorar muito a qualidade da amostra. Use um bisturi para aparar as fatias cerebrais para caber na câmara de gravação e use uma espátula e pequenas fórceps para colocar cuidadosamente as fatias sobre os pequenos pedaços de papel filtro na câmara de interface por pelo menos uma hora. Para registro de atividade epilépforme, coloque uma membrana semi-permeável colada a um anel plástico na câmara e conecte os tubos de entrada e saída da câmara a uma bomba peristáltica.

Encha os tubos e a câmara com aCSF carbogenado pré-aquecido. Para preparar os eletrodos de gravação, o preenchimento puxou de um a dois pipetas de vidro megaohm com solução de cloreto de sódio de 154 mililitros. Coloque as pipetas em um suporte de eletrodos e use pinças e uma espátula para transferir uma fatia hipocampal da câmara de interface em uma placa de Petri cheia de aCSF carbogenado.

Retire o papel do filtro sem virar a fatia e coloque a fatia na câmara de gravação. Segure a fatia no lugar com malha de fatia e coloque os eletrodos na região de interesse. Comece a gravação.

A atividade de estouro induzida pelo potássio alto mais 4-aminopirida deve ser visível de dois a cinco minutos após a lavagem, enquanto a indução de eventos semelhantes a convulsões por baixo magnésio mais bicucullina pode levar até 30 minutos. A aplicação de potássio alto mais 4-aminopirridina induz atividade epilépforme na forma de eventos de explosão dentro de poucos minutos. Eventos semelhantes a convulsões com duração superior a 10 segundos podem ser induzidos com a aplicação de baixo magnésio mais bicucullina.

O número de eventos de explosão diminui tanto durante a aplicação de lacosamida quanto a aplicação de dimetiltanolamina, embora as amplitudes não sejam afetadas. A qualidade do tecido cerebral também pode ser melhorada reduzindo a contaminação e os danos durante a preparação. Fatias cerebrais humanas preparadas com nossos métodos também podem ser usadas para investigar funções fisiológicas básicas de neurônios usando grampo de remendo ou investigar a expressão genética usando várias técnicas.

Laboratórios de todo o mundo começaram a estudar mecanismos básicos dentro do cérebro humano, e esses insights podem ser usados para ajudar no desenvolvimento de drogas e podem ser testados usando nossos métodos propostos.