Modelo de Doença Cardíaca Isquêmica e Comparação Baseada em Vídeo de Contração de Cardiomiócitos usando cardiomiócitos derivados do hiPSC
5 de maio de 2020
Apresentamos um modelo de doença isquêmica do coração utilizando cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem, juntamente com um método de avaliação quantitativa dos danos teciduais causados pela isquemia. Este modelo pode fornecer uma plataforma útil para triagem de medicamentos e mais pesquisas sobre doenças isquêmicas do coração.
A pesquisa de doenças cardíacas é frequentemente realizada em pequenos e mamíferos, como roedores. No entanto, a fisiologia do coração humano difere significativamente da do coração roedor. Nosso protocolo usa cardiomiócitos diferenciados das células iPS humanas para modelar doenças isquêmicas do coração e quantificar os danos e o comprometimento funcional dos cardiomiócitos isquêmicos.
Este protocolo pode fornecer um método conveniente para a triagem personalizada de medicamentos usando células iPS derivadas de pacientes individuais, o manuseio adequado das células iPS, como o uso de meio fresco, e a mudança do meio de forma lenta e pontual é fundamental para garantir uma diferenciação bem sucedida em cardiomiócitos funcionais. Demonstrando o procedimento com Yun Liu, Yin Liang e Mengxue Wang será Chen Wang, um estudante de doutorado de um laboratório. Para induzir a diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem em células cardíacas, primeiro cubra os poços de uma placa de cultura de 96 poços com 100 microliters de 1.675 microgramas por mililitro de laminina em PBS.
Após uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius, veja três vezes 10 a quarta células-tronco em 200 microliters de meio de manutenção IPS complementados com 10 micromolar Y27632 em cada poço, e devolva a placa à Incubadora de Cultura Celular. Após 24 horas, substitua os super meios por 200 microliters de meio de crescimento IPS por poço, e devolva a placa à Incubadora de Cultura Celular por mais dois ou três dias. Quando as células atingem 70 a 80% de confluência.
Substitua o meio em cada poço por 200 microliters de meio de diferenciação pré-aquecido A e devolva a placa à Incubadora de Cultura Celular por mais 48 horas. No final da incubação lentamente substituiu o supernaente em cada poço por 200 microliters de meio de diferenciação pré-aquecido B e retornar a placa para a Incubadora de Cultura Celular. Após dois dias, substitua os supernacantes por 200 microlitrais de meio de manutenção de cardiomiócitos pré-aquecidos por poço e devolveu a placa à Incubadora de Cultura Celular por até 30 dias.
Para avaliar a contrailidade dos cardiomiócitos, instale a imagem de velocimetria de partículas j plugin e use um microscópio de contraste de fase e os garfos objetivo para gravar imagens de vídeo das células a aproximadamente 20 quadros por segundo por cerca de 10 segundos. Em seguida, salve o arquivo de vídeo conforme analisado nossa API e crie uma estrutura de pasta como indicado. Para analisar campos vetoriais bidimensionais discretos de deslocamento celular, inicie VG e selecione plugins, macros e edite para abrir a análise vetorial.
ijm, em seguida, clique em executar a análise será realizada automaticamente. Para tratamento isquêmico, substitua o supernaente em cada poço por 200 microliters de dmem sem glicose e soro, em seguida, coloque a placa em uma Câmara Hipoxica e infunda gás nitrogênio na câmara, mantendo a concentração interna de oxigênio em 2% e a concentração de dióxido de carbono em 5% por 24 horas. Células diferenciadas com sucesso, demonstra contração espontânea observada sob o microscópio com 50% dos poços de cultura tipicamente exibindo contração espontânea em menos de 20 dias.
Proteína de marcador cardíaco também pode ser usada para confirmar uma diferenciação bem sucedida As células do grupo isquêmico normalmente apresentam uma menor viabilidade nos ensaios MTT, e uma contratilidade menor do que as do grupo de controle normoxic. A razão de células positivas de iodeto de propídio também é maior no grupo isquêmico do que no grupo controle, indicando maior incidência de danos celulares. É importante que você localize com precisão as regiões de interesse na placa de captura para permitir a comparação da contrativismo dos cardiomiócitos.
Esta técnica pode ser usada para triagem de medicamentos, utilizando células iPS derivadas do paciente. Também fornece uma plataforma única para elucidar ainda mais os mecanismos subjacentes às doenças cardíacas isquêmicas
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para modelar doenças cardíacas isquêmicas utilizando cardiomiócitos diferenciados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPS-CMs). O método permite a quantificação de danos celulares e comprometimento funcional sob condições isquêmicas, fornecendo uma plataforma clinicamente relevante para pesquisa de doenças cardíacas e triagem personalizada de fármacos.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Pesquisa cardiovascular
- Biologia de células-tronco
- Fisiologia celular
Contexto
- A doença cardíaca isquêmica é uma das principais causas de mortalidade mundial.
- Modelos em roedores são comumente utilizados, mas diferem significativamente da fisiologia cardíaca humana.
- Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas oferecem um modelo mais relevante para o estudo das doenças cardíacas humanas.
- Existe a necessidade de plataformas que facilitem tanto a modelagem de doenças quanto a triagem de fármacos em um contexto humano.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um protocolo para a diferenciação de células iPS humanas em cardiomiócitos.
- Modelar a doença cardíaca isquêmica in vitro utilizando CMs-iPS-h.
- Quantificar os danos celulares e o comprometimento funcional sob condições isquêmicas.
Métodos Utilizados
- Diferenciação de células iPS humanas em cardiomiócitos utilizando meios de cultura sequenciais e placas revestidas com laminina.
- Indução de isquemia mediante exposição dos CM-iPS a 2% de oxigênio e meio livre de glicose/soro por 24 horas em câmara hipóxica.
- Avaliação da viabilidade celular por ensaios de MTT e coloração com iodeto de propídio.
- Medição da contratilidade por meio da análise do campo vetorial de deslocamento utilizando microscopia de contraste de fase e software de velocimetria por imagem de partículas.
Resultados Principais
- As condições isquêmicas aumentaram a porcentagem de células lesadas, conforme indicado pela maior coloração com iodeto de propídio.
- A viabilidade celular diminuiu no grupo isquêmico em comparação com os controles.
- A contratilidade de hiPS-CMs foi reduzida sob condições isquêmicas.
- Aproximadamente 50% das poças de cultura exibiram contração espontânea dentro de 20 dias de diferenciação.
Conclusões
- O protocolo fornece um modelo robusto in vitro para a doença cardíaca isquêmica utilizando cardiomiócitos derivados de humanos.
- Este sistema permite a quantificação tanto dos danos celulares quanto da disfunção funcional.
- O modelo é adequado para triagem personalizada de fármacos e estudos mecanicistas adicionais da doença cardíaca isquêmica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Os modelos de cardiomiócitos derivados de iPSCs humanas preenchem a lacuna translacional entre estudos em roedores e doenças cardíacas humanas, permitindo uma descoberta preditiva em estágios iniciais para doenças cardíacas isquêmicas. A análise quantitativa da contratilidade baseada em vídeo e ensaios de viabilidade fornecem dados acionáveis para validação de alvos e desvio mecanicista de riscos. Esta plataforma apoia decisões de portfólio ajustadas ao risco e estratégias de triagem personalizadas de fármacos em pesquisa e desenvolvimento cardiovascular.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação dos mecanismos de lesão isquêmica em um sistema relevante ao ser humano.
- Apoia a validação funcional de alvos por meio de leituras quantitativas da contratilidade e da viabilidade.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao modelar respostas celulares relevantes à doença.
- Aprimora a confiabilidade preditiva para a triagem inicial de portfólios em programas cardiovasculares.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece uma plataforma padronizada de cardiomiócitos derivados de hiPSCs para avaliação reprodutível de compostos.
- Fornece métricas quantitativas de contratilidade por meio da análise do campo vetorial de deslocamento.
- Permite triagem escalonável baseada em vídeo para detecção de comprometimento funcional sob condições isquêmicas.
- Apoia a preparação do ensaio para triagem de fármacos e estudos mecanicistas posteriores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha descobertas in vitro com a biologia da doença humana, garantindo continuidade translacional.
- Permite o uso de células derivadas de pacientes para perfis personalizados de resposta a medicamentos.
- Reduz a dependência de modelos não humanos, aumentando a relevância das doenças nos dados pré-clínicos.
- Apóia a descoberta e validação de biomarcadores em um contexto clinicamente relevante.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este modelo de isquemia em cardiomiócitos derivados de hiPSCs integra a descoberta inicial, a identificação de compostos promissores e a pesquisa translacional, fornecendo desfechos funcionais e de viabilidade específicos para humanos.
- Biologia da Descoberta: Quantifica lesão isquêmica e disfunção contrátil para testes de hipóteses e análise de vias.
- Triagem: Oferece saídas reprodutíveis e quantitativas de contratilidade e viabilidade para triagem de compostos.
- Análises: Integra análise de deslocamento baseada em vídeo e ensaios de viabilidade para comparação estatística robusta.
- Pesquisa Translacional: Permite modelagem específica por paciente e apoia o alinhamento de biomarcadores com desfechos clínicos.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável e escalonável para descoberta de fármacos cardiovasculares e estudos mecanicistas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Padroniza ensaios funcionais e sustenta fluxos de trabalho escaláveis e reprodutíveis.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir/não prosseguir e aumenta a eficiência do capital ao reduzir riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de ativos cardiovasculares.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de hiPSC, diferenciação e validação de marcadores cardíacos.
- Exige acesso a câmaras hipóxicas, microscopia de contraste de fase e software de análise de vídeo.
- Exige padronização entre equipes para reprodutibilidade do ensaio e comparabilidade dos dados.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes linhagens de iPSC derivadas de pacientes ou subtipos de doenças.
- A seleção cuidadosa da região de interesse é essencial para comparação precisa da contratilidade.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:05
Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC) Cardiac Differentiation Induction
2:30
Induced Pluripotent Stem Cell-Cardiomyocyte (iPS-CM) Contractility Assessment
3:15
Ischemia Exposure
3:42
Results: Representative Cardiac Cell Differentiation
4:27
Conclusion
