Name: Usando magnetometria para monitorar a incorporação celular e a biodegradação subsequente de nanopartículas de óxido de ferro quimicamente sintetizadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Aprenda a sintetizar nanopartículas de óxido de ferro e monitorar sua incorporação celular e biodegradação usando magnetometria em células-tronco humanas. Este método permite quantificar transformações biológicas com precisão.

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Este trabalho foi apoiado pela União Europeia (projeto ERC-2014-CoG MaTissE #648779). Os autores gostariam de reconhecer a plataforma de caracterizações físico-químicas CNanoMat da Universidade Paris 13.

1. Síntese de nanopartículas magnéticas
<ol><li>Síntese do núcleo – assistida por micro-ondas<ol>
<li>Dissolver 400 mg de acetilado de ferro (>99,9%) em 10 mL de álcool benzílico (BA, 99,8%) dentro de um frasco de vidro monowave de 30 mL.</li>
		<li>Aumente a temperatura da suspensão de 25 a 250 °C em 20 minutos (a uma taxa de 11,25 °C/min) e mantenha-a em 250 °C por 30 min usando um reator de micro-ondas.</li>
		<li>Transfira as nanopartículas resultantes suspensas em álcool benzílico para um frasco de vidro e separe as nanopartículas usando um ímã de neodímio por 30 minutos.</li>
		<li>Lave o precipitado no frasco de vidro anterior de 100 mL com 10 mL de diclorometano, hidróxido de sódio de 1 M, etanol, pH 7 água (três vezes) usando um ímã de neodímio por 5 min cada passo para pelotizar nanopartículas e remover o supernatante.</li>
		<li>Ajuste a suspensão da nanopartícula em água para pH 2 usando ácido clorídrico de 1 M e, em seguida, centrífuga em filtros ultracentrifugal de 100 kDa a 2.200 x g por 10 min.</li>
		<li>Remova o filtrado, adicione 12 mL de ácido clorídrico de10 a 2 M à solução de nanopartículas e centrífuga em filtros ultracentrifugal de 100 kDa a 2.200 x g por 10 minutos (três vezes). Em seguida, diluir a solução de nanopartículas dentro de 10 mL de 10-2 M de ácido clorídrico antes de revestir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Revestimento<ol>
<li>Diluir 175 mg de ácido cítrico e ácido poliacrílico na água em pH 2 em um frasco de vidro de 100 mL e ajustar o pH para 2 com uma solução de ácido clorídrico de 1 M.</li>
		<li>Adicione as nanopartículas de 10 mL dispersão aquosa à solução de molécula de revestimento, correspondendo a uma razão de massa de 5 entre a molécula de revestimento e as nanopartículas. Agitar por 2 h sob agitação magnética à temperatura ambiente.</li>
		<li>Após a reação, ajuste o pH para 7 com hidróxido de sódio de 1 M.</li>
		<li>Centrifugar a solução de nanopartículas 3 vezes com água deionizada (DI) em filtros ultracentrifugal de 100 kDa a 2.200 x g por 10 min; remover o filtrado e diluir a solução de nanopartículas em 12 mL de água DI.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Cultura e rotulagem magnética de células-tronco
<ol><li>Cultura células-tronco mesenquimais humanas (MSC) em meio de crescimento completo de células-tronco mesenquimais (MSCGM) a 37 °C e 5% DE CO2. Quando as células estiverem com 90% de confluência, adicione 10 mL de trypsin-EDTA pré-aquecido a 37°C por frasco de 150 cm² e deixe por 2-3 minutos para desacoplar as células.<ol>
<li>Para saber quando as células são separadas, observe-as com um microscópio de campo brilhante. Resuspenque as células separadas no MSCGM e divida-as em quatro frascos de 150 cm². Amplie as células desta forma até a passagem 4 a 5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare a solução de nanopartículas magnéticas para rotulagem celular: disperse a concentração escolhida de nanopartículas de óxido de ferro no meio do Instituto Memorial roswell park livre de soro (RMPI-1640) sem glutamina. O RPMI é usado para incubação de nanopartículas (e as etapas de lavagem relacionadas), pois tem uma resistência iônica menor do que o DMEM e melhor evita eventos de agregação de nanopartículas.</li>
	<li>Quando as células estiverem na passagem 4 ou 5 e 90% confluentes, remova o meio MSCGM, enxague as células com RPMI livre de soro (sem glutamina) e adicione 10 mL de solução de nanopartículas de óxido de ferro por frasco de cultura de 150 cm2, que é o volume mínimo necessário para cobrir todas as células.</li>
	<li>Incubar a 37 °C e 5% de CO2 por 30 min e depois descartar a solução de nanopartículas. Lave uma vez com RPMI-1640 livre de soro (sem glutamina) e incubar com o Médio Águia Modificado (DMEM) de Dulbecco complementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina (25 mL por frasco de 150 cm2) durante a noite a 37 °C e 5% de CO2 para permitir uma internalização completa das nanopartículas.</li>
</ol>3. Formação de células-tronco-esferóides
<ol><li>Prepare-se recentemente o meio de cultura celular-esferóide composto de DMEM alta glicose com L-glutamina suplementada com ácido L-ascórbico 2-fosfato, 0,1 μM dexametasona, 1 mM piruvato de sódio, 0,35 mM L-proline e 1% suplemento de cultura universal contendo insulina, transferrina humana e ácido selenous (ITS-Premix).</li>
	<li>Retire os MSCs magnéticos adicionando 10 mL de 0,05% trypsin-EDTA pré-aquecido a 37 °C por 150 cm2 frasco por 2-3 minutos. Quando as células forem separadas, inative imediatamente a trippsina adicionando 1/3 do volume de DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% penicilina-estreptomicina pré-aquecida a 37 °C.</li>
	<li>Centrifugar as células dissociadas a 260 x g por 5 min, aspirar a mídia e suspender as células em um pequeno volume (menos de 1 mL por frasco de 150 cm²) de meio de cultura esferoide celular, como ter 200.000 células em cerca de 50 μL de meio. Conte o número da célula usando um hemócito e ajuste o volume se necessário.</li>
	<li>Adicione 1 mL de cultura esféide celular recém-preparada em um tubo de centrífuga cônica estéril de 15 mL e adicione o volume de solução resuspended correspondente a 200.000 células.</li>
	<li>Centrifugar essas células magneticamente rotuladas a 180 x g por 3 min, como formar uma pelota celular na parte inferior do tubo e manter o supernasce, que é o meio de cultura celular.</li>
	<li>Abra ligeiramente os tubos para permitir a troca de ar e incubar a 37 °C com 5% de CO2 por até 21 dias, tempo de cultura ao longo do qual as células formam uma estrutura 3D coesa que resulta em um esferoide totalmente formado. Troque o meio duas vezes por semana.</li>
	<li>Em determinados dias, lave os esferoides duas vezes com tampão de cacodilato feito de 0,2 M de cacodilato diluído em água desmineralizada e fixe-os usando 2% glutaraldeído em 0,1 M tampão de cacodilato diluído em água destilada por 30 min à temperatura ambiente. Armazene os esferoides fixos em PBS até ser usado para medição VSM ou imagem TEM. Essa etapa de fixação interrompe todos os processos biológicos e permite a conservação a longo prazo.</li>
</ol>4. Quantificação de nanopartículas magnéticas na solução e em celulose usando um magnetômetro de amostra vibratória (VSM)
<ol><li>Coloque um determinado volume de solução de nanopartícula magnética (máximo de 10 μL) ou um único esferoide celular no suporte de amostra especificamente projetado para caber no VSM.</li>
	<li>Insira a amostra no VSM e escaneie para deslocamento da amostra. Coloque a amostra na posição correspondente ao máximo de magnetização.</li>
	<li>Realize a primeira medição em um campo magnético baixo (entre -1500 Oe e +1500 Oe) com uma taxa de 20 Oe/s.</li>
	<li>Realize uma segunda medição em um campo magnético alto (entre -30 000 Oe e +30 000 Oe) com uma taxa de 200 Oe/s.</li>
</ol>5. Análise de Microscopia eletrônica de transmissão (TEM)
<ol><li>Para as soluções de nanopartículas, deposite 10 μL da solução aquosa em uma rede de cobre revestida de carbono e deixe-a secar à temperatura ambiente.</li>
	<li>Para as nanopartículas internalizadas nas células, contraste os esferoides de células fixas com Extrato de Chá Oolong (OTE) a 0,5% diluídos em tampão de cacodilato de 0,1 M, pós-correção com 1% de tetroxida de ósmio contendo 1,5% de cianoferato de potássio e depois desidratado em banhos de etanol de grau, incluído em Epon. Corte ultras seções de 70 nm e deposite-as em grades de cooper.</li>
	<li>Faça imagens usando um microscópio eletrônico a 80 kV com uma ampliação de 1k para a observação de células inteiras a 40k para a observação de compartimentos endossomais.</li>
</ol>

<ol><li>Azevedo-Pereira, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+as+a+tool+to+track+mouse+neural+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Superparamagnetic iron oxide nanoparticles as a tool to track mouse neural stem cells in vivo.</a> Molecular Biology Reports. 46 (1), 191-198 (2019).</li>
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<li>Levy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+in+vivo+biotransformation+of+iron+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Long term in vivo biotransformation of iron oxide nanoparticles.</a> Biomaterials. 32 (16), 3988-3999 (2011).</li>
<li>Briley-Saebo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+cellular+distribution+and+degradation+of+iron+oxide+nanoparticles+following+single+intravenous+injection+in+rats%3A+implications+for+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Hepatic cellular distribution and degradation of iron oxide nanoparticles following single intravenous injection in rats: implications for magnetic resonance imaging.</a> Cell and Tissue Research. 316 (3), 315-323 (2004).</li>
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<li>Sangnier, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+magnetic+nanoparticle+surface+coating+on+their+long-term+intracellular+biodegradation+in+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Impact of magnetic nanoparticle surface coating on their long-term intracellular biodegradation in stem cells.</a> Nanoscale. , (2019).</li>
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<li>Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetophoresis+and+ferromagnetic+resonance+of+magnetically+labeled+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells.</a> European Biophysics Journal. 31 (2), 118-125 (2002).</li>
<li>Jing, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+intracellular+magnetic+nanoparticle+uptake+measured+by+live+cell+magnetophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative intracellular magnetic nanoparticle uptake measured by live cell magnetophoresis.</a> The FASEB Journal. 22 (12), 4239-4247 (2008).</li>
<li>Van de Walle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+in+situ+magnetic+measurement+of+the+intracellular+biodegradation+of+iron+oxide+nanoparticles+in+a+stem+cell-spheroid+tissue+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Research%22%5BJournal%5D)">Real-time in situ magnetic measurement of the intracellular biodegradation of iron oxide nanoparticles in a stem cell-spheroid tissue model.</a> Nano Research. , (2020).</li>
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Os autores não têm nada a revelar.

Usando uma síntese rápida e eficiente baseada em micro-ondas, as nanopartículas magnéticas podem ser facilmente sintetizadas, com tamanho controlado e ainda revestidas com moléculas dadas. Um passo crítico é estocar o sal de ferro e o álcool benzílico sob vácuo para manter uma pequena dispersão de tamanho. O álcool benzílico atua tanto como solvente quanto ligante ao mesmo tempo permitindo obter diretamente óxido de ferro descalço sem a necessidade de ligantes adicionais. Após a transferência de nanopartículas na água, a...

Há um aumento do interesse nas características magnéticas das nanopartículas de óxido de ferro para uma ampla gama de aplicações biomédicas. Sua resposta à ressonância magnética torna-os agentes de contraste confiáveis para ressonância magnética (RM), uma vantagem na medicina regenerativa onde células rotuladas com nanopartículas magnéticas podem ser rastreadas in vivo após a implantação1. Usando campos magnéticos, as células também podem ser guiadas à distância; dessa forma, os esferoides celulares2,3, anéis4ou folhas5 podem ser projetados magneticamente e também remotamente estimulados6, um ativo no desenvolvimento de tecidos livres de andaimes. A gama de possibilidades para essas nanopartículas também inclui sistemas de entrega de medicamentos7,8 e tratamento hipertérmico magnético e fotoinduzido para matar células cancerosas9,10,11. Para todas essas aplicações, as nanopartículas são integradas no ambiente biológico por injeção intravenosa ou por internalização direta nas células e são então deixadas dentro, o que coloca em questão seu destino intracelular.
As análises in vivo transmitiram uma compreensão geral do destino das nanopartículas no organismo: após a injeção na corrente sanguínea, elas são capturadas principalmente pelos macrófagos do fígado (células kupffer), baço e medula óssea, são progressivamente degradadas, e se juntam à piscina de ferro do organismo12,13,14,15,16,17,18,19. Observações qualitativas só são possíveis devido à circulação das nanopartículas em todo o organismo. Normalmente, a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) pode ser usada para observar diretamente as nanopartículas e a presença de ferro nos órgãos pode ser determinada através da dosagem. Mais recentemente, seu destino foi avaliado diretamente em uma piscina de células, ou seja, em circuito próximo sem fuga de ferro, permitindo uma medição quantitativa de suas biotransformações no nível celular20,21,22. Tais medidas são possíveis através da análise das propriedades magnéticas das nanopartículas que estão fortemente ligadas à sua integridade estrutural. A magnetometria da amostra vibratória (VSM) é uma técnica onde a amostra é vibrada periodicamente de modo que a medição da bobina do fluxo induzido fornece o momento magnético da amostra no campo magnético aplicado. Tal detecção síncron sua permite uma medição rápida, que é um trunfo para determinar os momentos magnéticos de um grande número de amostras20,21,22,23. A assinatura magnética macroscópica recuperada pela VSM dá então uma visão geral quantitativa de toda a amostra biológica diretamente correlacionada com o tamanho e estrutura das nanopartículas. Em particular, fornece o momento magnético na saturação (expresso em emu) das amostras, que é uma quantificação direta do número de nanopartículas magnéticas presentes na amostra, respectivamente para suas propriedades magnéticas específicas.
Foi demonstrado que o processamento intracelular de nanopartículas magnéticas está fortemente ligado às suas características estruturais20. Esses recursos podem ser controlados através de protocolos de síntese ideais. Cada protocolo apresenta vantagens e limitações. As nanopartículas de óxido de ferro são comumente sintetizadas em soluções aquosas por meio da coprecipitação dos íons de ferro24. Para superar as limitações da polidispersidade do tamanho das nanopartículas, outros métodos de síntese, como métodos de sol-gel mediados por poliol, foram desenvolvidos25. Abordagens não diatéacas por decomposição térmica leva à produção de nanopartículas de óxido de ferro muito bem calibradas26. No entanto, o uso de grandes quantidades de surfactantes como oleylamina ou ácido oleico complica sua funcionalização e transferência de água para aplicações biomédicas. Por essa razão, sintetizamos tais nanopartículas magnéticas através de uma rota de gel sol não diatéramos que leva à alta cristalina, pureza e reprodutibilidade27. Este protocolo produz nanopartículas de tamanho bem controlada que podem ser ajustadas através da variação de temperatura28. No entanto, a rota sol-gel não aquosa assistida por micro-ondas tem um limite de tamanho superior das nanopartículas obtidas de cerca de 12 nm. Este procedimento não seria adaptado para aplicações usando partículas ferromagnéticas à temperatura ambiente. Além da síntese do núcleo, outra característica principal a ser considerada é o revestimento. Deitado na superfície da nanopartícula, o revestimento age como uma molécula de ancoragem, ajudando a internalização direcionada das nanopartículas, ou pode proteger a nanopartícula da degradação. Uma vez que o álcool benzílico age como uma fonte de oxigênio e um ligante ao mesmo tempo, nanopartículas nuas são produzidas sem a necessidade de surfactantes adicionais ou ligantes. As nanopartículas são facilmente funcionalizadas após a síntese sem um processo de troca de surfactantes.
Nesse caso, são avaliados dois tipos de nanopartículas que possuem o mesmo núcleo e diferem no revestimento. O núcleo é sintetizado usando uma técnica baseada em micro-ondas rápida e altamente eficiente. Os dois revestimentos comparados consistem em ácido cítrico, um dos mais utilizados como agente de revestimento em aplicações biomédicas29,30e ácido poliacrílico (PAA), um revestimento polimérico com alto número de funções de quesquente. As medidas de magnetometria VSM são então usadas primeiro para quantificar a absorção de nanopartículas pelas células e, em seguida, como uma avaliação direta da integridade estrutural da nanopartícula após a internalização em células-tronco. Os resultados demonstram que a concentração de incubação impacta a absorção de nanopartículas e que o revestimento influencia sua degradação, com o grande número de moléculas de ancoragem de PAA protegendo o núcleo da degradação.

<table><tbody><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Álcool benzílico para síntese</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8.22259</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>Prepare uma solução estoque de 1 mM diluída em etanol 100% e armazene a -20&deg; C</td></tr><tr><td>Diclorometano &ge; 99% estabilizado, GPR RECTAPUR</td><td>VWR Chemicals</td><td>23367</td><td></td></tr><tr><td>DMEM com Glutamax I</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td>Sem piruvato de sódio, sem HEPES</td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>VWR</td><td>20821.310</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Solução de formalina 10% tamponado neutro</td><td>Sigma</td><td>HT5012</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico, solução padronizada 1.0N</td><td>Alfa Aesar</td><td>35640</td><td></td></tr><tr><td>Acetilacetonato de ferro(III) (> 99,9%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>517003</td><td></td></tr><tr><td>ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)</td><td>Corning</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid 2-fosfato</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td>Prepare uma solução concentrada fresca (25 mM) diluída em água destilada</td></tr><tr><td>L-Prolina</td><td>Sigma</td><td>P5607</td><td>Prepare uma solução estoque de 175 mM diluída em água destilada e armazene a 4&deg; C</td></tr><tr><td>Células-tronco mesenquimais (MSC)</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidro mono-onda</td><td>Anton Paar</td><td>82723_us</td><td></td></tr><tr><td>Reator de micro-ondas</td><td>Anton Paar</td><td>Monowave 300</td><td></td></tr><tr><td>MSCGM BulletKit médio</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>Para o meio completo, adicione o BulletKit fornecido (contendo soro, glutamina e antibióticos) ao meio MSCGM</td></tr><tr><td>PBS sem CaCl2 c/ o MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina (10.000U/mL)/Estreptomicina (10.000&micro; g / mL)</td> <td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Poli (ácido acrílico, sal de sódio)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>416010</td><td>MW = 1200 g / mol</td></tr><tr><td>RPMI médio 1640, sem glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>31870-025</td><td>Sem piruvato de sódio, sem</td></tr><tr><td>HEPES Hidróxido de sódio, 1.0N Solução padronizada</td><td>Alfa Aesar</td><td>35629</td><td></td></tr><tr><td>Solução de piruvato de sódio 100mM</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga cônico estéril</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td>tubos de 15 mL</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de trissódio</td><td>VWR</td><td>33615.268</td><td>Prepare uma solução estoque de 1 M diluída em água destilada e armazene a 4&deg; C</td></tr><tr><td>Citrato de Trissódio Di-hidratado, AR Certificado para Análise</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10396430</td><td></td></tr><tr><td>Filtro ultracentrífugo</td><td>Amicon</td><td>AC S510024</td><td></td></tr></tbody></table>

usando magnetometria para monitorar a incorporação celular e a biodegradação subsequente de nanopartículas de óxido de ferro quimicamente sintetizadas

Using Magnetometry to Monitor Cellular Incorporation and Subsequent Biodegradation of Chemically Synthetized Iron Oxide Nanoparticles

As nanopartículas magnéticas, feitas de óxido de ferro, apresentam um interesse peculiar para uma ampla gama de aplicações biomédicas para as quais são frequentemente internalizadas nas células e depois deixadas dentro. Um desafio é avaliar seu destino no ambiente intracelular com metodologias confiáveis e precisas. Aqui, introduzimos o uso do magnetômetro de amostra vibração (VSM) para quantificar precisamente a integridade das nanopartículas magnéticas dentro das células medindo seu momento magnético. As células-tronco são rotuladas pela primeira vez com dois tipos de nanopartículas magnéticas; as nanopartículas têm o mesmo núcleo produzido através de uma síntese de gel sol não diagênea rápida e eficiente e diferem em seu revestimento: a molécula de ácido cítrico comumente usada é comparada ao ácido poliacrílico. A formação de esferoides de células 3D é então alcançada através da centrifugação e o momento magnético desses esferoides é medido em diferentes momentos com o VSM. O momento obtido é uma impressão digital direta da integridade das nanopartículas, com valores decrescentes indicativos de uma degradação de nanopartículas. Para ambas as nanopartículas, o momento magnético diminui ao longo do tempo cultural revelando sua biodegradação. Um efeito protetor do revestimento de ácido poliacrílico também é mostrado, quando comparado ao ácido cítrico.

Utilizando a síntese assistida por micro-ondas, nanopartículas magnéticas com um monodisperse 8,8 ± tamanho do núcleo de 2,5 nm são produzidas e revestidas com citrato ou PAA(Figura 1A). As células-tronco são então incubadas com essas nanopartículas dispersas em meio de cultura em uma determinada concentração por 30 minutos, resultando em sua endocitose e confinamento dentro dos endosários celulares(Figura 1B). As células-tronco magnéticas são então suspensas em...

As nanopartículas de óxido de ferro são sintetizadas através de um procedimento de gel sol não diatéico e revestidas com moléculas curtas aniônicas ou polímeros. O uso de magnetometria para monitorar a incorporação e biotransformações de nanopartículas magnéticas dentro de células-tronco humanas é demonstrado usando um magnetômetro de amostra vibração (VSM).

Usando magnetometria para monitorar a incorporação celular e a biodegradação subsequente de nanopartículas de óxido de ferro quimicamente sintetizadas

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized ...

Este vídeo introduz um método rápido e eficiente para a síntese de nanopartículas magnéticas e o uso da magnetometria para fotografar a transformação no ambiente biológico. As nanopartículas magnéticas têm atraído maior atenção para aplicações biomédicas, e é importante entender que o destino uma vez internalizado nas células. Isso é conseguido aqui medindo o magnetismo celular.Tanto para as nanopartículas magnéticas quanto para as medidas, o resultado pode ser afetado pela contaminação. Use frascos químicos bem limpos e certifique-se de que o equipamento magnetômetro esteja livre de contaminação. O suporte de amostras de magnetometria é geralmente usado para amostras de pó.Mostramos como adaptar o uso do suporte a amostras líquidas ou biológicas. Em um frasco de vidro de onda de mana de 30 mililitros dissolver 400 miligramas de ferro três acetilados em 10 mililitros de álcool benzílico. Usando um reator de micro-ondas, aqueça a suspensão de 25 graus Celsius a 250 graus Celsius a uma taxa de 11,25 graus Celsius por minuto, e mantenha-a a 250 graus Celsius.Para separar as nanopartículas, aplique um ímã de neodímio por 30 minutos. Para pellet as nanopartículas, realize uma série de lavagens usando 10 mililitros do fluido de lavagem designado e aplicando um ímã de neodímio por cinco minutos. Remova o filtrado e adicione 12 mililitros de 10 ao ácido clorídrico de menos dois molares.Centrifugar a suspensão e um filtro de 100 kilodalton a 2.200 vezes G durante 10 minutos. Em seguida, resuspenque as nanopartículas em 10 mililitros de 10 a menos dois ácido clorídrico molar. Prepare a solução da molécula de revestimento como descrito no manuscrito.Adicione a dispersão aquosa de nanopartículas de 10 mililitros à solução de molécula de revestimento a uma proporção de massa de cinco para um entre as moléculas de revestimento e as nanopartículas. Em seguida, agitar a mistura por duas horas em temperatura ambiente usando um agitador magnético. Após a reação completa, ajuste o pH da mistura para sete usando um hidróxido de sódio molar.Quando a cultura das células-tronco mesenquimais humanas estiver na passagem de cinco e 90% confluentes, remova o meio e enxágue as células com RPMI livre de soro sem glutamina. A cada frasco de cultura de 150 centímetros quadrados, adicione 10 mililitros da suspensão das nanopartículas. Incubar os frascos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos.Em seguida, descarte o meio contendo a suspensão da nanopartícula e lave as células uma vez com RPMI 1640 sem soro. Adicionar DMEM suplementado com 10% FBS e 1%de estreptomicina de penicilina. Incubar durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para permitir a interiorização completa das nanopartículas.Adicione 10 mililitros de 0,05% de trippsina EDTA pré-equipados por 37 graus Celsius a cada frasco de MSCs magneticamente rotulados. Após dois a três minutos, quando as células forem separadas, inativa imediatamente a trippsina adicionando um terço do volume de DMEM suplementado pré-avisado. Centrifugar as células isoladas a 260 vezes G durante cinco minutos.Aspire o meio e resuspenque as células em um pequeno volume de cultura esferoide celular em uma concentração de aproximadamente 200.000 células por 50 microliters. Adicione um mililitro de cultura de esferoide celular recém-preparado a um tubo de centrífuga concítrida estéril de 15 mililitros. Em seguida, adicione um volume de suspensão celular correspondente a 200.000 células.Centrifugar essas células magneticamente rotuladas a 180 vezes G por três minutos, a fim de formar uma pelota celular na parte inferior do tubo. Em seguida, coloque o tubo na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, mantendo a tampa ligeiramente aberta para troca de gás. Coloque um determinado volume de nanopartícula magnética ou uma suspensão fixa de esferoide de célula única no magnetômetro de amostra vibratória, ou VSM, suporte de amostra.Se necessário, a fita PTFE pode ser usada para evitar qualquer vazamento. Insira o suporte de amostra no VSM e escaneie para deslocamento amostral. Coloque a amostra na posição correspondente ao máximo de magnetização.Realize a primeira medição em um campo magnético baixo entre 1.500 Oersteds negativos e 1.500 Oersteds positivos a uma taxa de 20 Oersteds por segundo. Realize uma segunda medição em um campo magnético alto entre zero Oersteds e 30.000 Oersteds positivos a uma taxa de 200 Oersteds por segundo. 10 microlitres de nanopartículas dispersas em uma solução aquosa foram medidos no magnetômetro de amostra vibratória.A inclinação da segunda parte da curva é a constante diamagnética, representando o sinal diamagnético da água e o suporte da amostra. Esta constante diamagnética foi subtraída do momento magnético da solução para obter o momento magnético das nanopartículas apenas. O momento magnético na saturação foi então determinado.As nanopartículas revestidas foram internalizadas em células-tronco. Imagens de microscópio eletrônico mostram as nanopartículas revestidas de citrato e paa confinadas nos endossários. Depois que as células foram pelotadas por centrifugação, elas formaram um esferoide celular que pode ser mantido na cultura por longos períodos de tempo.Esferoides células individuais também foram medidos usando o VSM e o momento magnético de saturação foi usado para calcular a quantidade de nanopartículas em uma amostra celular. A absorção das nanopartículas dependeu da concentração de incubação. Uma diminuição no magnetismo dos esferoides celulares ao longo do tempo indicou a biodegradação das nanopartículas, o que foi confirmado pela microscopia eletrônica.A degradação foi mais substancial nas nanopartículas revestidas de citrato do que nas nanopartículas revestidas de PAA. Usando magnetometria, a degradação das nanopartículas magnéticas dentro das células pode ser precisamente quantificada, e o impacto do futuro das nanopartículas sobre o interessado no comportamento bruto pode ser avaliado. Neste protocolo, as medidas de magnetometria foram realizadas em esferoides celulares, mas podem ser estendidas às células em suspensão ou em órgãos.Com o método descrito, você é capaz de explorar as interações de nanopartículas magnéticas recém-projetadas em diferentes sistemas celulares de interesse, mas também você pode seguir sua biodistribução in vivo e destino.

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Bioengineering

Bioengenharia

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Rotulagem células-tronco com Ferumoxytol, uma FDA-Approved nanopartículas de óxido de ferro

Fonte: Arias, S. L., et al. Fabricação de uma nanocelulose bacteriana magnética funcionalizada com nanopartículas de óxido de ferro. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a síntese in situ de nanopartículas de magnetita dentro de uma película bacteriana de nanocelulose produzida por Gluconacetobacter xylinus. Ele explica como a nanocelulose bacteriana magnética é gerada por infusão de íons de ferro, precipitação alcalina e purificação.

Geração de Filmes Bacterianos Nanocelulose Embutidos em Magnetita

Aqui, apresentamos um protocolo para tornar uma nanocelulose bacteriana (BNC) magnética para aplicações na reconstrução de vasos sanguíneos danificados. O BNC foi sintetizado pela linhagem G. xylinus. Por outro lado, a magnetização do BNC foi realizada através da precipitação in situ de íons ferrosos Fe2+ e Fe3+ dentro da malha BNC.

Fabricação de uma funcionalizados Magnetic bacteriana Nanocellulose com óxido de ferro nanopartículas

A entrega celular direcionada é útil em uma variedade de aplicações biomédicas.  O objetivo deste protocolo é usar nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro (SPION) para rotular células e, assim, permitir abordagens de direcionamento de células magnéticas para um alto grau de controle sobre a entrega e localização celular.

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Usando magnetometria para monitorar a incorporação celular e a biodegradação subsequente de nanopartículas de óxido de ferro quimicamente sintetizadas (Vídeo) | JoVE Journal

Usando magnetometria para monitorar a incorporação celular e a biodegradação subsequente de nanopartículas de óxido de ferro quimicamente sintetizadas

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