Análises de competência vetorial sobre mosquitos Aedes aegypti que usam zika vírus

Em surtos mediados por arbovírus, as contramedidas são amplamente limitadas ao controle de mosquitos. Assim, as análises de competência vetorial são estratégias preventivas essenciais, pois determinam quais populações e espécies de mosquitos podem atuar como vetores para um determinado arbovírus e, portanto, devem ser alvo de intervenção. Por isso, um dos componentes mais importantes em nossa caixa de ferramentas para avaliar o papel de mosquitos e de outros vetores na transmissão de doenças infecciosas são os estudos de competência vetorial. Esses são experimentos nos quais podemos controlar com grande precisão não apenas a espécie de mosquito ou de carrapato, por exemplo, mas também cepas geográficas, bem como cepas muito específicas de diferentes vírus ou outros organismos infecciosos, obtendo dados extremamente precisos e bem controlados sobre o risco de diferentes espécies na transmissão de diferentes agentes em regiões muito específicas do mundo. Trabalhar com mosquitos infectados exige instalações dedicadas, treinamento, experiência e planejamento cuidadoso para minimizar os riscos ao pesquisador, bem como o risco de escape de um mosquito infectado. É, portanto, muito importante que novos integrantes dessas instalações dediquem tempo a trabalhar com mosquitos alimentados com sangue não infectado, a fim de se familiarizarem com as técnicas e o fluxo de trabalho.

No dia da exposição, ligue a fonte de energia em uma instalação de contenção de artrópodes para pré-aquecer as unidades de alimentação. Combine sangue humano recém-colhido com citrato ou heparinizado com um estoque viral na proporção de um para um em volume, e recubra uma unidade padrão de reservatório de três mililitros com a pele de um camundongo ingênuo não infectado. Coloque o reservatório coberto sobre papel toalha branco e adicione cerca de dois mililitros de sangue infeccioso ao reservatório, um mililitro por vez.

Em seguida, verifique com toalhas de papel para confirmar que não há vazamento. 24 horas antes de realizar o ensaio infeccioso, prepare placas de cultura celular de 24 poços com células Vero e rotule cada poço com a identidade do mosquito e a amostra. Na manhã em que os mosquitos serão expostos à refeição sanguínea infecciosa, remova as bolas de algodão saturadas com água e fixe reservatórios com as refeições sanguíneas artificiais aos terminais da unidade de alimentação usando uma caixa de contenção de plástico transparente com luvas.

Coloque a caixa de papelão com os mosquitos famintos dentro da caixa de luvas sob a unidade de alimentação. Após a conclusão da alimentação, remova o reservatório e mergulhe-o em água sanitária recém-preparada a 10%. Dentro da caixa de luvas, despeje os mosquitos anestesiados a frio em uma placa de Petri sobre gelo e separe os mosquitos saciados dos não saciados.

Despeje os mosquitos ingurgitados de volta na caixa de papelão, tampando-a rapidamente com uma tela e tampa. Apare a tela em excesso ao redor da caixa e fixe a tampa com fita adesiva. Adicione uma bola de algodão saturada com sacarose estéril filtrada a 10% na tela e coloque a caixa em um recipiente plástico secundário maior, com uma esponja úmida para manter a umidade.

Incube o recipiente secundário a 27 graus Celsius, permitindo que os mosquitos tenham acesso ad libitum à sacarose até a conclusão dos experimentos. Utilize um aspirador mecânico para obter um número predeterminado de mosquitos incubados da caixa, tampando o tubo de coleta com uma bola de algodão ao finalizar. Trabalhando dentro da câmara de luvas, despeje os mosquitos anestesiados com frio em uma placa de Petri sobre gelo.

Remova as seis pernas de cada mosquito e coloque-as em um tubo microcentrífugo de dois mililitros previamente rotulado, contendo uma esfera de aço inoxidável esterilizada e 500 microlitros de meio de coleta de mosquitos, ou MCM. Coloque suavemente o mosquito sobre uma gota de óleo mineral, tomando cuidado para que o óleo não entre em contato com a cabeça ou o probóscide do mosquito. Insira o probóscide em uma ponteira de micropipeta preenchida com 10 microlitros de soro bovino fetal inativado pelo calor e deixe o mosquito salivar por 30 minutos.

Ejete a ponteira da pipeta com a saliva em um tubo de microcentrífuga contendo 100 microlitros de MCM e coloque a carcaça em um tubo separado de dois milímetros com a esfera de aço esterilizada e 500 microlitros de MCM. Transporte os tubos para um dispositivo de homogeneização por esferas dentro de uma cabine de segurança biológica e triture todas as amostras de corpo e patas a 26 hertz por cinco minutos para liberar as partículas virais no sobrenadante. Clarifique todas as amostras por centrifugação a 200 vezes g por cinco minutos para sedimentar os detritos celulares.

Imediatamente antes da inoculação com as amostras, remova o meio dos cultivos de células Vero previamente preparados. Aliquote cuidadosamente 100 microlitros dos sobrenadantes clarificados dos corpos ou pernas em cada poço, tomando cuidado para não perturbar os detritos celulares de mosquito do pellet. Em seguida, incube as placas por uma hora.

Após a incubação, adicione um mililitro de cobertura de metilcelulose a cada poço e coloque as placas novamente na incubadora por três a sete dias. Retire as placas de cobertura da incubadora e leve-as para uma cabine de segurança biológica. Descarte a cobertura de metilcelulose em uma bandeja contendo água sanitária a 10% e lave cada poço duas vezes com PBS, descartando cada lavagem na bandeja.

Remova o PBS e adicione um mililitro de metanol-acetona por poço, deixando as células fixarem na placa por 30 minutos. Em seguida, descarte o fixador e deixe as placas secarem. Lave cada poço três vezes com PBS não estéril em um agitador orbital para placas durante 15 minutos por lavagem, depois adicione um mililitro de solução bloqueadora a cada poço e agite a placa por mais 15 minutos.

Adicione 100 microlitros de anticorpo primário anti-Vírus Zika ou anti-flavivírus a cada poço e incube a placa com agitação durante a noite. No dia seguinte, remova o anticorpo primário e repita as lavagens com PBS. Após a última lavagem, adicione 100 microlitros de anticorpos secundários e incube a placa sob agitação por uma hora.

Repita as lavagens com PBS, então adicione 100 microlitros de reagente de desenvolvimento do substrato por poço e agite a placa durante 15 minutos. Quando os focos ou placas se desenvolverem, interrompa a reação lavando a placa com água da torneira. Descarte a água da torneira e deixe as placas secarem ao ar, então quantifique os focos virais para determinar o número de unidades formadoras de foco presentes na amostra fornecida.

Três populações de mosquitos foram expostas a uma cepa epidêmica do vírus Zika em uma faixa de títulos no sangue ingerido. Nas duas semanas seguintes, subconjuntos de mosquitos foram analisados para determinar a infecção, disseminação e taxa potencial de transmissão. Nos títulos mais baixos no sangue ingerido, os mosquitos de Salvador, Brasil, estavam infectados após 4, 10 e 14 dias de incubação extrínseca, sem evidência de infecção disseminada observada nas patas analisadas.

No título mais alto, o vírus foi detectado nas pernas dos mosquitos, mas não na saliva. Os mosquitos da República Dominicana mostraram-se os mais suscetíveis à infecção e os mais competentes para transmissão em todos os títulos testados da refeição sanguínea. Mosquitos alimentados com as três doses demonstraram disseminação em sete dias e competência para transmissão em 14 dias após a infecção.

Mosquitos do Vale do Rio Grande, no Texas, expostos a títulos mais baixos de refeição sanguínea, foram infectados já a partir de quatro dias pós-infecção, enquanto infecções disseminadas foram detectadas após 14 dias. No grupo exposto ao título mais alto, a infecção foi observada a partir do segundo dia pós-infecção, atingindo picos aos 4, 10 e 14 dias. Infecções disseminadas foram observadas no sétimo dia, e apenas um único mosquito apresentou capacidade de transmissão no décimo dia.

Ao tentar este protocolo, é importante trabalhar com segurança, em vez de rapidez. Portanto, sempre manipule mosquitos infectados ou potencialmente infectados dentro de uma caixa de luvas ou de uma cabine de segurança biológica, até que tenham tido as pernas ou as asas removidas. O fluxo de trabalho básico de competência vetorial pode ser adaptado para produzir mosquitos infectados para análises posteriores, como estudos de transmissão, bem como para examinar as interações entre mosquitos, o vírus e o microbioma.

A competência vetorial tem sido uma ferramenta realmente importante para compreender o papel dos mosquitos na transmissão de vírus durante epidemias de doenças virais, e isso é válido há muitas décadas. No entanto, também é um método que evoluiu ao longo dos anos para incluir novas informações, à medida que as descobrimos, sobre as interações entre esses vírus e os vetores mosquitos. Apenas a título de dois exemplos, a população genética do vírus, a complexidade da população dentro do mosquito revela-se muito importante para sua capacidade de transmissão, e agora podemos incluir isso em estudos de competência vetorial com novos métodos de sequenciamento da população viral.

Também sabemos agora que a população de bactérias e outros organismos que vivem no trato gastrointestinal do mosquito pode ter um impacto significativo em sua capacidade de transmissão, e agora podemos avaliar essa população com novos métodos de sequenciamento. Assim, a competência vetorial é um método que evoluiu e continua evoluindo à medida que aprendemos mais sobre essas interações complexas.