Name: Análises de competência vetorial sobre mosquitos Aedes aegypti que usam zika vírus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Aprenda a realizar análises de competência vetorial em Aedes aegypti para avaliar a transmissão do vírus Zika. Este método permite identificar populações de mosquitos vetores e orientar estratégias de controle de doenças arbovirais.

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Reconhecemos a equipe do Centro Mundial de Referência para Vírus Emergentes e Arboviroses (WRCEVA): Dr. Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr. Kenneth Plante, Dr. Jessica Plante, Dionna Scharton e Divya Mirchandani, por seu trabalho incansável na curadoria e fornecimento de muitas das cepas virais usadas para nossos e outros grupos experimentos de competência vetorial. O trabalho apresentado foi financiado pelas bolsas McLaughlin Fellowship Fund (SRA) e nih grants AI120942 e AI121452.

Todos os procedimentos realizados nesses protocolos foram realizados em pleno cumprimento dos protocolos aprovados pelo Comitê de Biossegurança Institucional e pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Filial Médica da Universidade do Texas em Galveston.
1. Amplie o ZIKV em células Vero
<ol><li>Cultivar células Vero (CCL-81 ou VeroE6) na modificação de Dulbecco do meio essencial mínimo (DMEM) da Eagle suplementado com 10% v/v de soro bovino fetal inativado (FBS) e 1% (v/v) penicilina-estreptomicina (100 U/mL e 100 μg/mL, respectivamente) em uma incubadora umidificada de 37 °C com 5% de CO2 a entre 80-90% de confluência em um frasco de cultura tecidual de 150 cm2.</li>
	<li>Em um armário de biossegurança (BSC), remova o meio e descarte em alvejante de 10% ou uma diluição de trabalho de amônio quaternário duplo(Tabela de Materiais). Inocular imediatamente a monocamada com 1 mL de estoque viral, visando 0,1-1 célula de partícula viral infecciosa. Agitar o frasco imediatamente de tal forma que o inóculo contate a monocamadas em sua totalidade.</li>
	<li>Cubra o médio a um volume de 5 mL usando DMEM suplementado com FBS inativados por v/v de 2% v/v e penicilina de 1% (v/v) penicilina-estreptomicina. Em seguida, mova o frasco para a incubadora umidificada de 37 °C com 5% de CO2 por 60 min.</li>
	<li>Remova o frasco da incubadora e leve-o para um BSC. Adicione meio adicional a um volume total de 15 mL usando DMEM suplementado com FBS inativados por v/v de 2% v/v e penicilina-estreptomicina de 1% (v/v). Mova o frasco para uma incubadora umidificada de 37 °C com 5% de CO2.</li>
	<li>Examine o frasco diariamente sob microscopia de contraste de fase para obter evidências de efeitos citopáticos (CPE). Prossiga para a colheita viral (etapa 1.7) quando apenas aproximadamente 40-50% das células permanecem na monocamada, geralmente 3-5 dias após a infecção, dependendo da cepa de ZIKV sendo utilizada.</li>
	<li>Aspire o supernante e coloque em um frasco cônico de 50 mL. Esclareça o sobrenatante de detritos celulares por centrifugação (3.500 x g por 20 min). NOTA: Se vários frascos foram infectados de forma idêntica, supernacantes de vários frascos podem ser combinados em tubos cônicos de 50 mL.</li>
	<li>Remova o supernatante do tubo cônico de 50 mL para um novo, tomando cuidado para não interromper a pelota. Suplemente o supernatante com FBS inativado a calor a uma concentração final de 30% (v/v). Aliquotar esta mistura em tubos individuais de tampa de parafuso e congelar a -80 °C até usar.</li>
</ol>2. Preparação de farinhas de sangue artificiais
<ol><li>No dia em que os mosquitos devem ser expostos a farinhas infecciosas, ligue a fonte de energia (Tabela de Materiais) em uma instalação de contenção de artrópodes, de modo que as unidades de alimentação(Tabela de Materiais) estejam pré-aquecidos quando os mosquitos estiverem preparados para exposição.</li>
	<li>Prepare farinhas de sangue artificiais usando um dos métodos descritos abaixo.<ol>
<li>Método 1: Combinar sangue humano recém-colhido (dentro de uma semana) citado ou heparinizado comprado comercialmente 1:1 v/v com estoque viral (preparado conforme descrito na seção 1). NOTA: Este método depende da ausência de quaisquer anticorpos para a família vírus/vírus estar presente no sangue.</li>
		<li>Se a ausência de anticorpos não puder ser confirmada ou a fonte de sangue for conhecida por ter exposição prévia ao flavivírus, lave e embale manualmente os eritrócitos.<ol>
<li>Em um BSC, adicione 30 mL de sangue humano inteiro a um tubo cônico de 50 mL e cubra até 50 mL com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS).</li>
			<li>Centrifugar a 3.500 x g por 20 min.</li>
			<li>Aspire o supernatante, derramando suavemente em uma panela de bandeja contendo 10% de alvejante ou diluição de trabalho de amônio quaternário duplo, tomando cuidado para não descartar a pelota de eritrócito.</li>
			<li>Adicione 10 mL de PBS e bata suavemente a parte inferior do tubo cônico contra a parte inferior do BSC de tal forma que a pelota eritrócito tenha sido reconstituída. Leve o volume da suspensão até 50 mL com PBS. Misture por inversão suave.</li>
			<li>Repetição de passos 2.2.2.1−2.2.2.4 um total de 4-6x. Confirme se o supernatante é claro ou apenas ligeiramente rosa e não mais opaco. Remova todo o supernatante usando uma pipeta sorológica. Resuspend a pelota eritrócito em 1-2 mL de PBS.</li>
			<li>Monte a farinha de sangue: 350 μL de eritrócitos embalados, 100 μL de 10% de sacarose, 200 μL de FBS inativados pelo calor, ATP recombinante de 900 μM e 2 mL de estoque de vírus apropriadamente diluído usando DMEM complementado com FBS inativados por calor de 2% v/v e 1% (v/v) penicilina-estreptomicina.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sobreponha uma unidade de reservatório padrão de 3 mL(Tabela de Materiais) com a pele de um rato não infectado (outras opções incluem filme de parafina, membranas colágenas ou invólucro de salsicha).</li>
	<li>Coloque o reservatório coberto em toalhas de papel branco. Adicione ~2 mL de farinha de sangue infecciosa ao reservatório 1 mL de cada vez. Inspecione a toalha debaixo do alimentador para obter qualquer evidência de vazamento. Se houver vazamentos, recupere a farinha de sangue dos alimentadores e descarte as tampas. Sele os alimentadores com plugues. Mais uma vez confirme que não há vazamentos.</li>
</ol>3. Backtitration of bloodmeals/plaque assay
<ol><li>Utilizando o volume restante da farinha de sangue preparada, realize uma série de diluição serial de 10x (ou seja, 6 diluições, variando de diluído 10x a 1.000.000x) utilizando DMEM complementado com FBS inativados por v/v de 2% v/v e penicilina-estreptomicina de 1% (v/v).</li>
	<li>Alíquota 100 μL das diluições nos poços de 24 ou 12 placas de poços das mais diluídas para as mais concentradas.</li>
	<li>Incubar por 1h em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2.</li>
	<li>Ao final do período de incubação de 1 h, leve as placas de volta ao BSC e adicione 1 mL ou 2 mL de sobreposição de metilcelulose aos 24 poços ou 12 placas de poço, correspondentemente.</li>
	<li>Coloque as placas sobrepostas de volta em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 e incubar por 3-7 dias (dependente de cepa do vírus).</li>
	<li>Após a incubação, remova as placas da incubadora e leve para o BSC. Descarte a sobreposição de metilcelulose em uma panela de bandeja contendo 10% de alvejante ou desinfetante de amônio quaternário duplo.</li>
	<li>Lave cada poço 2x com PBS, descartando a lavagem em uma panela de bandeja contendo 10% de alvejante ou amônio quaternário duplo.</li>
	<li>Adicione ~1 mL de metanol:acetona (1:1 v:v) e deixe as células fixarem na placa por pelo menos 30 minutos no BSC à temperatura ambiente (RT). Descarte metanol:acetona de acordo com a política institucional sobre resíduos orgânicos.</li>
	<li>Visualize o ZIKV usando um dos dois métodos descritos abaixo.<ol>
<li>Após a remoção do metanol:acetona, colora imediatamente com uma solução violeta cristalina (0,25% w/v em 30% de metanol) por 5 min. Enxágüe 2x na água da torneira e deixe secar, depois visualize diretamente de olho para evidências de placas ou destruição de monocamadas.</li>
		<li>Alternativamente, realize o ensaio de formação de foco.<ol>
<li>Deixe as placas secarem até que não haja restos orgânicos. NOTA: Este deve levar ~2−3 h fora do BSC, mas pode ser acelerado por secagem de ar em um BSC ou capô de fumaça química.</li>
			<li>Lave cada poço 3x por 15 min cada em PBS não ester (Mg2+ e Ca2+ livre) em um roqueiro de placa orbital. Remova o PBS e adicione 1 mL de solução de bloqueio (PBS + 3% FBS) a cada poço e arrase por 15 min no RT.</li>
			<li>Adicione 100 μL por poço de α-ZIKV ou anticorpo primário α-flavivirus (por exemplo, híbridoma do grupo flavivírus D1-4G2-4-15 [4G2]) a uma solução de diluição de 1:2.000 na solução de bloqueio. Incubar com balanço por um mínimo de 4h (preferencialmente durante a noite, não excedendo 18 h) na RT.</li>
			<li>Remova o anticorpo primário e lave 3x por 15 min cada com PBS (Mg2+ e Ca2+ livre) em um roqueiro de placa orbital.</li>
			<li>Adicione 100 μL por poço do anticorpo secundário (cabra α mouse hrp-rotulado) diluído 1:2.000 no buffer de bloqueio. Incubar com balanço por 1h na RT.</li>
			<li>Lave 3x por 15 min cada com PBS (Mg2+ e Ca2+ livre) em um roqueiro de placa orbital.</li>
			<li>Alíquota 100 μL de reagente de desenvolvimento de substrato(Tabela de Materiais) por poço. Placas de rocha na RT por 15 minutos.</li>
			<li>Interrompa a reação após o desenvolvimento de focos/placas removendo o substrato e enxaguando as placas 2x com água da torneira. Despeje a água da torneira e deixe as placas secarem antes de quantificar.</li>
			<li>Conte focos virais para determinar o número de FFU presente na amostra dada.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Administração de farinhas de sangue
<ol><li>Use mosquitos Ae. aegypti 2-4 dias após a eclosão. Classifique mosquitos fêmeas em caixas de papelão 0,5 L com tampas de tela e prive-os de açúcar (geralmente 36-48 h antes da farinha de sangue infecciosa). Forneça água ad libitum através de bolas de algodão saturadas de água.</li>
	<li>Remova as bolas de algodão saturadas de água na manhã em que os mosquitos serão expostos à farinha de sangue infecciosa.</li>
	<li>Anexar reservatórios contendo farinhas de sangue artificiais à unidade de alimentação leva dentro de uma caixa de luvas de plástico transparente.</li>
	<li>Dentro do porta-luvas, coloque uma caixa de papelão 0,5 L com tampa de tela, contendo 50-100 mosquitos Ae. aegypti famintos, sob a unidade de alimentação ligada ao reservatório. NOTA: Mosquitos apropriadamente famintos geralmente se alimentam dentro de 20 minutos. A alimentação pode ser prolongada conforme necessário para aumentar o tamanho da amostra em populações mais lentas, embora isso não deva se estender além de 60 minutos, porque o título viral (ZIKV) pode diminuir dentro do alimentador após ~60 min.</li>
	<li>Após a conclusão da alimentação, remova o reservatório e mergulhe em alvejante recém-feito 10%.</li>
	<li>Mosquitos anestesizem a frio por incubação para 30 s a -20 °C ou por 5 min em uma geladeira.</li>
	<li>Dentro do porta-luvas, despeje os mosquitos em uma placa de Petri no gelo. Conte e classifique as fêmeas engorgadas de mosquitos não engorgados. Descarte os mosquitos não engorgados por imersão em um tubo cônico de tubo de 50 mL cheio de 70% de etanol. Enquanto os mosquitos ainda estão anestesiados, despeje-os de volta na caixa de papelão 0,5 L e cubra rapidamente com a tela e a tampa. Corte a malha de tela em excesso da caixa e fixe a malha com fita.</li>
	<li>Adicione uma bola de algodão saturada com sacarose estéril filtrada 10% aquosa na tela de cada caixa. Coloque todas as caixas de mosquitos em um grande recipiente secundário de plástico com uma esponja úmida para manter a umidade.</li>
	<li>Coloque recipiente secundário contendo caixas de mosquitos em uma incubadora com temperatura de 27 ± 1 °C (ou conforme apropriado para simular condições na região de interesse) com 80% ± 10% de umidade relativa e um ciclo claro de 16:8:escuro). Mantenha os mosquitos com acesso a ad libitum a 10% de sacarose até a conclusão dos experimentos.</li>
</ol>5. Aquisição e processamento de amostras
<ol><li>Nos dias de pós-alimentação especificados, aspire um número predeterminado de mosquitos das caixas apropriadas usando um aspirador mecânico dentro de um porta-luvas. Tampe o tubo de coleta com uma rodada de algodão após a aquisição do número necessário de mosquitos.</li>
	<li>Mosquitos anesthetize frio por incubação por 30 segundos a -20 °C ou por 5 minutos a 4 °C.</li>
	<li>Dentro do porta-luvas, despeje os mosquitos em uma placa de Petri no gelo. Usando dois pares de fórceps, remova todas as seis pernas de cada mosquito e coloque em um tubo de microcentrifusidade de fundo redondo de 2 mL pré-rotulado contendo um rolamento de esfera de aço inoxidável esterilizado (7/32") e 500 μL de mídia de coleta de mosquitos (MCM) composta de DMEM, 2% FBS, 1% penicilina-estreptomicina e 2,5 μg/mL de anfotericina.</li>
	<li>Coloque suavemente o mosquito em uma gota de óleo mineral para contê-lo, tomando cuidado para não permitir qualquer contato entre o óleo e a cabeça do mosquito e proboscis.</li>
	<li>Insira o proboscis do mosquito em uma ponta de pipeta de 10 μL preenchida com 10 μL de FBS inativados pelo calor. NOTA: Alternativamente, a pipeta pode ser preenchida com sacarose, sangue ou óleo mineral. O óleo permite visualização direta de bolhas de saliva através de microscopia leve.</li>
	<li>Deixe o mosquito salivar por 30 minutos. Ejete a ponta de micropipette contendo FBS + saliva em um tubo de microcentrifuuge contendo 100 μL de MCM, em seguida, coloque a carcaça em um tubo de microcentrifuuge fundo redondo separado de 2 mL contendo um rolamento de esfera de aço esterilizado e 500 μL de MCM. Certifique-se de que os tubos utilizados para os corpos, pernas e saliva sejam rotulados para que fique claro que todas as três amostras se originaram do mesmo mosquito.</li>
	<li>Enquanto os mosquitos estão salivando, realize etapas 5.3-5.5 nos mosquitos restantes.</li>
	<li>Transporte os tubos contendo os corpos e pernas para um dispositivo de homogeneização de tecido de moagem de contas contido dentro de um BSC. Triturar todas as amostras de corpo e perna a 26 Hz por 5 minutos para liberar partículas virais para o supernante. Esclareça todas as amostras por centrifugação a 200 x g por 5 min para pelotas de detritos celulares. NOTA: Neste ponto, as amostras podem ser congeladas a -80 °C, ou avaliadas imediatamente.</li>
</ol>6. Detecção de ZIKV por ensaio infeccioso
<ol><li>Em um BSC, prepare 24 placas de cultura de tecido bem com células Vero (105 células por poço) 24 h antes do início do ensaio infeccioso. Rotule cada poço com a identidade de um único mosquito/amostra.</li>
	<li>Se as amostras foram congeladas a -80 °C, deixe descongelar.</li>
	<li>Remova a mídia das placas celulares Vero antes da inoculação com amostras de uma placa de cada vez.</li>
	<li>Para amostras contendo corpos ou pernas, alíquota cuidadosamente de 100 μL de supernanato clarificado em cada poço, tomando cuidado para não perturbar os detritos celulares do mosquito da pelota. NOTA: As amostras de saliva podem ser diluídas 1:1 (v/v) com MCM antes da inoculação nas células para conservar amostras para titulação posterior, se necessário.</li>
	<li>Mova as placas para uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 e incubar por 1h.</li>
	<li>Devolva as placas ao BSC e adicione ~1 mL de sobreposição de metilcelulose a cada poço. Coloque as placas sobrepostas de volta em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 e incubar por 3-7 dias (vírus/dependente de cepas).</li>
	<li>Realize fixação e visualização conforme descrito nas etapas 3.6-3.9.</li>
	<li>Quanto à pontuação através de um ensaio de formação de foco, quantifique os poços positivos por exame sob um microscópio leve. A detecção de coloração intracytoplasmática das células em um poço indica a presença de vírus. As amostras são pontuadas apenas como focus-positive ou -negativo.</li>
</ol>

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<li>Guo, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Feeding+Patterns+of+Mosquitoes+in+a+Rural+Malaria-Endemic+Region+in+Hainan+Island%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Mosquito+Control+Association%22%5BJournal%5D)">Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).</li>
<li>Kuno, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+history+of+laboratory+breeding+of+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29+focusing+on+the+origins+and+use+of+selected+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains.</a> Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).</li>
<li>Mayilsamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+Long+Viability+of+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29+Eggs+Stored+Under+Normal+Room+Condition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition.</a> Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).</li>
<li>Althouse, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+for+Zika+Virus+to+Establish+a+Sylvatic+Transmission+Cycle+in+the+Americas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055(2016).</li>
<li>Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fever+from+the+forest%3A+prospects+for+the+continued+emergence+of+sylvatic+dengue+virus+and+its+impact+on+public+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).</li>
<li>Vasilakis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+ancestral+sylvatic+dengue-2+viruses+to+re-emerge%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge.</a> Virology. 358 (2), 402-412 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os métodos aqui descritos fornecem um fluxo de trabalho generalizado para a realização de análises de competência vetorial. Como estrutura geral, muitas dessas metodologias são conservadas ao longo da literatura. No entanto, há espaço substancial para modificações (revisadas em Azar e Weaver1). Vírus (por exemplo, linhagem viral, armazenamento de vírus de desafio, histórico de passagem viral), entomologia (por exemplo, colonização laboratorial de populações de mosquitos, imunidade inata, microbiom...

A competência vetorial é definida como a capacidade no nível de espécies, população e até mesmo um indivíduo, de um determinado artrópode, como um mosquito, carrapato ou mosca de areia de flebotomina, para adquirir e transmitir um agente biologicamente com replicação ou desenvolvimento no artrópode1,2. Com relação a mosquitos e vírus transmitidos por artrópodes (ou seja, arboviroses), o agente é absorvido de um hospedeiro virêmico por uma fêmea de mosquito. Após a ingestão, o vírus deve infectar produtivamente uma pequena população de células epiteliais midgut3, superando vários obstáculos fisiológicos, como a degradação proteolítica por enzimas digestivas, a presença da microbiota (barreira de infecção midgut, ou MIB), e a matriz peritrofídica secretada. A infecção do epitélio midgut deve ser seguida pela replicação do vírus e eventual fuga do midgut para o sistema circulatório aberto do mosquito, ou hemoglifo, o que representa o aparecimento de uma infecção disseminada superando a barreira de escape midgut (MEB). Neste ponto, o vírus pode estabelecer infecções de tecidos secundários (por exemplo, nervos, músculos e corpos de gordura) e continuar a se replicar, embora essa replicação secundária possa não ser estritamente necessária para que o vírus infecte as células acinares das glândulas salivares (superando a barreira da infecção da glândula salivar). O lagross das células acinares da glândula salivar em suas cavidades apical e, em seguida, o movimento no ducto salivar permite a inoculação do vírus em hospedeiros subsequentes na mordida, e completa o ciclo de transmissão1,2,4,5,6,7.
Dado esse mecanismo bem caracterizado e geralmente conservado de disseminação dentro de um vetor de mosquitos, as avaliações de competência vetorial laboratorial são muitas vezes metodologicamente semelhantes, embora existam diferenças nos protocolos1,2. Geralmente, após a exposição ao vírus oral, os mosquitos são dissecados para que tecidos individuais como o midgut, pernas, ovários ou glândulas salivares possam ser testados para infecção viral, infecção disseminada, infecção disseminada/transmissão transovarial potencial e competência de transmissão disseminada/potencial,respectivamente 8. A mera presença de um vírus nas glândulas salivares, no entanto, não é evidência definitiva da capacidade de transmissão, dada a evidência de uma barreira de fuga/saída da glândula salivar (SGEB) em algumas combinações vetoriais/vírus1,2,4,5,7,9. O método padrão para comprovar a competência de transmissão continua sendo a transmissão do mosquito para um animal suscetível10,11,12. No entanto, dado que para muitas arboviroses isso requer o uso de modelos murinas imunocomprometidos13,14,15,16, este método muitas vezes é proibitivo. Uma alternativa comumente utilizada é a coleta da saliva do mosquito, que pode ser analisada por reação de cadeia transcrição reversa-polimerase (RT-PCR) ou um ensaio infeccioso para demonstrar a presença do genoma viral ou partículas infecciosas, respectivamente. Vale ressaltar que tais métodos de coleta de saliva in vitro podem superestimar12 ou subestimar17 a quantidade de vírus depositado durante a alimentação in vivo, indicando que tais dados devem ser interpretados com cautela. No entanto, o método in vitro é altamente valioso quando analisado na perspectiva da mera presença de vírus na saliva, indicando potencial de transmissão.
Existem duas abordagens importantes para determinar o papel dos vetores de mosquitos em surtos de doenças arbovirais. O primeiro método envolve a vigilância em campo, na qual os mosquitos são coletados no contexto de transmissão ativa18,19,20,21,22,23,24. No entanto, dado que as taxas de infecção são tipicamente bastante baixas (por exemplo, a taxa estimada de infecção de 0,061% de mosquitos em áreas de circulação ativa do vírus Zika (ZIKV) nos Estados Unidos21), a incriminação de espécies vetoriais potenciais pode ser fortemente tendenciosa pela metodologia de captura25,26 e chance aleatória (por exemplo, amostragem de um indivíduo infectado de 1.600 não infectados)2 . Levando isso em conta, um determinado estudo pode não adquirir mosquitos suficientes tanto em números brutos quanto na diversidade de espécies para amostrar com precisão os mosquitos envolvidos na transmissão. Em contrapartida, as análises de competência vetorial são realizadas em ambiente laboratorial, permitindo um controle rigoroso de parâmetros como a dose oral. Embora não sejam totalmente capazes de representar a verdadeira complexidade da infecção por mosquitos e da capacidade de transmissão em um ambiente de campo, essas avaliações laboratoriais permanecem ferramentas poderosas no campo da arbovirologia.
Com base em diversas análises de competência vetorial com ZIKV em diversas espécies de mosquitos, populações e métodos27,28,29,30,31,32, bem como uma revisão recente das avaliações de competência vetorial1,descrevemos aqui vários dos protocolos associados a um típico fluxo de trabalho de competência vetorial. Nestes experimentos, três Ae. populações de aegypti das Américas (cidade de Salvador, Brasil; República Dominicana; e do baixo Vale do Rio Grande, TX, EUA) foram expostas a uma única cepa de ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) a 4, 5 ou 6 log10 unidades de formação focal (FFU)/mL por meio de doses de sangue artificial. Posteriormente, foram analisadas evidências de infecção, infecção disseminada e competência de transmissão após vários momentos de incubação extrínseca (2, 4, 7, 10 e 14 dias) por meio de dissecção e ensaio infeccioso baseado em cultura celular. Embora o fluxo de trabalho/protocolos atual seja otimizado para ZIKV, muitos elementos são diretamente traduzíveis para outras arboviroses transmitidas por mosquitos nos níveis de contenção de artrópodes e biossegurança 2 e 3 (ACL/BSL2 ou ACL/BSL3).

<table><tbody><tr><td>Reservatório Padrão 3mL</td><td>R37P30</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Equipamento Insetário</td></tr><tr><td>7/32" Aço Inoxidável 440 Grau C Bolas</td><td>4RJH9</td><td>Grainger</td><td>Meio de Moagem</td></tr><tr><td>Acetona, Grau Histológico, Fisher Chemicals, Garrafa Poli, 4L, 4/Caixa</td><td>A16-P4</td><td>FisherScientific</td><td>Fixador</td></tr><tr><td>Adenosina 5'-trifospato sal dissódico hydrat, microbiano, BioReagente, adequado para célula cultura</td><td>A6419-1G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Anti-Flavivírus Anticorpo de antígeno de grupo, clone D1-4G2-4-15</td><td>MAB10216</td><td>MilliporeSigma</td><td>Anticorpo primário para ensaio de formação de foco</td></tr><tr><td>Anti-IgG de camundongo (H + L) Anticorpo, soro humano adsorvido e marcado com peroxidase, 1,0 mL / garrafa</td><td>5450-0011</td><td>KPL / Seracare</td><td>Anticorpo secundário para ensaio de formação de foco</td></tr><tr><td>Alvejante</td><td>NC0427256</td><td>Descontaminação FisherScientific</td><td></td></tr><tr><td>Corning, Frascos Tratados para Cultura de Células, 150cm2, Tampa Ventilada, Caixa de 50</td><td>10-126-34</td><td>FisherScientific</td><td>Placas</td></tr> de Cultura de Células Costar consumíveis para cultura de células<tr><td>, 24 poços, 5/saco, 100/caixa, Corning</td><td>07-200-740</td><td>FisherScientific</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Cultura de Células Costar consumíveis para cultura de células, 96 poços, 5/saco, 100/caixa, Corning</td><td>07-200-91</td><td>FisherScientific</td><td>Consumível de cultura de células</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>C0775-100G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Stain</td></tr><tr><td>Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubos, 500/Caixa</td><td>05-402-7</td><td>FisherScientific</td><td>Plástico consumível</td></tr><tr><td>Falcon 15mL Tubos Cônicos Centrigue</td><td>14-959-70C</td><td>FisherScientific</td><td>Plástico consumível</td></tr><tr><td>Falcon 50mL Tubos Cônicos Centrigue</td><td>14-959-49A</td><td>Pipetas</td><td></td></tr><tr><td>sorológicas de poliestireno descartáveis FisherScientific Scientific consumíveis de plástico Falcon 10mL, 200/Case</td><td>13-675-20</td><td>Pipetas</td><td></td></tr><tr><td>sorológicas de poliestireno descartáveis FisherScientific Scientific consumíveis de plástico Falcon 1mL, 1000/Case</td><td>13-675-15B</td><td>Pipetas</td><td></td></tr><tr><td>sorológicas de poliestireno descartáveis Falcon consumíveis de plástico FisherScientific 25mL, 200/Case</td><td>13-675-30</td><td>Pipetas</td><td></td></tr><tr><td>sorológicas de poliestireno descartáveis FisherScientific Plastic consumíveis Falcon 5mL, 200/Case</td><td>13-675-22</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumível</td></tr><tr><td>Falcon Standard Tissue Culture Plates</td><td>08-772B</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumível</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL</td><td>S11150</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>Reagente</td></tr> <tr><td>de cultura de célulasLâminas de Microscópio de Vidro Simples Econômico Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td>FisherScientific</td><td>Imobilização de Mosquitos</td></tr><tr><td>FU1 Alimentador</td><td>FU1-0</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Equipamento Insetário; unidades de alimentação</td></tr><tr><td>Gibco DPBS com Cálcio e Magnésio, 10 x Garrafas de 500mL</td><td>140-040-182</td><td>Reagente de cultura de células</td><td>FisherScientific</td></tr><tr><td>Gibco Fungizone, Anfotericina B, 250&mu; g/mL, 50mL/Frasco</td><td>15-290-026</td><td>Reagente de cultura de células</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Gibco Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL), 100mL/Frasco, 20 Frascos/Caixa</td><td>15-140-163</td><td>Reagente de cultura de células</td><td>FisherScientific</td></tr><tr><td>Gibco, Tripsina-EDTA (25%), vermelho de fenol, 20 frascos de 100mL</td><td>25-200-114</td><td>Reagente de cultura de células</td><td>FisherScientific</td></tr><tr><td>Gibcom DMEM, alto teor de glicose, 10 frascos</td> <td>de 500mL11-965-118</td><td>Reagente de cultura de células</td><td>FisherScientific</td></tr><tr><td>Sangue humano, gênero não especificado, Na-Citrate, 1 Unidade</td><td>7203706</td><td>Lampire</td><td>Preparação de farinha de sangue</td></tr><tr><td>Aspirador InsectaVac</td><td>2809B</td><td>Bioquip</td><td>Equipamento Insetário</td></tr><tr><td>Metanol, Certificado ACS, Fisher Chemicals, Frasco de Vidro Âmbar, 4L, 4/Caixa</td><td>A412-4</td><td>Fixador</td><td></td></tr> <tr><td>FisherScientificMetilcelulose, viscosidade: 3.500-5.600 cP, 2% em água (20 &deg; C), 250g / Garrafa</td><td>M0512-250G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Reagente de cultura de células</td></tr><tr><td>Micro-chem Plus Detergente Desinfetante</td><td>C849T34</td><td>Thomas Descontaminação Científica</td><td>; diluição de trabalho de óleo mineral de amônio quaternário duplo</td></tr><tr><td>, BioReagente, para biologia molecular</td><td>M5904-5X5ML</td><td>MilliporeSigma</td><td>Imobilização de mosquitos</td></tr><tr><td>O-rings</td><td>OR37-25</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Equipamento de Insetário</td></tr><tr><td>Plugues de Plástico</td><td>PP5-250</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Equipamento de Insetário</td></tr><tr><td>PS6 Unidade de Energia (110-120V)</td><td>PS6120</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Equipamento de Inseto; fonte de energia</td></tr><tr><td>Pinça Rubis, lâminas deslocadas, pontas superfinas</td><td>4525</td><td>Bioquip</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>Sarstedt Inc, Microtubo de Tampa de Rosca de 2mL, Fundo Cônico, Tampa de O-ring, Estéril, 1000/Caixa</td><td>50-809-242</td><td>FisherScientific</td><td>Plástico consumível</td></tr><tr><td>Sacarose, BioUltra, para biologia molecular</td><td>84097-250G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000&mu; L Ponteiras de Pipeta, 100 pontas/Rack, 8 Racks/Pacote, 4 Pacotes/Caixa</td><td>21-402-487</td><td>Consumível de plástico</td><td>FisherScientific</td></tr><tr><td>ThermoScientific, Barreira ART Baixa Retenção 200&mu; L Ponteiras de Pipeta, 96 pontas/Rack, 10 Racks/Pacote, 5 Pacotes/Caixa</td><td>21-402-486</td><td>FisherScientific</td><td>Consumível de plástico</td></tr><tr><td>ThermoScientific, Barreira ART de Baixa Retenção 20&mu; L Ponteiras de Pipeta, 96 pontas/Rack, 10 Racks/Pacote, 5 Pacotes/Caixa</td><td>21-402-484</td><td>Consumível de plástico</td><td>FisherScientific</td></tr><tr><td>ThermoScientific, Barreira ART de Baixa Retenção, Alcance Estendido 10&mu; L Ponteiras de pipeta, 96 ponteiras/rack, 10 racks/pacote, 5 pacotes/caixa</td><td>21-402-482</td><td>FisherScientific</td><td>PlasticLyser</td></tr><tr><td>II</td><td>85300</td><td>QIAGEN</td><td>Homogenization</td></tr><tr><td>TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL</td><td>5510-0030</td><td>Seracare</td><td>Solução de desenvolvimento para ensaio de formação de foco</td></tr><tr><td>Vero</td><td>CCL-81</td><td>American Type Culture Collection</td><td>Linhagem celular de mamíferos para amplificar vírus e realizar ensaio infeccioso</td></tr><tr><td>Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6]</td><td>CRL-1586</td><td>Coleção de Cultura de Tipo Americano</td><td>Linha celular de mamíferos para amplificar vírus e realizar ensaio infeccioso</td></tr></tbody></table>

análises de competência vetorial sobre mosquitos aedes aegypti que usam zika vírus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Os procedimentos apresentados descrevem uma metodologia generalizada para infectar mosquitos Aedes aegypti com zika vírus em condições laboratoriais para determinar a taxa de infecção, infecção disseminada e potencial transmissão do vírus na população do mosquito em questão. Esses procedimentos são amplamente utilizados com várias modificações nas avaliações de competência vetorial globalmente. São importantes na determinação do papel potencial que um determinado mosquito (ou seja, espécie, população, indivíduo) pode desempenhar na transmissão de um determinado agente.

Três populações de Ae. aegypti das Américas (Salvador, Brasil; República Dominicana; e o Vale do Rio Grande, TX, EUA) foram expostos a um surto de ZIKV das Américas (ZIKV Mex 1-7, Estado de Chiapas, México, 2015) sobre uma gama de de farinha de sangue (4, 5 e 6 log10 FFU/mL) apresentados em um eritrócito humano lavado. Nos dias 2, 4, 7, 10 e 14 pós-infecção, subconjuntos de mosquitos foram processados para determinar as taxas de infecção, disseminação e potencial de transmissão.
<p class="jove_con...

O protocolo apresentado pode determinar a competência vetorial das populações do mosquito Aedes aegypti para um determinado vírus, como o Zika, em um ambiente de contenção.

Análises de competência vetorial sobre mosquitos Aedes aegypti que usam zika vírus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Em surtos mediados por arbovírus, as contramedidas são amplamente limitadas ao controle de mosquitos. Assim, as análises de competência vetorial são estratégias preventivas essenciais, pois determinam quais populações e espécies de mosquitos podem atuar como vetores para um determinado arbovírus e, portanto, devem ser alvo de intervenção. Por isso, um dos componentes mais importantes em nossa caixa de ferramentas para avaliar o papel de mosquitos e de outros vetores na transmissão de doenças infecciosas são os estudos de competência vetorial. Esses são experimentos nos quais podemos controlar com grande precisão não apenas a espécie de mosquito ou de carrapato, por exemplo, mas também cepas geográficas, bem como cepas muito específicas de diferentes vírus ou outros organismos infecciosos, obtendo dados extremamente precisos e bem controlados sobre o risco de diferentes espécies na transmissão de diferentes agentes em regiões muito específicas do mundo. Trabalhar com mosquitos infectados exige instalações dedicadas, treinamento, experiência e planejamento cuidadoso para minimizar os riscos ao pesquisador, bem como o risco de escape de um mosquito infectado. É, portanto, muito importante que novos integrantes dessas instalações dediquem tempo a trabalhar com mosquitos alimentados com sangue não infectado, a fim de se familiarizarem com as técnicas e o fluxo de trabalho.No dia da exposição, ligue a fonte de energia em uma instalação de contenção de artrópodes para pré-aquecer as unidades de alimentação. Combine sangue humano recém-colhido com citrato ou heparinizado com um estoque viral na proporção de um para um em volume, e recubra uma unidade padrão de reservatório de três mililitros com a pele de um camundongo ingênuo não infectado. Coloque o reservatório coberto sobre papel toalha branco e adicione cerca de dois mililitros de sangue infeccioso ao reservatório, um mililitro por vez.Em seguida, verifique com toalhas de papel para confirmar que não há vazamento. 24 horas antes de realizar o ensaio infeccioso, prepare placas de cultura celular de 24 poços com células Vero e rotule cada poço com a identidade do mosquito e a amostra. Na manhã em que os mosquitos serão expostos à refeição sanguínea infecciosa, remova as bolas de algodão saturadas com água e fixe reservatórios com as refeições sanguíneas artificiais aos terminais da unidade de alimentação usando uma caixa de contenção de plástico transparente com luvas.Coloque a caixa de papelão com os mosquitos famintos dentro da caixa de luvas sob a unidade de alimentação. Após a conclusão da alimentação, remova o reservatório e mergulhe-o em água sanitária recém-preparada a 10%. Dentro da caixa de luvas, despeje os mosquitos anestesiados a frio em uma placa de Petri sobre gelo e separe os mosquitos saciados dos não saciados.Despeje os mosquitos ingurgitados de volta na caixa de papelão, tampando-a rapidamente com uma tela e tampa. Apare a tela em excesso ao redor da caixa e fixe a tampa com fita adesiva. Adicione uma bola de algodão saturada com sacarose estéril filtrada a 10% na tela e coloque a caixa em um recipiente plástico secundário maior, com uma esponja úmida para manter a umidade.Incube o recipiente secundário a 27 graus Celsius, permitindo que os mosquitos tenham acesso ad libitum à sacarose até a conclusão dos experimentos. Utilize um aspirador mecânico para obter um número predeterminado de mosquitos incubados da caixa, tampando o tubo de coleta com uma bola de algodão ao finalizar. Trabalhando dentro da câmara de luvas, despeje os mosquitos anestesiados com frio em uma placa de Petri sobre gelo.Remova as seis pernas de cada mosquito e coloque-as em um tubo microcentrífugo de dois mililitros previamente rotulado, contendo uma esfera de aço inoxidável esterilizada e 500 microlitros de meio de coleta de mosquitos, ou MCM. Coloque suavemente o mosquito sobre uma gota de óleo mineral, tomando cuidado para que o óleo não entre em contato com a cabeça ou o probóscide do mosquito. Insira o probóscide em uma ponteira de micropipeta preenchida com 10 microlitros de soro bovino fetal inativado pelo calor e deixe o mosquito salivar por 30 minutos.Ejete a ponteira da pipeta com a saliva em um tubo de microcentrífuga contendo 100 microlitros de MCM e coloque a carcaça em um tubo separado de dois milímetros com a esfera de aço esterilizada e 500 microlitros de MCM. Transporte os tubos para um dispositivo de homogeneização por esferas dentro de uma cabine de segurança biológica e triture todas as amostras de corpo e patas a 26 hertz por cinco minutos para liberar as partículas virais no sobrenadante. Clarifique todas as amostras por centrifugação a 200 vezes g por cinco minutos para sedimentar os detritos celulares.Imediatamente antes da inoculação com as amostras, remova o meio dos cultivos de células Vero previamente preparados. Aliquote cuidadosamente 100 microlitros dos sobrenadantes clarificados dos corpos ou pernas em cada poço, tomando cuidado para não perturbar os detritos celulares de mosquito do pellet. Em seguida, incube as placas por uma hora.Após a incubação, adicione um mililitro de cobertura de metilcelulose a cada poço e coloque as placas novamente na incubadora por três a sete dias. Retire as placas de cobertura da incubadora e leve-as para uma cabine de segurança biológica. Descarte a cobertura de metilcelulose em uma bandeja contendo água sanitária a 10% e lave cada poço duas vezes com PBS, descartando cada lavagem na bandeja.Remova o PBS e adicione um mililitro de metanol-acetona por poço, deixando as células fixarem na placa por 30 minutos. Em seguida, descarte o fixador e deixe as placas secarem. Lave cada poço três vezes com PBS não estéril em um agitador orbital para placas durante 15 minutos por lavagem, depois adicione um mililitro de solução bloqueadora a cada poço e agite a placa por mais 15 minutos.Adicione 100 microlitros de anticorpo primário anti-Vírus Zika ou anti-flavivírus a cada poço e incube a placa com agitação durante a noite. No dia seguinte, remova o anticorpo primário e repita as lavagens com PBS. Após a última lavagem, adicione 100 microlitros de anticorpos secundários e incube a placa sob agitação por uma hora.Repita as lavagens com PBS, então adicione 100 microlitros de reagente de desenvolvimento do substrato por poço e agite a placa durante 15 minutos. Quando os focos ou placas se desenvolverem, interrompa a reação lavando a placa com água da torneira. Descarte a água da torneira e deixe as placas secarem ao ar, então quantifique os focos virais para determinar o número de unidades formadoras de foco presentes na amostra fornecida.Três populações de mosquitos foram expostas a uma cepa epidêmica do vírus Zika em uma faixa de títulos no sangue ingerido. Nas duas semanas seguintes, subconjuntos de mosquitos foram analisados para determinar a infecção, disseminação e taxa potencial de transmissão. Nos títulos mais baixos no sangue ingerido, os mosquitos de Salvador, Brasil, estavam infectados após 4, 10 e 14 dias de incubação extrínseca, sem evidência de infecção disseminada observada nas patas analisadas.No título mais alto, o vírus foi detectado nas pernas dos mosquitos, mas não na saliva. Os mosquitos da República Dominicana mostraram-se os mais suscetíveis à infecção e os mais competentes para transmissão em todos os títulos testados da refeição sanguínea. Mosquitos alimentados com as três doses demonstraram disseminação em sete dias e competência para transmissão em 14 dias após a infecção.Mosquitos do Vale do Rio Grande, no Texas, expostos a títulos mais baixos de refeição sanguínea, foram infectados já a partir de quatro dias pós-infecção, enquanto infecções disseminadas foram detectadas após 14 dias. No grupo exposto ao título mais alto, a infecção foi observada a partir do segundo dia pós-infecção, atingindo picos aos 4, 10 e 14 dias. Infecções disseminadas foram observadas no sétimo dia, e apenas um único mosquito apresentou capacidade de transmissão no décimo dia.Ao tentar este protocolo, é importante trabalhar com segurança, em vez de rapidez. Portanto, sempre manipule mosquitos infectados ou potencialmente infectados dentro de uma caixa de luvas ou de uma cabine de segurança biológica, até que tenham tido as pernas ou as asas removidas. O fluxo de trabalho básico de competência vetorial pode ser adaptado para produzir mosquitos infectados para análises posteriores, como estudos de transmissão, bem como para examinar as interações entre mosquitos, o vírus e o microbioma.A competência vetorial tem sido uma ferramenta realmente importante para compreender o papel dos mosquitos na transmissão de vírus durante epidemias de doenças virais, e isso é válido há muitas décadas. No entanto, também é um método que evoluiu ao longo dos anos para incluir novas informações, à medida que as descobrimos, sobre as interações entre esses vírus e os vetores mosquitos. Apenas a título de dois exemplos, a população genética do vírus, a complexidade da população dentro do mosquito revela-se muito importante para sua capacidade de transmissão, e agora podemos incluir isso em estudos de competência vetorial com novos métodos de sequenciamento da população viral.Também sabemos agora que a população de bactérias e outros organismos que vivem no trato gastrointestinal do mosquito pode ter um impacto significativo em sua capacidade de transmissão, e agora podemos avaliar essa população com novos métodos de sequenciamento. Assim, a competência vetorial é um método que evoluiu e continua evoluindo à medida que aprendemos mais sobre essas interações complexas.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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Salvamento e Caracterização do Vírus Recombinante de um Clone Infeccioso do Vírus do Novo Mundo Zika

Os mosquitos Aedes aegypti infectados com Wolbachia estão sendo liberados em populações naturais para suprimir a transmissão de arbovírus. Descrevemos métodos para traseira Ae. aegypti com Wolbachia infecções no laboratório para experiências e lançamento de campo, tomando as precauções para minimizar a seleção e adaptação de laboratório.

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Corrente multiplexado diagnósticos para detectar Zika, chikungunya, vírus da dengue exigem a preparação de amostras complexas e instrumentação cara e são difíceis de usar em ambientes de recursos baixos. Mostramos um diagnóstico que utiliza amplificação isotérmica com sondas displaceable vertente destino específico para detectar e diferenciar estes vírus com alta sensibilidade e especificidade.

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Controlo eficaz de transmissão do vírus a cargo de mosquito, o conhecimento do potencial vetor de respectivos mosquitos é de particular interesse. Descrevemos a salivação forçada como um método para analisar a competência vetorial do Aedes albopictus e três táxons de Culex diferentes para a transmissão de vírus Zika.

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Nós descrevemos um método para avaliar o efeito da imunidade pré-existente contra vírus da dengue sobre a infecção pelo vírus Zika usando soro humano, células humanas primárias e quantificação de infecção por reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa.

Quantificação de realce dependente de anticorpo do vírus nas células humanas primárias Zika

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Técnicas de microinjeção de embriões para mutagênese específica do local eficiente em Culex quinquefasciatus

Um protocolo para cultivar o parasita microsporíduo Edhazardia aedis. O parasita é passagem de uma geração de mosquitos Aedes aegypti para a próxima via transferência horizontal na fase larval seguida de transmissão vertical na fase adulta. Os sporoplasmos vivos sobrevivem a longo prazo em ovos infectados.

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Essa metodologia, que incluiu alimentação por via oral e infecção por injeção intratorácica, foi capaz de avaliar efetivamente a influência das barreiras do intestino médio e/ou glândulas salivares na infecção por arbovírus.

Infecção viral experimental em mosquitos adultos por alimentação oral e microinjeção

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Eletropenetrografia AC-DC para o Estudo dos Comportamentos de Sondagem e Ingestão de Mosquitos Culex tarsalis em Mãos Humanas

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Um Ensaio Bioluminescência Cálcio de análise funcional do Mosquito ( Aedes aegypti) E Tick ( Rhipicephalus microplus) G receptores acoplados à proteína

Aprenda a realizar análises de competência vetorial em Aedes aegypti para avaliar a transmissão do vírus Zika. Este método permite identificar populações de mosquitos vetores e orientar estratégias de controle de doenças arbovirais.

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