Uma abordagem benchtop para a abertura da barreira cerebral de sangue específica do local usando ultrassom focado em um modelo de rato

Ultrassom focado com agentes de microbolhas pode abrir a barreira cerebral sanguínea de forma focal e transitória. Esta técnica tem sido usada para fornecer uma ampla gama de agentes através da barreira cerebral do sangue. Este artigo fornece um protocolo detalhado para a entrega localizada ao cérebro de roedores com ou sem orientação de ressonância magnética.

O ultrassom focalizado em combinação com microbolhas circulantes pode ser usado para fornecer aberturas temporárias de tamanho milimétrico na barreira hematoencefálica. Isso permite a entrega não invasiva de agentes circulantes sistemicamente para atingir regiões cerebrais. Para começar, encha o tampão do cateter com soro fisiológico e aqueça a cauda do rato com uma lâmpada, tomando cuidado para não superaquecer o animal.

Insira um cateter de veia da cauda de calibre 24 que será usado para fornecer microbolhas, corante azul de Evans, contraste de ressonância magnética de gadobutrol se estiver usando ressonância magnética e o agente experimental de interesse. O sangue encherá a bainha quando a veia for atingida. Lentamente, remova a agulha interna enquanto empurra a bainha ainda mais para dentro da veia.

Aparafuse o plugue do cateter na extremidade da porta do cateter, assim que a porta estiver cheia de sangue. Enrole cuidadosamente a fita adesiva ao redor do cateter e da cauda para mantê-lo no lugar, começando com um pequeno pedaço na parte superior e trabalhando na direção caudal. Deixe a extremidade do plugue do cateter exposta.

Conecte a linha de anestesia no conector de anestesia na estrutura estereotáxica. Em seguida, fixe a cabeça do animal na armação, colocando a boca na barra de mordida e guiando as barras auriculares em ambos os canais auditivos e apertando os parafusos de fixação. Mova o animal para a cama de ressonância magnética.

Usando parâmetros descritos no manuscrito do texto, colete imagens ponderadas em T2 coronal e axial que capturam todo o cérebro, bem como a ressonância magnética fiducial para medições de coordenadas. Nas imagens coronais, encontre a imagem em que o fiducial é o maior, indicando o centro do fiducial. Registre a distância do topo da região fiducial à região cerebral de interesse em milímetros, tanto na direção médio-lateral quanto na direção dorsal-ventral.

Nas imagens axiais, encontre a imagem que mostra o topo do fiducial e registre as coordenadas X e Y para o centro do fiducial e as coordenadas X e Y da região do cérebro de interesse. Calcule a distância do centro da região fiducial ao cérebro alvo nas direções rostral-caudal e médio-lateral. Depois de reunir as coordenadas, colete as imagens de pré-digitalização.

Mantendo o animal neste quadro estereotáxico, transporte-o rapidamente do leito de ressonância magnética para a configuração do FUS de bancada. Certifique-se de que o animal permaneça dormindo sob o efeito da anestesia. Deslize a moldura no suporte da moldura e encaixe-a firmemente no lugar.

Use uma tesoura para raspar a cabeça do animal, depois escove o excesso de pelos e aplique creme removedor de pelos no couro cabeludo. Deixe descansar por três minutos e limpe-o com água e gaze. Se estiver usando orientação por ressonância magnética, conecte o ponteiro e mova-o para o local do fiducial de ressonância magnética.

Posicione o ponteiro no topo e no centro da ressonância magnética fiducial, que é o ponto a partir do qual todas as distâncias na imagem de ressonância magnética foram calculadas. Remova o ponteiro e mova o posicionador para as coordenadas médio-lateral e as coordenadas rostral-caudais. Lamba o botão de posição nula e levante o posicionador pressionando o botão para cima 50, para permitir a colocação do banho-maria e do gel de ultrassom.

Aplique o gel de ultrassom no couro cabeludo do animal e coloque o banho-maria sobre o animal, com a janela da fita de poliimida pressionada sobre o gel, certificando-se de que não haja bolhas de ar no gel. Encha o banho-maria com água desgaseificada. Se estiver usando o transdutor de alta potência, abaixe o posicionador para que o ímã fique logo acima da água.

Conecte o transdutor ao posicionador abaixando cuidadosamente o transdutor na água em um ângulo e conectando os ímãs. Abaixe o posicionador até a coordenada dorsal-ventral e ligue o amplificador de potência de RF. Injete um mililitro por quilograma de corante azul 3%Evans enfiando a ponta de uma agulha no plugue do cateter e injetando.

Todo o animal deve ficar azul em segundos, indicando que o cateter está posicionado corretamente na veia da cauda. Deixe o corante circular por cinco minutos e, em seguida, ative as microbolhas agitando-as violentamente com o agitador de bolhas. Inverta esta seringa várias vezes para obter uma distribuição uniforme de microbolhas e, em seguida, coloque e encha o conjunto de infusão com asas.

Posicione a seringa na bomba de infusão e ajuste a bomba de infusão para fornecer 0.2 mililitros a uma taxa de seis mililitros por hora, proporcionando infusão lenta das microbolhas durante os dois minutos de exposição ao FUS. Insira a agulha alada no plugue do cateter. Primeiro execute a bomba de infusão, aguarde três segundos e, em seguida, inicie o tratamento FUS pressionando o botão liga e no gerador de funções.

Repita isso duas vezes por região com cinco minutos entre elas para permitir que as microbolhas desapareçam. Pressione novamente o botão de ligar no gerador de funções para interromper o tratamento FUS quando a bomba de infusão parar em dois minutos. Aguarde cinco minutos para que as microbolhas desapareçam, depois inicie a infusão e o segundo tratamento FUS.

Imediatamente após o segundo tratamento com FUS, injete contraste de gadobutrol e o agente de interesse. O volume total entregue de todos os agentes não deve exceder cinco mililitros por quilograma. Para confirmar a abertura da BHE, coloque o animal de volta na cama de ressonância magnética exatamente no mesmo local e conecte a linha de anestesia.

Colete pós-exames de ressonância magnética com os mesmos parâmetros de imagem das imagens pré-exame para confirmar o realce da ressonância magnética do gadobutrol na região da abertura do BBB. Este protocolo foi usado para induzir a abertura localizada da barreira hematoencefálica com o transdutor de imersão de baixa potência e o transdutor de ultrassom focalizado de alta potência. Primeiro, o transdutor de imersão de baixa potência foi direcionado para o hemisfério cerebral anterior ou medial.

Os animais foram sacrificados com ou sem perfusão, e a abertura da BHE foi visualizada via autofluorescência do corante azul de Evans. Em experimentos posteriores, o transdutor FUS foi direcionado para o hipocampo ou para o córtex cingulado anterior. Além do corante azul de Evans, o agente de contraste de ressonância magnética gadobutrol foi usado para verificar a abertura direcionada da BHE em VIVO.

Depois que os animais foram sacrificados, a autofluorescência do corante azul de Evans confirmou o local de abertura. Para avaliar se essa técnica poderia ser usada para entrega de genes direcionados, AAV nove expressando proteína fluorescente verde e contraste de gadobutrol foram injetados imediatamente após a abertura da barreira hematoencefálica no hipocampo. O animal foi fotografado para verificar a abertura com contraste de gadobutrol.

Em seguida, a entrega do gene foi confirmada pela expressão de GFP. Este protocolo oferece uma abordagem de bancada para a abertura da barreira hematoencefálica mediada por ultrassom de foco guiada por ressonância magnética, que pode ser facilmente adaptada por outros laboratórios para fornecer uma alternativa translacional não invasiva à cirurgia estereotáxica.