Name: Reconstrução de assinaturas de fluorescência inata de células únicas por microscopia confocal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Aprenda a extrair assinaturas de fluorescência inata de células únicas por microscopia confocal multicanal. Este método não invasivo permite analisar bactérias, fungos, leveduras e células vegetais e animais em resolução individual.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudo foi apoiado em parte por uma subvenção em auxílio para pesquisas científicas do Ministério da Educação, Cultura, Esportes e Tecnologia do Japão (18K04843) para Y. Yawata, o JST ERATO (JPMJER1502) para N. Nomura.

1. Preparação da amostra
<ol><li>Coloque uma junta de silicone de 1 mm de espessura com poços em uma lâmina de vidro.</li>
	<li>Coloque uma laje de 1 mm de espessura de 0,8% (w/v) no poço da junta de silicone.</li>
	<li>Diluir a densidade celular de uma cultura celular microbiana arbitrária para uma densidade óptica a 600 nm (OD660) = 1,0.</li>
	<li>Coloque uma alíquota de 5 μL de suspensão celular na laje agarose.</li>
	<li>Cubra delicadamente com uma mancha de vidro.</li>
</ol>2. Configuração de um microscópio
NOTA: A técnica CRIF combina microscopia de reflexão conocal (CRM) e microspectroscopia confocal multicanal. O CRM serve como fonte de informação para morfologia celular e localização espacial, que é independente da fluorescência inata celular. A microespectroscopia confocal multicanal fornece as informações espectrais da fluorescência inata celular. No protocolo a seguir, qualquer imagem adquirida com crm ou microspectroscopia de fluorescência conocal é referida como uma imagem DE CRM ou imagem microspectroscópcional multicanal, respectivamente.
<ol><li>Conecte um microscópio confocal com canais espectrais descanned a um tubo fotomultiplier (PMT) ou detector GaAsP. NOTA: Estas configurações estão disponíveis em vários fabricantes.</li>
	<li>Equipar o microscópio com um objetivo de alta abertura numérica (NA) com ampliação adequada. NOTA: Recomenda-se um objetivo de 63x com na &gt; 1,4 para análise de células bacterianas.</li>
	<li>Equipar o microscópio com um espelho de meio reflexo (por exemplo, NT 80/20) para acomodar o CRM, que conta com a dispersão celular da luz incidente para visualizar a morfologia celular.</li>
	<li>Para microespectroscopia confocrática multicanal, equipar o microscópio com espelhos dicroicos. Por exemplo, use os divisores de feixe MBS InVis405, MBS458, MBS458/514, MBS488/543 ou MBS 488/543/633 para 405, 458, 488, 514, 543 ou 633 nm de excitação, respectivamente.</li>
	<li>Ajuste a intensidade de iluminação para cada comprimento de onda de excitação usando um medidor de alimentação laser. Mantenha a saída sob o microscópio constante através de comprimentos de onda de excitação (por exemplo, use 50 μW com o objetivo de 63x).</li>
</ol>3. Aquisição de imagens
<ol><li>Ajuste o tamanho do pinhole para 1 UA usando o software de microscópio.</li>
	<li>Defina o tempo de habitante do pixel (ou seja, velocidade de varredura) para cada comprimento de onda de excitação. NOTA: Um tempo de sono de pixels excessivamente longo pode danificar as células. Evite o tempo de consumo excessivamente longo de pixels para minimizar a fotodamagem para as células. Para amostras bacterianas, um tempo de moradia de pixel &lt; 55,6 μs/μm2 (quando a saída de irradiação sob o microscópio é ~17 μW/cm2) é geralmente adequado para evitar a inibição do crescimento. Este parâmetro pode variar dependendo dos organismos e configurações experimentais.</li>
	<li>Defina a resolução de digitalização. Para células pequenas, como bactérias, use uma área de varredura de 1.024 x 1.024.</li>
	<li>Defina a faixa de varredura Z para que a região de interesse seja coberta. NOTA: Para amostras de células bacterianas e leveduras distribuídas em uma laje de agarose, uma faixa de varredura Z de ~15 μm é geralmente suficiente.</li>
	<li>Defina o detector descaned para capturar a faixa de comprimento de onda visível (por exemplo, 416-691 nm). Use uma janela espectral de 8-10 nm.</li>
	<li>Adquira imagens de microspectroscopia confocrática multicanal em uma sequência de comprimentos de onda de excitação mais longos e mais curtos para criar pilhas de Z de imagens de fluorescência.</li>
	<li>Adquira imagens de CRM.</li>
	<li>Salve as imagens adquiridas como arquivos de tiff de 16 bits em um diretório. Nomeie os arquivos usando a convenção de nomeação XXXcYYzZZ.tif, onde XXX é o comprimento de onda de excitação, YY é o número do canal do detector, ZZ é o número de fatia Z e "c" e "z" são prefixos para o número do detector e o número da fatia Z, respectivamente.<ol>
<li>Por exemplo, se uma imagem de microespectroscopia confocal multicanal for tirada com um comprimento de onda de excitação de 405 nm, 1º canal detector da matriz do detector, e for a 5ª fatia da pilha Z, nomeie-a como "405c01z05.tif". Para imagens de CRM, use a string "CRM" no lugar de XXX (por exemplo, "CRMc01z05.tif"). NOTA: Decida se a segmentação 2D ou 3D é mais adequada para os dados de imagem. Use um método de segmentação 2D em situações em que pequenas células são restritas a um plano 2D (por exemplo, população bacteriana aderindo a uma superfície de vidro). Use o método de segmentação 3D em situações em que a população celular é distribuída em um espaço tridimensional (por exemplo, biofilmes e amostras de tecido) ou os tamanhos celulares são maiores que a espessura da fatia óptica (por exemplo, células de levedura, células de mamíferos). Para segmentação 2D consulte a seção 4; para segmentação 3D, consulte a seção 5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Análise de imagem 2D
<ol><li>Equipar uma estação de trabalho com software de análise de imagem (por exemplo, MATLAB).</li>
	<li>Realizar segmentação celular e reconstrução de assinaturas de fluorescência inata de células únicas.<ol>
<li>Abra o software de análise de imagens.</li>
		<li>Clique duas vezes e abra um dos scripts fornecidos "Script2D.m".</li>
		<li>Vá para a guia Editor e clique em Executar. Uma janela de seleção de pastas deve aparecer.</li>
		<li>Selecione o diretório criado na etapa 3.8 e clique em Abrir para prosseguir. Uma caixa de diálogo que solicita a entrada do parâmetro de segmentação aparecerá automaticamente. NOTA: Para fins de teste selecione o conjunto de dados fornecido ("Sample_2D"). O conjunto de dados da amostra é fornecido como um arquivo comprimido e deve ser extraído com antecedência.</li>
		<li>Insira os parâmetros de segmentação: Limiar de binarização de imagem (0−1) para binarização de imagem = 0,45, Limiar Superior para Uma Região celular (em pixels) = 200, Limiar Inferior para uma Região celular (em pixels) = 10, e O Número de Detectores = 32. Clique em OK para prosseguir. NOTA: Esses parâmetros podem exigir ajuste dependendo da qualidade da imagem.</li>
		<li>Uma nova janela de imagem apresentando uma imagem de CRM deve aparecer. Selecione uma região de fundo arbitrária (ou seja, área onde as células estão ausentes) para usar para subtração de fundo. Desenhe um retângulo dentro da imagem CRM por arrastar o mouse. Clique duas vezes na região selecionada para confirmar a seleção.</li>
		<li>Encontre um novo diretório chamado Signature no mesmo diretório selecionado na etapa 4.2.4. NOTA: O código fornecido cria automaticamente este diretório. O diretório "Signature" armazena a assinatura de fluorescência inata de cada célula microbiana dentro de uma população, à medida que .png arquivos que são numerados em série após um prefixo comum "Signature".</li>
	</ol>
</li>
</ol>Análise de imagem .3D 5
<ol><li>Equipar uma estação de trabalho com o software de análise de imagens (Tabela de Materiais).</li>
	<li>Realizar segmentação celular e reconstrução de assinaturas de fluorescência inata de células únicas.<ol>
<li>Abra o software de análise de imagens.</li>
		<li>Clique duas vezes e abra o script fornecido "Script3D.m".</li>
		<li>Vá para a guia Editor e clique em Executar. Uma janela de seleção de pastas deve aparecer.</li>
		<li>Selecione o diretório criado na etapa 3.8 e clique em Abrir para prosseguir. Uma caixa de diálogo que solicita a entrada dos parâmetros de segmentação aparecerá automaticamente. NOTA: Para fins de teste, selecione o conjunto de dados fornecido ("Sample_3D"). O conjunto de dados da amostra é fornecido como um arquivo comprimido e deve ser extraído com antecedência.</li>
		<li>Insira os parâmetros de segmentação: Limiar de binarização de imagem (0-1) para binarização de imagem = 0,01, Limiar superior para um volume de célula (em pixels) = 1.000, Limiar inferior para uma região celular (em pixels) = 20, X Tamanho do Pixel [μm/pixel] = 0,26, Y Pixel Size [μm/pixel] = 0,26, tamanho do pixel Z [μm/pixel] = 0,42, e O Número de Detectores = 32. Clique em OK para prosseguir; uma caixa de diálogo que solicita a entrada para o número de comprimentos de onda de excitação aparecerá. NOTA: Esses parâmetros podem exigir ajuste dependendo da qualidade da imagem.</li>
		<li>Insira o número de comprimentos de onda utilizados para aquisição de imagens (por exemplo, se 405, 488, 561, 630 forem utilizados, digite 4 na caixa de diálogo). Clique ok.</li>
		<li>Digite os comprimentos de onda de excitação em uma sequência do mais curto (ou seja, nome da caixa: Excitação nº 1) ao comprimento de onda mais longo nas caixas de diálogo. Clique em OK para prosseguir; uma nova janela de imagem que apresenta uma imagem de CRM deve aparecer.</li>
		<li>Selecione a região de fundo arbitrária (ou seja, área onde as células estão ausentes) para ser usada para subtração de fundo. Desenhe um retângulo dentro da imagem CRM por arrastar o mouse. Clique duas vezes na região selecionada para confirmar a seleção.</li>
		<li>Encontre o diretório chamado Assinatura no diretório selecionado na etapa 5.2.4. NOTA: O código fornecido cria automaticamente este diretório. O diretório "Signature" armazena a assinatura de fluorescência inata de cada célula microbiana dentro de uma população como .png arquivos que são numerados em série após um prefixo comum "Signature".</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Análise estatística
NOTA: Realizar técnicas de redução dimensional (por exemplo, análise de componentes principais [PCA]) para visualizar a distribuição de hiperespectrums das populações celulares. O script fornecido (PCA.py) executa PCA para duas populações celulares (ou seja, duas classes).
<ol><li>Equipar uma estação de trabalho com a linguagem de programação e bibliotecas e módulos de acompanhamento (Tabela de Materiais).</li>
	<li>Crie um diretório vazio na unidade C (ou equivalente) e nomeie o diretório "Parent_directory" (ou seja, C:/ Parent_ diretório).</li>
	<li>Armazene as assinaturas de fluorescência (por exemplo, os arquivos .png gerados na etapa 4.2.7) de cada uma das duas populações celulares em dois diretórios separados. NOTA: Os dois diretórios devem estar localizados no "Parent_directory". C:/Parent_directory/ <img alt="image 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img1.jpg">putidaKT2440/ <img alt="image 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg"> <img alt="image 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">Assinatura01.png <img alt="image 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg"> <img alt="image 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">Assinatura02.png <img alt="image 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg"> <img alt="image 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">: <img alt="image 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img1.jpg">putidaKT2442/ 
	 <img alt="image 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">Assinatura01.png 
	 <img alt="image 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">Assinatura02.png 
	 <img alt="image 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">:</li>
	<li>Baixe PCA.py no "Parent_directory".</li>
	<li>Abra a interface da linha de comando da estação de trabalho.</li>
	<li>Digite "python C:/Parent_directory/PCA.py" na interface da linha de comando.</li>
	<li>Selecione o "Parent_directory" após a exibição da mensagem 'Selecionar diretório de destino'.</li>
	<li>No "C:/Parent_directory", encontre "PCA.png", que contém um enredo PCA resultante.</li>
</ol>

<ol><li>Monici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+tissue+autofluorescence+research+and+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Annual+Review%22%5BJournal%5D)">Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).</li>
<li>Tang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genomics%22%5BJournal%5D)">Microbial metabolomics.</a> Current Genomics. 12, 391-403 (2011).</li>
<li>Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Then+and+now%3A+use+of+16S+rDNA+gene+sequencing+for+bacterial+identification+and+discovery+of+novel+bacteria+in+clinical+microbiology+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories.</a> Clinical Microbiology and Infection. 14, 908-934 (2008).</li>
<li>Amman, R., Fuchs, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+identification+in+microbial+communities+by+improved+fluorescence+in+situ+hybridization+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques.</a> Nature Reviews Microbiology. 6, 339-348 (2008).</li>
<li>Giana, H. E., Silveira, L., Zângaro, R. A., Pacheco, M. T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+bacterial+species+by+fluorescence+spectroscopy+and+classification+through+principal+components+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of bacterial species by fluorescence spectroscopy and classification through principal components analysis.</a> Journal of Fluorescence. 13 (6), 489-493 (2003).</li>
<li>Leblanc, L., Dufour, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+identity+of+bacteria+using+their+intrinsic+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Monitoring the identity of bacteria using their intrinsic fluorescence.</a> FEMS Microbiology Letters. 211 (2), 147-153 (2002).</li>
<li>Hou, X., Liu, S., Feng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autofluorescence+characteristics+of+bacterial+intracellular+and+extracellular+substances+during+the+operation+of+anammox+reactor%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The autofluorescence characteristics of bacterial intracellular and extracellular substances during the operation of anammox reactor.</a> Scientific Reports. 7, 39289(2017).</li>
<li>Ramanujam, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+diagnosis+of+cervical+intraepithelial+neoplasia+using+337-nm-excited+laser-induced+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337-nm-excited laser-induced fluorescence.</a> Proceeding National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (21), 10193-10197 (1994).</li>
<li>Zhang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+cellular+fluorescence+reflects+alterations+in+cellular+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Innate cellular fluorescence reflects alterations in cellular proliferation.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 20 (3), 319-331 (1997).</li>
<li>Gosnell, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+non-invasive+cell+characterisation+and+discrimination+based+on+multispectral+autofluorescence+features%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features.</a> Scientific Reports. 6, 23453(2016).</li>
<li>Yawata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+interspecies+variability+of+single-cell+innate+fluorescence+signature+of+microbial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Intra- and interspecies variability of single-cell innate fluorescence signature of microbial cell.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85, 00608-00619 (2019).</li>
<li>Nelson, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+and+comparative+analysis+of+the+metabolically+versatile+Pseudomonas+putida+KT2440%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440.</a> Environmental Microbiology. 4 (12), 799-808 (2002).</li>
<li>Bagdasarian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific-purpose+plasmid+cloning+vectors.+II.+Broad+host+range%2C+high+copy+number%2C+RSF1010-derived+vectors%2C+and+a+host-vector+system+for+gene+cloning+in+Pseudomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas.</a> Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).</li>
<li>Luo, Y., Vijaychander, S., Stile, J., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+analysis+of+DNA-binding+proteins+by+yeast+one-hybrid+and+one-two-hybrid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Cloning and analysis of DNA-binding proteins by yeast one-hybrid and one-two-hybrid systems.</a> Biotechniques. 20 (4), 564-568 (1996).</li>
<li>Yawata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+biofilm+development+in+a+microfluidic+device+using+modified+confocal+reflection+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 110 (3), 377-380 (2010).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy.+Third+edition%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third edition</a>. , Springer. Germany. (2006).</li>
<li>Blacker, T. S., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+mitochondrial+redox+state+using+NADH+and+NADPH+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence.</a> Free Radical Biology & Medicine. 100, 53-65 (2016).</li>
<li>Croce, A. C., Bottiroli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+spectroscopy+and+imaging%3A+A+tool+for+biomedical+research+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis.</a> European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2461(2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Existem dois pontos críticos neste método que precisam ser acompanhados de perto para obter resultados reprodutíveis: 1) manter a saída de energia laser sob o objetivo do microscópio consistente através de comprimentos de onda e experimentos de excitação, e 2) realizar segmentação celular precisa.
O primeiro ponto é particularmente importante quando se compara a assinatura de fluorescência inata entre diferentes experimentos. Evite simplesmente aplicar as mesmas configurações de "saída percent...

Diversas biomoléculas dentro de uma célula1 emitem sinais de autofluorescência, e a assinatura de fluorescência inata de uma célula consiste na montagem desses sinais. Essa fluorescência de assinatura reflete várias propriedades celulares e também diferenças no estado fisiológico. A análise da fluorescência inata é minimamente invasiva e pode complementar sondas microbiológicas tradicionais e mais invasivas que deixam uma gama de vestígios desde modificações metabólicas leves até destruição celular completa. Enquanto técnicas tradicionais como extração de DNA ou conteúdo celular2,3, hibridização fluorescente in situ4, e a introdução de genes repórteres fluorescentes ao genoma são eficazes na determinação do tipo celular ou status fisiológico, eles geralmente requerem manipulação das células ou marcação invasiva.
Estudos da fluorescência inata de várias colônias microbianas vivas e intactas, incluindo suspensões de cultura microbiana a granel5,6, lodo ativo7, tecidos mamíferos8,9 e células mamíferas1,10, mostraram que a análise de fluorescência inata facilita a análise livre de etiquetas de tipos celulares e status fisiológico. As assinaturas de fluorescência inata têm sido tradicionalmente analisadas no nível populacional e não no nível de célula única, e, portanto, necessitam de uma cultura clonal. Em contraste, a técnica de análise de fluorescência unicelular assistida por microscopia confocal (CRIF) descrita aqui reconstrói e cataloga a assinatura de fluorescência celular inata de cada célula microbiana viva individual. Além disso, o CRIF pode sistematicamente reunir a assinatura de fluorescência inata de uma única célula microbiana dentro de uma população que é distribuída em um espaço tridimensional (3D).

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Wako Chemicals</td><td>312-01193</td><td></td></tr><tr><td>Divisores de feixe</td><td>Carl Zeiss, Nikon</td><td></td><td>MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, ou MBS 488/543/633 divisores de feixe (Carl Zeiss)</td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Carl Zeiss, Nikon</td><td></td><td>Modelo LSM 880 (Carl Zeiss), Modelo A1R (Nikon)</td></tr><tr><td>Lamínulas</td><td>Matsunami Glass</td><td>C024601</td><td></td></tr><tr><td>Corrediças de vidro</td><td>Matsunami</td><td>Vidro S011120</td><td></td></tr><tr><td>Espelho de semi-reflexão</td><td>Carl Zeiss, Nikon</td><td></td><td>NT80/20</td></tr><tr><td>Medidor de potência a laser</td><td>Thorlabs</td><td>PM400 (console do medidor de energia) e S175C (sensor)</td>LB Caldo Nacalai tesque 20066-95 Para cultura de bactérias Software de análise de imagem The MathWorks <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>MATLAB versão 2019a ou posterior, é necessária a caixa de ferramentas de processamento de imagem</td></tr><tr><td>Objetiva de microscópio</td><td>Carl Zeiss, Nikon</td><td>440762-9904</td>, <td>por exemplo, plano 63x Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss)</td></tr><tr><td>Software de microscópio</td><td>Carl Zeiss, Nikon</td><td></td><td>ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon)</td></tr><tr><td>PBS(-)</td><td>Wako Chemicals</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>Linguagem</td><td></td><td></td> <td>de programaçãoPython e bibliotecas, módulos (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) são necessários para executar o script PCA fornecido.</td></tr><tr><td>Junta de silicone</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P24744</td><td></td></tr><tr><td>Estação de trabalho</td><td></td><td></td><td>Recomenda-se uma estação de trabalho de alto desempenho com GPUs discretas.</td></tr><tr><td>Meio de ágar extrato de levedura-peptona-dextrose (YPD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1500-250G</td><td>Para cultura de levedura</td></tr><tr><td>YPD meio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1375-250G</td><td></td></tr></tbody></table>

reconstrução de assinaturas de fluorescência inata de células únicas por microscopia confocal

Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

Descrito aqui é a análise de fluorescência unicelular assistida por microscopia de reflexão confocal (CRIF), um método minimamente invasivo para reconstruir a assinatura de fluorescência celular inata de cada célula viva individual em uma população distribuída em um espaço tridimensional (3D). A assinatura de fluorescência inata de uma célula é uma coleção de sinais de fluorescência emitidos por várias biomoléculas dentro da célula. Estudos anteriores estabeleceram que as assinaturas de fluorescência inata refletem várias propriedades celulares e diferenças no estado fisiológico e são uma rica fonte de informação para caracterização e identificação celular. As assinaturas de fluorescência inata têm sido tradicionalmente analisadas no nível populacional, necessitando de uma cultura clonal, mas não no nível de célula única. O CRIF é particularmente adequado para estudos que requerem resolução 3D e/ou extração seletiva de sinais de fluorescência de células individuais. Como a assinatura de fluorescência é uma propriedade inata de uma célula, o CRIF também é adequado para a previsão livre de tags do tipo e/ou status fisiológico de células intactas e únicas. Este método pode ser uma ferramenta poderosa para análise celular simplificada, onde o fenótipo de cada célula em uma população heterogênea pode ser diretamente avaliado por sua assinatura de autofluorescência sob um microscópio sem marcação celular.

A Figura 1A mostra a assinatura típica de fluorescência unicelular de uma célula bacteriana apresentada como uma trama de espectro tradicional (superior) e como um mapa de calor (meio). A Figura 1B mostra o resultado de uma segmentação de células 2D precisa sobreposta à imagem original de CRM de uma população de bactérias do solo (Pseudomonas putida KT2440)12. As assinaturas de fluorescência inata resultantes para a população são...

Aqui, é apresentado um protocolo para extração óptica e catalogação de assinaturas de fluorescência celular inata (ou seja, autofluorescência celular) de cada célula viva individual distribuída em um espaço tridimensional. Este método é adequado para estudar a assinatura de fluorescência inata de diversos sistemas biológicos em uma resolução unicelular, incluindo células de bactérias, fungos, leveduras, plantas e animais.

Reconstrução de assinaturas de fluorescência inata de células únicas por microscopia confocal

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

Esta técnica oferece uma pesquisa única para provar a identidade ou características fisiológicas de sua célula no nível de célula única, sem a necessidade de marcação invasiva. As principais vantagens dessa técnica são que ela facilita a resolução espacial em nível de célula única para sua análise e permite a distinção entre um processo de segundo plano. Portanto, esta técnica pode potencialmente contribuir para a identificação e análise fenotípica de micróbios patogênicos.Esta técnica também pode ser aplicada ao estudo da heterogeneidade fenotípica, ou ao monitoramento do estado fisiológico da população microbiana de interesse. Demonstrando o procedimento estará Kyosuke Takabe, professor assistente do meu laboratório. A configuração de microscopia de reflexão confocal e microespectroscopia confocal multicanal.Conecte o microscópio confocal com canais espectrais digitalizados a um tubo fotomultiplicador. Equipe o microscópio com uma objetiva de alta abertura numérica, com uma ampliação adequada. E equipe o microscópio com um espelho de semi-reflexão para acomodar a microscopia de reflexão confocal, que depende da dispersão celular da luz incidente para visualizar a morfologia celular.Para microespectroscopia confocal multicanal, equipe o microscópio com espelhos dicróicos e use um medidor de potência a laser para ajustar a intensidade da iluminação para cada comprimento de onda de excitação. Em seguida, defina a saída sob o microscópio para ser constante através dos comprimentos de onda de excitação. Para obter imagens das bactérias através do microscópio, defina o tamanho do orifício para 1,0 unidade de área no software do microscópio e defina o tempo de permanência do pixel para cada comprimento de onda de excitação.Defina a resolução de digitalização. Para células pequenas, como bactérias, use uma área de varredura de 1024 por 1024. Defina o intervalo do Z-Scanning para que a região de interesse seja coberta.E usando uma janela espectral de oito a 10 nanômetros, defina o detector D-Scan para capturar a faixa de comprimento de onda visível. Em seguida, adquira imagens de microespectroscopia confocal multicanal em uma sequência dos comprimentos de onda de excitação mais longos para os mais curtos para criar Z-Stacks de imagens de fluorescência e imagens de microscopia de reflexão confocal e salve as imagens no formato tiff de 16 bits. Para realizar a segmentação celular e a reconstrução de assinaturas fluorescentes inatas de célula única, abra um programa de software de análise de imagem apropriado e clique duas vezes para abrir um dos scripts fornecidos.Na guia do editor, clique em executar. Uma janela de seleção de pasta aparecerá. Selecione o diretório no qual as imagens do Z-Stack foram salvas e clique em abrir.Uma caixa de diálogo solicitando a entrada do parâmetro de segmentação aparecerá automaticamente. Defina o limite de binarização de imagem como 0-1, a binarização de imagem como 0,45, o limite superior de uma região de célula como 200, o limite inferior de uma região de célula como 10 e o número de detectores como 32. Uma caixa de diálogo solicitando entrada para o número de comprimentos de onda de excitação aparecerá.Insira o número de comprimentos de onda usados para a aquisição da imagem e clique em OK. Uma caixa de diálogo que está solicitando entrada para os comprimentos de onda de excitação aparecerá. Insira os comprimentos de onda de excitação em sequência do mais curto para o mais longo e clique em OK.Uma nova janela de imagem apresentando uma imagem de microscopia de reflexão confocal aparecerá. Selecione uma região de fundo arbitrária para usar para a subtração de fundo e desenhe um retângulo dentro da imagem de microscopia de reflexão confocal. Clique duas vezes na região selecionada para confirmar a seleção e localizar um novo diretório chamado assinatura.Para executar técnicas de redução dimensional, crie um diretório vazio e nomeie o diretório parent_directory. Armazene as assinaturas fluorescentes de cada uma das duas populações de células em dois diretórios separados e abra a interface de linha de comando da estação de trabalho. Digite o comando.Quando selecionar diretório de destino for exibido, selecione o parent_directory. Em seguida, na pasta parent_directory, localize o PCA. png, que conterá o gráfico de análise de componente principal resultante.Aqui, uma assinatura fluorescente típica de célula única de uma célula bacteriana apresentada como um gráfico de espectro tradicional e como um mapa de calor é mostrada. Nesta figura, pode ser observada uma segmentação celular 2D imprecisa sobreposta à imagem original de microscopia de reflexão confocal de uma população de bactérias do solo. Com as assinaturas fluorescentes inatas resultantes para a população apresentadas como um mapa de calor.Observe que a variabilidade intrapopulacional foi relativamente pequena após a segmentação celular bem-sucedida. Aqui, um exemplo de segmentação celular imprecisa é mostrado sobreposto à mesma população de P.putida como mostrado anteriormente. O impacto da segmentação celular imprecisa nas assinaturas fluorescentes inatas da população é facilmente aparente a partir do número considerável de outliers observados no mapa de calor correspondente.A segmentação celular imprecisa resulta em um cluster mais solto após a análise do componente principal, em comparação com o cluster de tipo obtido após a segmentação celular precisa. Apesar das pequenas variabilidades da assinatura fluorescente inata observadas dentro de cepas bacterianas individuais, cada população forma um agrupamento distinto no gráfico de análise de componentes principais. Nesta figura, pode ser observada uma segmentação celular 3D imprecisa sobreposta à imagem original de microscopia de reflexão confocal de uma população de levedura em brotamento Saccharomyces cerevisiae YM4271.Observe a falta de outliers e as assinaturas fluorescentes inatas resultantes para a população. É essencial adquirir uma imagem o mais limpa possível por microscopia confocal e evitar uma saturação da intensidade do sinal, pois o ruído pode prejudicar a precisão da análise subsequente. Você pode treinar modelos de aprendizado de máquina com o conjunto de dados de assinatura ocidental inata para uso em tarefas de classificação ou previsão, oferecendo uma análise populacional sem tags e previsão fenotípica.

reconstruction-single-cell-innate-fluorescence-signatures-confocal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Demonstramos o uso da microscopia de localização por fotoativação por fluorescência (FPALM) para obter imagens simultâneas de vários tipos de moléculas marcadas com fluorescência dentro das células. As técnicas descritas produzem a localização de milhares a centenas de milhares de proteínas individuais marcadas com fluorescência, com uma precisão de dezenas de nanômetros dentro de células individuais.

Simultânea Multicolor Imagem de Estruturas Biológicas com fluorescência Fotoativação Localização Microscopia

Combinatória 5 proteínas fluorescentes marcação de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas permite in vivo de rastreamento via clonal confocal e microscopia de dois fótons, fornecendo insights sobre medula óssea hematopoiética arquitetura durante a regeneração. Este método permite o mapeamento destino não-invasivo de espectro codificados células hspCs derivados em tecidos intactos por longos períodos de tempo após o transplante.

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

Este protocolo descreve como usar a microscopia de fluorescência de reflexão interna total para visualizar e rastrear receptores únicos na superfície de células vivas e, assim, analisar a mobilidade lateral do receptor, o tamanho dos complexos receptores, bem como visualizar as interações transitórias receptor-receptor. Este protocolo pode ser estendido a outras proteínas de membrana.

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

Estudos de biomoléculas in vivo são cruciais para a compreensão da função molecular em um contexto biológico. Aqui descrevemos um novo método que permite a internalização de biomoléculas fluorescentes, como DNA ou proteínas, em microrganismos vivos. A análise de dados in vivo registrados por microscopia de fluorescência também é apresentada e discutida.

Internalização e Observação de Fluorescent Biomoléculas em microorganismos vivos via Eletroporação

Este manuscrito descreve um método para visualizar e quantificar eventos tradução localizada em compartimentos subcellular. A abordagem proposta neste manuscrito requer um sistema básico de imagens confocal e reagentes e é rápido e econômico.

Imunofluorescência quantitativa a medida Global localizadas Tradução

Este protocolo descreve um método novo, permitindo a visualização quantitativa da formação do complexo de proteínas SNARE, baseado na transferência de energia de ressonância de Förster e vida de fluorescência, microscopia de imagem.

Visualizando intracelular SNARE tráfico pela vida de fluorescência, microscopia de imagem

Anticorpos que se ligam a receptores de alvo na superfície da pilha podem conferir alterações clusterização e conformação. Estas mudanças dinâmicas têm implicações para caracterizar o desenvolvimento de drogas em células-alvo. Este protocolo utiliza a microscopia confocal e espectroscopia de correlação de imagem através do ImageJ/FIJI para quantificar a extensão do receptor na superfície das células de clustering.

Microscopia confocal revela agregação de receptores de superfície celular através de espectroscopia de correlação de imagem

Efferocytosis, a remoção fagocitária das células apoptóticas, é necessário para manter a homeostase e é facilitado por receptores e vias de sinalização que permitem o reconhecimento, a duração e internalização de pilhas apoptotic. Neste documento, apresentamos um protocolo de microscopia de fluorescência para a quantificação dos efferocytosis e a atividade das vias de sinalização de efferocytic.

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

Descrevemos uma abordagem de imagem para a determinação do estado oligomérico médio de oligomeros de receptores marcados por mEGFP induzidos pela ligação de ligand na membrana plasmática das células vivas. O protocolo é baseado na microscopia de Fluorescência Total de Reflexão Interna (TIRF) combinada com análise de Número e Brilho (N&amp;B).

Dinâmica de oligomerização dos receptores de superfície celular em células vivas pela microscopia de fluorescência de reflexão interna total combinada com análise de número e brilho

O Spectral Iterative Bleaching Extends Multiplexity (IBEX) baseia-se na técnica básica do IBEX, adicionando bloqueio de heparina para minimizar a ligação inespecífica e aproveitando a detecção espectral com desmistura computacional para suprimir a autofluorescência. Essa abordagem acelera a aquisição de imagens enquanto reduz as fontes de fundo, permitindo análises proteômicas espaciais robustas de várias rodadas e de alto parâmetro.

Imagens de alta plexidade usando microscopia confocal espectral para minimizar a fluorescência de tecido não específico

Este protocolo detalha as aplicações avançadas de imagem e o gerenciamento de recursos compartilhados de um sistema de microscópio confocal de varredura a laser integrado a um detector de matriz multiplexada para imagens celulares e subcelulares de alta resolução. O fluxo de trabalho permite imagens multimodais desde confocal até super-resolução (~120 nm) dentro de uma única plataforma, tornando a visualização em escala nanométrica mais acessível.

Imagem de Superresolução e Gerenciamento Compartilhado: Um Protocolo para Microscopia Confocal com Detecção de Multiplex

Aprenda a extrair assinaturas de fluorescência inata de células únicas por microscopia confocal multicanal. Este método não invasivo permite analisar bactérias, fungos, leveduras e células vegetais e animais em resolução individual.

Reconstrução de assinaturas de fluorescência inata de células únicas por microscopia confocal

Explorar mais vídeos