Reconstrução de assinaturas de fluorescência inata de células únicas por microscopia confocal

Esta técnica oferece uma pesquisa única para provar a identidade ou características fisiológicas de sua célula no nível de célula única, sem a necessidade de marcação invasiva. As principais vantagens dessa técnica são que ela facilita a resolução espacial em nível de célula única para sua análise e permite a distinção entre um processo de segundo plano. Portanto, esta técnica pode potencialmente contribuir para a identificação e análise fenotípica de micróbios patogênicos.

Esta técnica também pode ser aplicada ao estudo da heterogeneidade fenotípica, ou ao monitoramento do estado fisiológico da população microbiana de interesse. Demonstrando o procedimento estará Kyosuke Takabe, professor assistente do meu laboratório. A configuração de microscopia de reflexão confocal e microespectroscopia confocal multicanal.

Conecte o microscópio confocal com canais espectrais digitalizados a um tubo fotomultiplicador. Equipe o microscópio com uma objetiva de alta abertura numérica, com uma ampliação adequada. E equipe o microscópio com um espelho de semi-reflexão para acomodar a microscopia de reflexão confocal, que depende da dispersão celular da luz incidente para visualizar a morfologia celular.

Para microespectroscopia confocal multicanal, equipe o microscópio com espelhos dicróicos e use um medidor de potência a laser para ajustar a intensidade da iluminação para cada comprimento de onda de excitação. Em seguida, defina a saída sob o microscópio para ser constante através dos comprimentos de onda de excitação. Para obter imagens das bactérias através do microscópio, defina o tamanho do orifício para 1,0 unidade de área no software do microscópio e defina o tempo de permanência do pixel para cada comprimento de onda de excitação.

Defina a resolução de digitalização. Para células pequenas, como bactérias, use uma área de varredura de 1024 por 1024. Defina o intervalo do Z-Scanning para que a região de interesse seja coberta.

E usando uma janela espectral de oito a 10 nanômetros, defina o detector D-Scan para capturar a faixa de comprimento de onda visível. Em seguida, adquira imagens de microespectroscopia confocal multicanal em uma sequência dos comprimentos de onda de excitação mais longos para os mais curtos para criar Z-Stacks de imagens de fluorescência e imagens de microscopia de reflexão confocal e salve as imagens no formato tiff de 16 bits. Para realizar a segmentação celular e a reconstrução de assinaturas fluorescentes inatas de célula única, abra um programa de software de análise de imagem apropriado e clique duas vezes para abrir um dos scripts fornecidos.

Na guia do editor, clique em executar. Uma janela de seleção de pasta aparecerá. Selecione o diretório no qual as imagens do Z-Stack foram salvas e clique em abrir.

Uma caixa de diálogo solicitando a entrada do parâmetro de segmentação aparecerá automaticamente. Defina o limite de binarização de imagem como 0-1, a binarização de imagem como 0,45, o limite superior de uma região de célula como 200, o limite inferior de uma região de célula como 10 e o número de detectores como 32. Uma caixa de diálogo solicitando entrada para o número de comprimentos de onda de excitação aparecerá.

Insira o número de comprimentos de onda usados para a aquisição da imagem e clique em OK. Uma caixa de diálogo que está solicitando entrada para os comprimentos de onda de excitação aparecerá. Insira os comprimentos de onda de excitação em sequência do mais curto para o mais longo e clique em OK.

Uma nova janela de imagem apresentando uma imagem de microscopia de reflexão confocal aparecerá. Selecione uma região de fundo arbitrária para usar para a subtração de fundo e desenhe um retângulo dentro da imagem de microscopia de reflexão confocal. Clique duas vezes na região selecionada para confirmar a seleção e localizar um novo diretório chamado assinatura.

Para executar técnicas de redução dimensional, crie um diretório vazio e nomeie o diretório parent_directory. Armazene as assinaturas fluorescentes de cada uma das duas populações de células em dois diretórios separados e abra a interface de linha de comando da estação de trabalho. Digite o comando.

Quando selecionar diretório de destino for exibido, selecione o parent_directory. Em seguida, na pasta parent_directory, localize o PCA. png, que conterá o gráfico de análise de componente principal resultante.

Aqui, uma assinatura fluorescente típica de célula única de uma célula bacteriana apresentada como um gráfico de espectro tradicional e como um mapa de calor é mostrada. Nesta figura, pode ser observada uma segmentação celular 2D imprecisa sobreposta à imagem original de microscopia de reflexão confocal de uma população de bactérias do solo. Com as assinaturas fluorescentes inatas resultantes para a população apresentadas como um mapa de calor.

Observe que a variabilidade intrapopulacional foi relativamente pequena após a segmentação celular bem-sucedida. Aqui, um exemplo de segmentação celular imprecisa é mostrado sobreposto à mesma população de P.putida como mostrado anteriormente. O impacto da segmentação celular imprecisa nas assinaturas fluorescentes inatas da população é facilmente aparente a partir do número considerável de outliers observados no mapa de calor correspondente.

A segmentação celular imprecisa resulta em um cluster mais solto após a análise do componente principal, em comparação com o cluster de tipo obtido após a segmentação celular precisa. Apesar das pequenas variabilidades da assinatura fluorescente inata observadas dentro de cepas bacterianas individuais, cada população forma um agrupamento distinto no gráfico de análise de componentes principais. Nesta figura, pode ser observada uma segmentação celular 3D imprecisa sobreposta à imagem original de microscopia de reflexão confocal de uma população de levedura em brotamento Saccharomyces cerevisiae YM4271.

Observe a falta de outliers e as assinaturas fluorescentes inatas resultantes para a população. É essencial adquirir uma imagem o mais limpa possível por microscopia confocal e evitar uma saturação da intensidade do sinal, pois o ruído pode prejudicar a precisão da análise subsequente. Você pode treinar modelos de aprendizado de máquina com o conjunto de dados de assinatura ocidental inata para uso em tarefas de classificação ou previsão, oferecendo uma análise populacional sem tags e previsão fenotípica.