Name: Modelo de inoculação do footpad do mouse para estudar respostas neuroinflamatórias induzidas pelo viral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Aprenda a usar o modelo de inoculação do footpad em camundongos C57BL/6 para estudar respostas neuroinflamatórias induzidas por vírus. Este método permite avaliar a cinética viral e processos imunopatológicos no sistema nervoso periférico.

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Os autores reconhecem os laboratórios de Charles River por seu excelente apoio técnico executando as análises histopatologias. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e AVC (NINDS) (RO1 NS033506 e RO1 NS060699). Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do manuscrito.

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com um protocolo (número 2083-16 e 2083-19) revisado e aprovado pelo Comitê de Uso e Cuidados e Uso de Animais da Instituição (IACUC) da Universidade de Princeton. Este trabalho foi feito seguindo rigorosamente os requisitos de nível 2 (BSL-2) de biossegurança, aos quais temos um laboratório totalmente equipado aprovado pelo comitê de biossegurança da Universidade de Princeton. Os procedimentos, incluindo abrasão do pé do rato, inoculação viral, dissecção de camundongos e coleta de tecidos foram realizados em um gabinete de segurança biológica (BSC) na sala de biocontenção de animais da Universidade de Princeton. Os que realizaram o procedimento usavam vestidos descartáveis, cobertura da cabeça, proteção ocular, luvas estéreis, máscaras cirúrgicas e capas de sapato.
1. Abrasão do footpad do mouse
<ol><li>Anestesia um rato C57BL/6 (5-7 semanas de idade) com anestésico de gás isoflurane, entregue a uma dosagem de 3% através de um pequeno sistema de anestesia (câmara).<ol>
<li>Coloque o rato no plano cirúrgico da anestesia nas costas, antes da inoculação, no fundo do pé traseiro. Conecte um cone de nariz com um diafragma (uma fenda suficientemente dimensionada para caber a focinheira do animal) ao rato e entregue anestésico de gás isoflurane a uma dose constante de 1,5%-2,0%.</li>
		<li>Monitore de perto o mouse para uma resposta a estímulos dolorosos criados por beliscões forçadas do dedo do dedo do dedo com fórceps.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Segure levemente um footpad traseiro com fórceps planos.<ol>
<li>Abrade suavemente a pele glabrous do footpad traseiro aproximadamente 20x, entre o calcanhar e as almofadas de caminhada, com uma placa emery (100-180 grão). Não induza o sangramento por abradas com muita frequência ou aplicando muita pressão.</li>
		<li>Usando fórceps finos, retire lentamente o estrato corneum destacado pela abrasão para expor o basale estrato.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Inoculação do bloco de rodas PRV
<ol><li>Prepare o vírus inóculo diluído ao titer desejado em mídia DMEM contendo 2% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina(Tabela de Materiais).<ol>
<li>Quantita o número de unidades formadoras de placas (PFU) no estoque de vírus em células PK15 para calcular e padronizar a dose viral e diluir o inóculo viral em conformidade. NOTA: Neste estudo, foi utilizada cepa virulenta de PRV-Becker (PRV-Becker) em dose de 8 x 106 PFU. Esta dose foi otimizada em um experimento preliminar anterior para garantir que todos os animais vacinados apresentassem sintomas clínicos em 82 h pós-inoculação (hpi).</li>
		<li>Mantenha o vírus inóculo no gelo e misture suavemente antes de usar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione uma gotícula de 20 μL de inóculo do vírus (8 x 106 PFU) no footpad abraded (administração tópica). Realizar inoculações simuladas (somente médias) em paralelo.</li>
	<li>Esfregue suavemente 10x com o eixo de uma agulha para facilitar a adsorção do vírus. Evite coçar com o ponto da agulha. Repita este passo a cada 10 minutos.</li>
	<li>Mantenha o rato sob anestesia por 30 minutos até que o bloco de pés abrasado esteja seco.</li>
	<li>Depois de parar a anestesia, monitore o camundongo até que ele possa manter a recumbência severa e colocá-lo em uma gaiola individual para acompanhamento clínico e amostragem.</li>
</ol>3. Dissecção de ratos e coleta de tecidos
<ol><li>Em momentos apropriados após a infecção, eutanize o camundongo pelo método de asfixia (CO2). NOTA: Neste estudo, o ponto final humano (quando os animais começam a apresentar sintomas terminais) para camundongos infectados pelo PRV-Becker é de 82 hpi. Eutanize animais de controle em paralelo.</li>
	<li>Coloque o lado ventral do mouse voltado para cima em um tapete cirúrgico usando agulhas/pinos. Fixar os membros do rato com pinos em uma placa de espuma cirúrgica. Molhe o lado ventral do mouse com 70% de etanol para minimizar a contaminação da pele.</li>
	<li>Aperte a camada externa de pele e pele usando fórceps e faça uma pequena incisão inicial usando uma tesoura fina perto da abertura uretral.<ol>
<li>A partir desta abertura, continue a incisão no lado ventral médio até o queixo.</li>
		<li>Estenda duas incisões laterais em direção às extremidades dos membros dianteiros e traseiros.</li>
		<li>Separe a pele da camada muscular subjacente e fixe para baixo para o lado.</li>
		<li>Abra a cavidade abdominal e incise até a base do tórax. Complete a abertura da cavidade abdominal fazendo duas incisões transversais.</li>
		<li>Abra a cavidade torácica cortando o diafragma e as costelas em ambos os lados laterais. NOTA: Cortar as laterais da caixa torácica evita o risco de cortar o coração.</li>
		<li>Coletar órgãos expostos, incluindo coração, pulmões, baço, pâncreas, fígado, rins e bexiga em microtubos de 1,5 mL. Mantenha os tubos no gelo.</li>
		<li>Corte o bloco de pé abrasado entre o calcanhar e as almofadas de caminhada e coloque o pedaço de tecido em um tubo, conforme descrito na etapa 3.3.6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque o lado dorsal do rato para cima e molhe a pele com 70% de etanol. Corte a camada da pele para expor a coluna vertebral.<ol>
<li>Faça uma pequena incisão na região da pélvis. Retire a pele dos membros traseiros em direção à cabeça.</li>
		<li>Remova as pernas e braços cortando com uma tesoura paralela e próxima à coluna vertebral de ambos os lados.</li>
		<li>Corte a cabeça na base do crânio (nível C1-C2).</li>
		<li>Abra o crânio com uma tesoura do forame magnum até o osso frontal.</li>
		<li>Puxe o crânio em direções laterais usando fórceps.</li>
		<li>Retire suavemente o cérebro usando fórceps e prossiga como descrito na etapa 3.3.6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Limpe a coluna vertebral cortando músculos, gorduras e tecidos moles usando tesouras curvas. Corte a cauda. Coloque a coluna vertebral intacta em um tubo de 15 mL contendo soro fisiológico estéril tamponado com fosfato (PBS). Mantenha os tubos no gelo até uma dissecção adicional da medula espinhal e drg.</li>
</ol>4. Extração da medula espinhal e DRG
NOTA: Extrair medula espinhal e DRG da coluna vertebral após a dissecção do rato. O protocolo para extração da medula espinhal e DRG foi adaptado de uma publicação anterior7.
<ol><li>Remova a coluna de vértebras do tubo PBS gelado e remova os tecidos moles restantes, o que se torna mais fácil após a refrigeração.</li>
	<li>Faça três cortes transversais na coluna através das vértebras (níveis T1, L1 e S2) usando uma lâmina de barbear. Coloque as três peças em uma placa de Petri de 15 mm contendo PBS estéril e gelada. Acompanhe e marque a origem dos segmentos para análise posterior.</li>
	<li>Pegue um segmento e fixe-o entre fórceps, lado dorsal voltado para cima. Faça um único corte longitudinal através da linha média usando uma lâmina de barbear, dividindo a coluna em duas metades iguais.</li>
	<li>Coloque ambas as metades em uma nova placa de Petri contendo novo PBS gelado estéril. Certifique-se de que a orientação correta do segmento seja capaz de distinguir os lados esquerdo e direito.</li>
	<li>Sob um microscópio dissecando, retire suavemente a medula espinhal da coluna vertebral de cada metade em uma direção rostral para caudal usando fórceps finos.</li>
	<li>Colete as duas metades da medula espinhal em microtubos de 1,5 mL contendo 500 μL de PBS gelado estéril. Mantenha os tubos no gelo.</li>
	<li>Remova suavemente as meninges de um lado da coluna vertebral para o outro para expor o DRG.</li>
	<li>Remova cada DRG individualmente, agarrando o nervo espinhal exposto e puxe-o suavemente para fora da coluna vertebral. Coloque o DRG coletado em uma placa de Petri de 15 mm contendo PBS gelada. Colher todos os DRG ipsilaterais e contralaterais separadamente do segmento da coluna vertebral e proceder conforme descrito na etapa 4.5. NOTA: O DRG é visível como uma estrutura transparente redonda ao longo do nervo espinhal branco.</li>
	<li>Repetir as etapas 4.3-4.7 usando os dois outros segmentos da coluna vertebral dentro de 30-45 min.</li>
	<li>Centrifugar todos os tubos em alta velocidade (17.900 x g) por 3 min a 4 °C.</li>
	<li>Aspirar tubos supernascidas e flash-freeze em nitrogênio líquido. Armazene tubos a -80 °C para maior homogeneização tecidual.</li>
	<li>Alternativamente, fixe e se sectionia os tecidos drg limpos e outros camundongos para análises histopatológicas e/ou coloração de imunofluorescência após a etapa 4.9.</li>
</ol>5. Homogeneização de tecidos
<ol><li>Descongele os tubos contendo amostras de tecido congelado no gelo.</li>
	<li>Pesar 100 mg de tecido e colocá-lo em um tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo uma conta de aço estéril e 500 μL de tampão RIPA contendo 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 1 M Tris-HCl (pH = 8,0), 5 M NaCl, 10% SDS, e comprimidos inibidores de coquetel de protease.</li>
	<li>Interrompa os tecidos à temperatura ambiente (RT) usando um homogeneizador a 20 ciclos/s por 2 minutos, seguido por um período de espera de 1 min, depois 20 ciclos/s por 2 min.</li>
	<li>Centrifugar o tubo em alta velocidade (17.900 x g) por 10 min no RT.</li>
	<li>Colete supernasal (500 μL) em um novo tubo e armazene-o a -20 °C até realizar ELISA e qPCR para quantificar marcadores inflamatórios e cargas virais, respectivamente. NOTA: Para qPCR, colete todas as amostras com material livre de RNase (ou seja, contas, tubos, etc.) e interrompa tecidos com tampão de lla lysis de RNA contendo 1% de betamercaptoetanol(Tabela de Materiais).</li>
</ol>6. Preparação e coloração de imunofluorescência de seções de DRG congelados
<ol><li>Processamento de tecidos<ol>
<li>Fixar o DRG dissecado e limpo em 1% de paraformaldeído (PFA) por 2 h no RT.</li>
		<li>Transfira o tecido para um tubo de 15 mL com 10% de sacarose em PBS. Incubar durante a noite a 4 °C.</li>
		<li>Transfira o tecido para um tubo de 15 mL com 20% de sacarose em PBS. Incubar durante a noite a 4 °C.</li>
		<li>Transfira o tecido para um tubo de 15 mL com 30% de sacarose em PBS. Incubar durante a noite a 4 °C.</li>
		<li>Incorpore tecidos em OUTUBRO usando uma criomold e coloque blocos em gelo seco para congelamento rápido.</li>
		<li>Armazene as amostras a -80 °C até usar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de criosectioning<ol>
<li>Remova o bloco congelado a partir de -80 °C e deixe-o equilibrar na temperatura da câmara criostat por 30 minutos.</li>
		<li>Criosection o DRG a uma espessura de 15 μm e montar as seções em slides.</li>
		<li>Use uma caneta para desenhar um círculo hidrofóbico em torno do tecido montado em slides.</li>
		<li>Mantenha os slides a 4 °C até coloração.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloração de imunofluorescência<ol>
<li>Lave as seções DRG 3x em PBS por 10 minutos no RT.</li>
		<li>Incubar as seções com 100 μL de anticorpo primário desejado (por exemplo, anticorpo do rato contra glicoproteína PRV B) por 1 h a 37 °C. Diluir o anticorpo primário em PBS contendo soro de cabra 10% negativo.</li>
		<li>Repita o passo 6.3.1.</li>
		<li>Incubar as seções com 100 μL de anticorpo secundário desejado (anti-rato de cabra Alexa Fluor 488) por 50 min a 37 °C. Diluir anticorpo secundário apenas na PBS.</li>
		<li>Adicione 100 μL de DAPI (4′,6-diamidino-2-fenildole) diluído em PBS na seção. Incubar ainda amostras 10 min a 37 °C.</li>
		<li>Repita o passo 6.3.1.</li>
		<li>Monte as amostras usando um meio de montagem de fluorescência em lâminas de vidro e proteja e cubra com tampa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Preparação e coloração de H&E de seções de tecido embarcadas parafina
<ol><li>Fixar o tecido em 10% de formalina por 24 h a 4 °C.</li>
	<li>Realize o cronograma de processamento padrão para incorporação e secção de tecidos fixos. Transferir tecidos fixos para 70% de etanol e processar através de álcoois atualizados para xileno seguido de parafina, como descrito anteriormente8. NOTA: Use esponjas de poliéster para manter pequenas amostras de tecido, como DRG dentro de fitas.</li>
	<li>Realizar a desparafinação padrão seguida de coloração de H&E de seções teciduais, como descrito anteriormente9.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O modelo de inoculação do footpad descrito aqui é útil para investigar a iniciação e o desenvolvimento de respostas neuroinflamatórias durante a infecção por alfaherpesvírus. Além disso, este modelo in vivo é usado para estabelecer a cinética da replicação e disseminação do alphaherpesvirus da PNS para o CNS. Trata-se de um alternado para outros modelos de inoculação, como o modelo de inoculação da pele flanco, que conta com arranhões dérmicos profundos13, ou a rota intracraniana, que introduz dir...

Este estudo descreve um modelo de inoculação de footpad para investigar a replicação e disseminação de vírus da PNS para o CNS e respostas neuroinflamatórias associadas. O modelo de inoculação do footpad tem sido intensamente utilizado para estudar a infecção por alfaherpesvírus nos neurônios1,,2,3. O principal objetivo deste modelo é permitir que os vírus neurotrópicos percorram uma distância máxima através da PNS antes de atingir o CNS. Aqui, este modelo é usado para obter novas percepções no desenvolvimento de uma neuropatia particular (coceira neuropática) em camundongos infectados com o vírus pseudorabies (PRV).
PRV é um alphaherpesvirus relacionado a vários patógenos conhecidos (ou seja, herpes simplex tipo 1 e 2 [HSV1 e HSV2] e vírus varicela-zoster [VZV]), que causam feridas frias, lesões genitais e catapora,respectivamente 4. Esses vírus são todos pantrópicos e capazes de infectar muitos tipos de células diferentes sem mostrar afinidade por um tipo específico de tecido. No entanto, todos eles exibem um neurotropismo característico invadindo a PNS (e ocasionalmente, o CNS) de espécies hospedeiras. O hospedeiro natural é o porco, mas o PRV pode infectar a maioria dos mamíferos. Nesses hospedeiros não naturais, o PRV infecta a PNS e induz um prurido grave chamado "coceira louca", seguido de morte peraguada5,6. O papel da resposta neuroimune no desfecho clínico e na patogênese da infecção pelo PRV tem sido mal compreendido.
O modelo de inoculação do footpad permite que o PRV inicie a infecção nas células epidérmicas do footpad. Em seguida, a infecção se espalha em fibras nervosas sensoriais e simpáticas que inervam a epiderme, as glândulas sudoríparas e a derme. A infecção se espalha por partículas de vírus movendo-se através do nervo ciático para o DRG dentro de aproximadamente 60 h. A infecção se espalha pela medula espinhal, atingindo o cérebro traseiro quando os animais ficam moribundos (82 h pós-infecção). Durante esta janela de tempo, amostras de tecido podem ser coletadas, processadas e analisadas para replicação de vírus e marcadores da resposta imune. Por exemplo, o exame histológico e a quantificação da carga viral podem ser realizados em diferentes tecidos para estabelecer correlações entre o início e o desenvolvimento de processos clínicos, virológicos e neuroinflamatórios na patogênese prv.
Utilizando o modelo de inoculação do footpad, os mecanismos celulares e moleculares do prurido induzido pelo PRV em camundongos podem ser investigados. Além disso, este modelo pode fornecer uma nova visão sobre a iniciação e desenvolvimento da neuroinflamação induzida pelo vírus durante infecções por herpesvírus. Uma melhor compreensão dos processos subjacentes a neuropatias induzidas por alphaherpesvírus pode levar ao desenvolvimento de estratégias terapêuticas inovadoras. Por exemplo, este modelo é útil para investigar os mecanismos de coceira neuropática em pacientes com lesões pós-herpéticas (por exemplo, herpes zoster, telhas) e testar novos alvos terapêuticos em camundongos para as doenças humanas correspondentes.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo anti-PRV gB</td><td>Feito pelo laboratório</td><td></td><td>1/500 de diluição</td></tr><tr><td>Aqua-hold2 caneta de papanicolau vermelha</td><td>Fisher scientific</td><td>2886909</td><td></td></tr><tr><td>Compact emery boards-24 contagem (lixas de unhas de grão 100/180)</td><td>Revlon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 camundongos (5-7 semanas)</td><td>The Jackson Laboratórios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução DAPI (1mg/ml)</td><td>Fisher scientific</td><td>62248</td><td>Diluição 1/1000</td></tr><tr><td>Placa de Petri de poliestireno estéril descartável 100 x 15 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5731500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Hyclone, GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30022</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina de tampão de folfato (PBS) de Dulbecco</td><td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td><td>SH30028</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td><td>SH30088</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura curva fina de aço inoxidável</td><td>FST</td><td>14095-11</td><td></td></tr><tr><td>Mídia de montagem Fluoromount-G</td><td>Fisher scientific</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Solução de formalina, tamponada neutra 10%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga 2ml</td><td>Denville Scientific</td><td>1000945</td><td></td></tr><tr><td>Microtube 1.5ml</td><td>SARSTEDT</td><td>72692005</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra negativo</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>154022</td><td></td></tr><tr><td>agulha de deslizamento de precisão 18G</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>lâminas de barbear de aço para trás</td><td>Personna</td><td>9412071</td><td></td></tr><tr><td>tampão de lise de RNA (RLT)</td> <td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>Contas de aço inoxidável, 5 mm</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost / plus lâminas microscópicas</td><td>Fisher scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Analisador de tecidos LT</td><td>Qiagen</td><td>69980</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek</td><td>OCT Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>488 (cabra anti-rato)</td> <td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td>1/2000 diluição</td></tr></tbody></table>

modelo de inoculação do footpad do mouse para estudar respostas neuroinflamatórias induzidas pelo viral

Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses

Este protocolo descreve um modelo de inoculação de footpad usado para estudar a iniciação e o desenvolvimento de respostas neuroinflamatórias durante a infecção por alphaherpesvírus em camundongos. Como os alfaherpesvírus são os principais invasores do sistema nervoso periférico (PNS), este modelo é adequado para caracterizar a cinética da replicação viral, sua disseminação da PNS para o CNS e respostas neuroinflamatórias associadas. O modelo de inoculação do footpad permite que partículas de vírus se espalhem de um local de infecção primária no pênco epiderme para fibras nervosas sensoriais e simpáticas que inervam a epiderme, glândulas sudoríparas e derme. A infecção se espalha através do nervo ciático para a gânglio raiz dorsal (DRG) e, finalmente, através da medula espinhal para o cérebro. Aqui, um footpad de rato é inoculado com o vírus pseudorabies (PRV), um alphaherpesvirus intimamente relacionado ao vírus herpes simplex (HSV) e ao vírus varicela-zoster (VZV). Este modelo demonstra que a infecção por PRV induz inflamação grave, caracterizada pela infiltração de neutrófilos no footpad e DRG. Altas concentrações de citocinas inflamatórias são posteriormente detectadas em tecidos homogeneizados pela ELISA. Além disso, observa-se uma forte correlação entre a expressão genética prv e proteína (via qPCR e se coloração) em DRG e a produção de citocinas pró-inflamatórias. Portanto, o modelo de inoculação do footpad proporciona uma melhor compreensão dos processos subjacentes às neuropatias induzidas pelo alfaherpesvírus e pode levar ao desenvolvimento de estratégias terapêuticas inovadoras. Além disso, o modelo pode orientar pesquisas sobre neuropatias periféricas, como esclerose múltipla e danos induzidos por virais associados à PNS. Em última análise, pode servir como uma ferramenta in vivo econômica para o desenvolvimento de medicamentos.

O modelo de inoculação do pé do mouse permite a caracterização da imunopagênese da infecção alfaherpesvírus in vivo, incluindo a replicação e disseminação da infecção do bloco de pés inoculado para o sistema nervoso e a indução de respostas neuroinflamatórias específicas.
Neste estudo, primeiro abrasamos o pé traseiro do rato e, seja simulado ou inoculado na região abradada, com uma cepa virulenta de PRV-Becker. O local de abrasão era visível no bloco de controle. Uma crosta foi formada no loc...

O modelo de inoculação do footpad é uma ferramenta valiosa para caracterizar respostas neuroinflamatórias invulgadas pelo viral in vivo. Em particular, fornece uma avaliação clara da cinética viral e processos imunopatológicos associados iniciados no sistema nervoso periférico.

Modelo de inoculação do footpad do mouse para estudar respostas neuroinflamatórias induzidas pelo viral

This protocol describes a footpad inoculation model used to study the initiation and development of neuroinflammatory responses during alphaherpesvirus ...

Este protocolo permite o estudo da iniciação e desenvolvimento de respostas neuroinflamatórias no sistema nervoso periférico do camundongo durante uma infecção viral. Com esse modelo, as infecções percorrem uma maior distância da periferia até o sistema nervoso periférico e central, permitindo uma avaliação máxima da cinética da resposta neuroinflamatória. Depois de colocar o rato C57BL/6 anestesiado de cinco a sete semanas na posição supina em uma almofada cirúrgica, confirme a falta de resposta ao reflexo do pedal.E use uma tábua de 100 a 180 grãos, para suavemente abrade a pele glabrous de um footpad traseiro entre o calcanhar e almofadas de caminhada com cerca de 20 passes da placa. Em seguida, use fórceps finos para lentamente descascar o estrato corneum destacado pela abrasão para expor o basale estrato. Após uma mistura suave, aplique topicamente 20 microliters do titer apropriado do inóculo do vírus no footpad abraded.Realizar inoculações simuladas com meio apenas nos blocos de pé abrasados dos animais de controle em paralelo. Após cada aplicação, esfregue suavemente o footpad 10 vezes com o eixo de uma agulha para facilitar a adsorção do vírus a cada 10 minutos por 30 minutos. Quando o bloco de pé abrasado estiver seco, permita que os camundongos se recuperem com monitoramento até a recumbência severa antes de colocar os animais em gaiolas individuais para acompanhamento clínico e amostragem.Nos pontos de tempo experimentais apropriados, colete os órgãos expostos do vírus, incluindo coração, pulmões, baço, pâncreas, fígado, rins e bexiga em microtubos individuais de 1,5 mililitro no gelo. Em seguida, colde os footpads abrasados entre o calcanhar e as almofadas de caminhada e coloque as amostras em microtubos individuais de 1,5 mililitro no gelo. Em seguida, coloque o mouse na posição propensa e molhe a pele com 70% de etanol.Para expor a coluna vertebral, faça uma pequena incisão na região da pelve e retire a pele dos membros traseiros em direção à cabeça. Para remover os membros da frente e do traseiro, use uma tesoura para cortar paralelamente e perto da coluna vertebral de ambos os lados. E remova a cabeça na base do crânio.Use a tesoura para abrir o crânio do forame magnum até o osso frontal. E use fórceps para abrir o crânio em uma direção lateral. Em seguida, use os fórceps para colher suavemente o cérebro e colocar o cérebro em um microtubo de 1,5 mililitro no gelo.Use uma tesoura curva para limpar a coluna vertebral do músculo, gordura e tecido mole, e remova a cauda. Em seguida, coloque a coluna vertebral intacta em um tubo de 15 mililitros de PBS gelado estéril no gelo por não mais do que três horas. Após a dissecção, transfira a medula espinhal para um prato de cultura tecidual para permitir a remoção de qualquer tecido mole restante.Use uma lâmina de barbear para fazer três cortes transversais através da coluna vertebral nas vértebras S2, L1 e T1. Transfira as peças em pratos individuais de 15 milímetros contendo PBS estéreis gelados. Acompanhar e marcar as origens dos segmentos para análise posterior.Em seguida, use fórceps para fixar um lado dorsal do segmento para cima e use uma lâmina de barbear para fazer um único corte longitudinal através da linha média para dividir a coluna em duas metades iguais. Coloque ambas as metades em uma nova placa de Petri contendo PBS fresco e estéril na orientação original para ser capaz de distinguir os lados esquerdo e direito da coluna vertebral. Sob um microscópio dissecador, use fórceps finos para descascar suavemente a medula espinhal de cada metade da coluna vertebral em uma direção rostral para caudal.Em seguida, coloque ambas as metades da medula espinhal em microtubos individuais de 1,5 mililitro contendo 500 microliters de PBS gelado estéril no gelo. Para expor o gânglio raiz dorsal, remova suavemente as meninges de um lado da coluna vertebral para o outro. E puxe o nervo espinhal branco exposto para fora da coluna vertebral.Retire o gânglio de raiz dorsal redondo e transparente do segmento da coluna vertebral em uma placa de Petri de 15 milímetros de PBS gelado. E coletar o gânglio raiz dorsal ipsilateral e contralateral como apenas demonstrado. Depois de colher o nervo espinhal e o gânglio raiz dorsal dos outros dois segmentos da coluna vertebral como apenas demonstrado, centrifugar todos os tubos de tecido em alta velocidade.Em seguida, aspire os supernantes e congele as amostras em nitrogênio líquido, e armazene a menos 80 graus Celsius até a homogeneização. Para homogeneização tecidual, descongele os tubos de tecido congelado no gelo antes de pesar 100 miligramas de cada amostra. Transfira para um tubo de microcentrifuuge de dois mililitros contendo contas estéreis e 500 microliters de tampão de ensaio radioimmunoprecipitação.Em seguida, interrompa os tecidos à temperatura ambiente em um homogeneizador a 20 ciclos por segundo durante dois minutos, seguido por um período de espera de um minuto e 20 ciclos por segundo por mais dois minutos. Após a segunda rodada de homogeneização, centrifugar os tecidos em alta velocidade antes de transferir 500 microliters de cada supernante para um novo tubo apropriadamente rotulado. Armazene a menos 20 graus Celsius até a análise a jusante.O local de abrasão é visível no bloco de controle. E é típico de uma crosta se formar no local de abrasão como parte do processo de cura. Em contraste, camundongos inoculados com pseudorabies, demonstram uma inflamação grave do footpad no ponto final humano que é caracterizado por inchaço e vermelhidão.O exame histopatológico do gânglio inoculado e da raiz dorsal revela necrose epidérmica e inflamação dérmica grave dentro das seções de pés infectados por pseudorabies. A infiltração de neutrófilos também é observada em pseudorabies infectados por DRG. Um aumento significativo na expressão proteica G-CSF é medido no footpad e no gânglio raiz dorsal de camundongos infectados por pseudorabies em comparação com os controles em sete e 82 horas após a infecção.Níveis significativos de G-CSF também são observados em 82 horas após a infecção na medula espinhal, cérebro, coração e tecidos hepáticos de camundongos infectados por pseudorrábies em comparação com os controles. Além disso, níveis significativos de IL-6 são detectados em todos os tecidos testados de camundongos infectados por pseudorabies a partir de 24 horas após a infecção. Em um estado moribundo, pseudorabies foram detectados no footpad, gânglio raiz dorsal, medula espinhal e cérebro.Com a alta expressão citoplasmática de psuedorabies glycoproteína gB nos neurônios do gânglio raiz dorsal em pseudorabies camundongos infectados. Para garantir uma infecção bem sucedida, é importante que a gota de vírus em uma coluna não caia do footpad abraded. Este modelo animal pode servir de plataforma para testar a eficácia de drogas anti-inflamatórias e antivirais, a fim de prevenir neuropatias periféricas induzidas pelo viral.

mouse-footpad-inoculation-model-to-study-viral-induced

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O vídeo demonstra a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo injetando uma combinação de glicoproteínas de oligodendrócitos de mielina e Mycobacterium tuberculosis inativado. O modelo permite que os pesquisadores estudem os mecanismos da doença e testem intervenções terapêuticas.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em modelo de camundongo

Este vídeo demonstra a geração de um modelo de camundongo com uma infecção do SNC. Um filhote de leite é injetado com o vírus tanto intracraniana quanto intraperitonealmente. O vírus se espalha, infectando o SNC, causando morte e inflamação das células neuronais. O filhote é avaliado quanto a sintomas de infecção à medida que a doença progride.

Geração de um Modelo Murino com Infecção do Sistema Nervoso Central

Este vídeo demonstra a geração de neuroinflamação em um modelo de camundongo. Um camundongo anestesiado com microferidas é retirado e um inóculo do vírus da pseudo-raiva (PRV) é aplicado nas feridas. O vírus infecta os nervos periféricos, se espalha para os gânglios da raiz dorsal (DRG) e infecta ainda mais a medula espinhal e o cérebro. A infecção de neurônios no sistema nervoso leva a uma resposta imune que induz danos neuronais, levando à neuroinflamação.

Gerando neuroinflamação induzida por vírus em um modelo de camundongo

Neste vídeo, um modelo de camundongo com esclerose múltipla é estabelecido usando encefalomielite autoimune experimental (EAE). O camundongo é injetado com uma emulsão contendo um peptídeo neuronal e um adjuvante, desencadeando uma resposta imune que ativa as células T autorreativas. Isso é seguido por uma injeção de toxina coqueluche (PTX) para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica, permitindo que as células T autorreativas se infiltrem no cérebro. Essa infiltração inicia uma...

Este vídeo demonstra o processo de avaliação da disfunção motora em um modelo de camundongo por meio da administração de toxina coqueluche e um inóculo contendo peptídeos e adjuvantes que imitam a mielina, seguidos de testes em esteira para avaliar a função motora e avaliar o dano nervoso resultante devido à ativação imunológica e desmielinização.

Avaliação da função motora em um modelo experimental de neurite autoimune em camundongo

Um protocolo de teste otimizado é apresentado neste artigo para o teste de desempenho Rotarod, usado para medir a incapacidade neurológica progressiva em camundongos infectados com TMEV.

Medindo Progressive Neurological Disability em um modelo de rato com esclerose múltipla

Este relatório apresenta uma abordagem simples para induzir com êxito neurite auto-imune experimental (EAN) usando a proteína mielina zero peptídeo de180-199 (P0) em combinação com adjuvante completo de Freund e coqueluche toxina. Apresentamos um paradigma sofisticado capaz de avaliar com precisão a extensão dos défices funcionais e neuropatologia que ocorrem neste EAN.

Uma abordagem simples para induzir a neurite auto-imune Experimental em camundongos C57BL/6 para avaliações funcionais e neuropatológicas

Neste relatório, destacam-se as vantagens de organotypic culturas e culturas primárias dissociadas dos gânglios das raízes de dorsais do mouse-derivado para investigar uma ampla gama de mecanismos associados a interação neurônio-glia, neuroplasticidade, neuroinflammation e resposta à infecção viral.

Rato adulto DRG explantes e dissociado de modelos de célula para investigar neuroplasticidade e respostas aos insultos ambientais incluindo infecção Viral

Uma abordagem é descrita para a detecção em tempo real da resposta imune inata de ferimento cutâneo e Staphylococcus aureus infecção de ratos. Por LysM-EGFP comparando os ratos (que possuem fluorescentes neutrófilos) com um LysM-EGFP mestiços cepa de rato imunodeficientes, avançamos nossa compreensão da infecção e o desenvolvimento de abordagens para combater a infecção.

Um modelo do rato para avaliar a resposta imune inata à infecção de Staphylococcus aureus

Aqui, nós apresentamos um protocolo para criar um modelo murino imuno-competente do ICR (Instituto do cancer da pesquisa) da infecção do sistema nervoso central para indicar o desenvolvimento da neuropatia. A monitoração de desordens encefalalitic virais agudas por contagens idênticas da doença podia ser executada mostrando a neuropatia vírus-induzida dengue in vivo.

Um modelo murino da doença da encefalite viral aguda induzida pelo vírus da dengue

A encefalomielite autoimune experimental é um dos modelos murinos de esclerose múltipla mais utilizados. No protocolo atual, camundongos C57BL/6J de ambos os sexos são imunizados com peptídeo glicoproteico oligodendrócito de mielina, resultando principalmente em paresia ascendente da cauda e membros. Aqui discutimos o protocolo de indução e avaliação da EAE.

Modelagem da Esclerose Múltipla em Dois Sexos: Encefalomielite Autoimune Experimental Induzida por MOG35-55

Aprenda a usar o modelo de inoculação do footpad em camundongos C57BL/6 para estudar respostas neuroinflamatórias induzidas por vírus. Este método permite avaliar a cinética viral e processos imunopatológicos no sistema nervoso periférico.

Modelo de inoculação do footpad do mouse para estudar respostas neuroinflamatórias induzidas pelo viral

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