Avaliação do estresse oxidativo em amostras biológicas usando o ensaio de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico

Portanto, o ensaio TBARS é melhor usado para avaliação geral intralaboratorial do estresse oxidativo em amostras biológicas, nas quais os níveis relativos de TBARS são comparados diretamente entre amostras que foram armazenadas e processadas juntas. Esses ensaios têm um custo extremamente baixo de cerca de 3 para testar 96 amostras em comparação com os kits disponíveis comercialmente, que custam cerca de 400, e permitem que apenas um único lote de amostras seja analisado. O método descrito aqui pode ser adaptado para aplicações específicas, incluindo estudos de estabilidade de bioespécimes e aqueles para os quais a adição de antioxidantes ou outros tipos de conservantes de amostra antes da análise é apropriada ou obrigatória.

Para evitar resultados muito variáveis, prepare reagentes frescos, certificando-se de que o pH não seja superior a quatro para os reagentes de cor e remova quaisquer bolhas na placa de inchaço de nidese antes de medir a absorbância. Comece preparando uma solução aquosa a 0,8% de ácido tiobarbitúrico. Prepare uma solução de hidróxido de sódio de cinco molares dissolvendo quatro gramas de esferas de hidróxido de sódio em 20 mililitros de água.

Armazene a solução em um recipiente de plástico. Deve ser preparado na hora para cada lote. Adicione quatro gramas de ácido tiobarbitúrico a 450 mililitros de água deionizada e use uma barra de agitação magnética para dissolvê-lo suavemente.

Adicione lentamente aproximadamente quatro mililitros da solução de hidróxido de sódio em incrementos de 100 microlitros, verificando o pH à medida que as partículas de ácido tiobarbitúrico se dissolvem. Continue adicionando o hidróxido de sódio até que todas as partículas se dissolvam. Verifique se o pH da solução não é superior a quatro com uma faixa de pH, depois leve o volume final para 500 mililitros com água deionizada e armazene a solução aquosa de ácido bárbaro tiobarbitúrico à temperatura ambiente.

Preparar soluções de curva padrão de MDA bis dimetilacetal em tubos de polipropileno com tampa de pressão de dois mililitros. Diluindo a solução estoque de 200 micromolares em água, conforme descrito no manuscrito do texto. Vórtice as amostras.

Rotule os tubos de vidro para as amostras a serem analisadas e, em seguida, adicione 100 microlitros da amostra preparada a cada tubo. Adicione 200 microlitros de 8,1% SDS a cada amostra e gire suavemente o tubo de vidro em movimentos circulares para misturar. Adicione 1,5 mililitros de tampão de acetato de sódio 3,5 molar a cada amostra e, em seguida, adicione 1,5 mililitros da solução aquosa de ácido tiobarbitúrico a 0,8%.

Traga o final em cada tubo para quatro mililitros adicionando 700 microlitros de água deionizada. Tampe bem os tubos de vidro e incuba-os em um bloco de aquecimento ajustado para 95 graus Celsius por uma hora. Cubra os tubos com papel alumínio para evitar a condensação, remova os tubos do bloco e incube-os no gelo por 30 minutos.

Após a incubação, centrifugue as amostras e os padrões a 1.500 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Transfira 150 microlitros de sobrenadante de cada tubo para um poço em uma placa de 96 poços, removendo quaisquer bolhas de ar com a ponta da pipeta. Meça a absorbância das amostras em 532 nanômetros e, em seguida, subtraia a leitura média do absorvente das amostras em branco de todas as outras leituras dos absorventes.

Crie uma curva padrão e use-a para calcular concentrações de amostras desconhecidas. Curvas padrão de MDA bis dimetil acetol foram geradas para determinar os limites de detecção e sensibilidade do ensaio e os níveis de oxidação em três amostras biológicas diferentes. Um total de 9 ensaios TBARS foram realizados nas três amostras em dias diferentes.

Para determinar os limites de detecção, a absorbância das amostras em branco foi medida em três dias diferentes. A concentração mínima de substância TBARS necessária para fornecer um sinal não absorvente de ruído detectável é de 1,1 micromolar. E a sensibilidade do ensaio é de cerca de 0,0016 unidades absorventes por aumento micromolar na concentração.

O ensaio TBARS pode ser usado para detectar alterações na peroxidação lipídica de várias matrizes biológicas. Para demonstrar isso, dois cloretos de cobre foram usados para induzir a oxidação in vitro de lisados de células HEPG2 séricas humanas e lipoproteínas de baixa densidade. Um ensaio TBARS foi realizado em amostras de LDL contendo EDTA e os níveis de TBARS não mudaram entre as duas amostras de cobre tratadas e não tratadas de LDL.

No entanto, após a remoção do EDTA por filtração por spin, o LDL sofreu oxidação mediada por cobre dois. Para ilustrar a faixa dinâmica do ensaio TBARS no soro humano, uma concentração de dois íons milimolares de cobre foi adicionada às amostras, o que resultou em um aumento de seis a sete vezes no TBARS. Ao tentar este protocolo, não deixe as amostras no gelo por mais de 10 minutos e deixe-as em temperatura ambiente após a centrifugação.

Para lotes ou subconjuntos de bioespécimes que não foram originalmente coletados, processados e armazenados juntos, deve-se avaliar estatisticamente os dados para efeitos de lote para garantir que a oxidação artificial não contribuiu para os resultados. A oxidação invitro quantificável intencional da lipoproteína de baixa densidade torna possível entender como a oxidação afeta sua biologia funcional.