Mapeamento de alta resolução de interações proteína-DNA em neurônios derivados de células-tronco do rato usando Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

A principal vantagem do nosso método ChIP-exo é a resolução de mapeamento aprimorada das interações do DNA da proteína na célula em comparação com o método convencional de imunoprecipitação da cromatina. Para preparar grânulos magnéticos de proteína G para ChIP, misture os grânulos magnéticos até ficarem homogêneos. Em seguida, adicione 25 microlitros de esferas magnéticas a um tubo de baixa ligação de proteína de dois mililitros.

Adicione um mililitro de solução de bloqueio às contas. Misture bem pipetando e, em seguida, coloque o tubo em um rack magnético por um minuto. Quando o sobrenadante estiver claro, remova-o.

Em seguida, adicione um mililitro de solução de bloqueio às contas. Coloque o tubo em uma plataforma de balanço a quatro graus Celsius e balance por 10 minutos, depois gire brevemente o tubo. Coloque o tubo no rack magnético e remova o sobrenadante.

Adicione 500 microlitros de solução de bloqueio às esferas magnéticas. Gire brevemente o anticorpo contra Islet-1 e, em seguida, adicione quatro microgramas do anticorpo ao tubo que contém as esferas magnéticas. Coloque o tubo contendo contas magnéticas e anticorpo Islet-1 em uma plataforma de balanço a quatro graus Celsius e agite por seis a 24 horas.

Para iniciar a imunoprecipitação da cromatina, lave as esferas revestidas com anticorpos em um mililitro de solução de bloqueio. Colocar o tubo que contém os grânulos revestidos com anticorpos numa plataforma de balanço a quatro graus Celsius durante cinco minutos. Depois de girar brevemente, coloque o tubo em um rack magnético e remova o sobrenadante.

Ressuspenda os grânulos revestidos com anticorpos em 50 microlitros de solução de bloqueio. Adicione um mililitro de lisados sonicados aos grânulos revestidos com anticorpos e, em seguida, incube a amostra em uma plataforma de balanço a quatro graus Celsius durante a noite. Depois de permitir que a amostra incube durante a noite, colete o líquido da tampa girando brevemente o tubo e, em seguida, coloque-o em um rack magnético.

E após um minuto, remova o sobrenadante cuidadosamente com uma pipeta. Em seguida, execute uma série de lavagens da seguinte maneira. Adicionar um mililitro de tampão de lavagem a frio contendo CPI à amostra.

Misture a amostra em uma plataforma de balanço a quatro graus Celsius por cinco minutos. Gire brevemente o sample tubo e coloque em um rack magnético. Após um minuto, remova o sobrenadante com uma pipeta.

Para a primeira reação enzimática e reparo e rejeito DA, adicione 38 microlitros de água destilada dupla autoclavada à amostra e, em seguida, adicione a mistura de reação de preparação final e a mistura de enzimas de preparação final. Misture o conteúdo do tubo pipetando e, em seguida, incube a amostra a 20 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, lave os grânulos de amostra com tampão de lavagem com alto teor de sal, tampão de lavagem de cloreto de lítio e tampão de cloreto de hidrogênio Tris de 10 milimolares, conforme descrito anteriormente.

Para realizar a ligação do adaptador índice, adicione 27 microlitros de tampão frio de cloreto de hidrogênio Tris 10 milimolar à amostra. Em seguida, adicione o adaptador de índice, o intensificador de ligação e a mistura principal de ligase. Incubar a amostra a 20 graus Celsius por 15 minutos.

Novamente, lave os grânulos de amostra com tampão de lavagem com alto teor de sal, tampão de lavagem de cloreto de lítio e tampão de cloreto de hidrogênio Tris de 10 milimolares. Em seguida, adicione 47 microlitros de tampão frio de cloreto de hidrogênio Tris 10 milimolar à amostra. Para reparar o corte no DNA resultante da ligação fosfodiéster ausente, adicione 11,1 microlitros da mistura de preenchimento à amostra.

Incubar a amostra a 30 graus Celsius durante 20 minutos. Após uma série de lavagens, adicione 50 microlitros de água bidestilada autoclavada fria à amostra. Para digerir o DNA ChIP na direção de cinco a três primos, adicione tampão de exonuclease lambda e exonuclease lambda e misture a amostra por pipetagem.

Incubar a amostra a 37 graus Celsius durante 30 minutos. Após a conclusão da digestão, repita as três lavagens uma última vez. Para eluir a amostra de ChIP dos grânulos, ressuspenda a amostra em 75 microlitros de tampão de eluição de ChIP e incubadora a 65 graus Celsius por 15 minutos a 130 vezes G.Adicione 2,5 microlitros de 20 miligramas por mililitro de proteinase K à amostra.

Vortex a amostra brevemente e, em seguida, incube durante a noite a 65 graus Celsius. Gire brevemente a amostra e coloque-a em um rack magnético. Após um minuto, transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitros.

Purifique e elui o DNA. Depois de purificar o DNA eluído, transfira 16 microlitros da amostra de DNA extraída para um tubo de PCR. Adicione 1,2 microlitros de mistura de desnaturação e recozimento de primer à amostra.

Usando o programa descrito na tabela seis do manuscrito, desnature e recoza primers para o DNA modelo. Adicione três microlitros de mistura de extensão de primer à amostra e execute o programa de PCR descrito na tabela sete do manuscrito. Adicione 4,1 microlitros de mistura de rejeitos de DA à amostra e execute a amostra usando o programa de PCR na tabela oito do manuscrito.

Em seguida, adicione 21,5 microlitros de mistura de ligadura do adaptador universal à amostra e incube por 15 minutos a 20 graus Celsius. Adicione 29 microlitros de mistura LM-PCR à amostra e, em seguida, execute a amostra usando o programa da tabela 10 do manuscrito. Após 18 ciclos de LM-PCR, amostras de ChIP-exo de neurônios motores de camundongos foram eletroforesadas em um gel de 1,5% de agarose.

Os resultados para ChIP-exo Islet-1 mostraram bibliotecas de DNA amplificadas em torno de 200 a 400 pares de bases, indicando que as bibliotecas ChIP-exo foram amplificadas com sucesso por LM-PCR. A banda em torno de 100 pares de bases representa artefatos de adaptadores e primers de PCR. O controle sem anticorpos demonstra que o DNA de fundo inespecífico foi digerido pelo tratamento com exonuclease lambda.

Usando ChIP-exo e ChIP-seq, os locais ligados às ilhotas-1 foram identificados. O sinal ChIP-exo foi altamente focado nos locais de ligação das ilhotas-1, detectando vários padrões de ligação do fator de transcrição das ilhotas-1 agrupados. O sinal ChIP-seq exibiu sinais mais amplos, indicando que ChIP-exo tinha maior resolução de mapeamento do que ChIP-seq para Islet-1.

Vários fatores de transcrição geralmente se ligam ao DNA próximos uns dos outros como um complexo proteína-DNA. O ChIP-exo nos permite estudar como vários fatores de transcrição reconhecem e regulam o DNA alvo.