Modelos avançados de fígado 3D para testes de genotoxicidade in vitro após exposição nanomaterial de longo prazo

Este procedimento foi estabelecido para ser utilizado para o desenvolvimento de culturas hepáticas 3D avançadas in vitro, que podem fornecer uma avaliação mais fisiologicamente relevante dos perigos genotoxicos associados a exposições nanomateriais em regimes de dose aguda ou a longo prazo.

Este modelo Hep G2 fornece um sistema de teste in vitro alternativo relevante para avaliar de forma mais confiável a indução potencial de danos fixos ao DNA após exposição prolongada a nanomateriais, com o objetivo de minimizar a necessidade de testes em animais. O modelo esferóide Hep G2 possui a capacidade de permanecer viável e funcional por um período de 14 dias, bem como sustentar um nível adequado de proliferação. Isso apóia o teste de uma variedade de parâmetros bioquímicos e de genotoxicidade, incluindo o ensaio de micronúcleo.

Antes de tentar este protocolo, sugiro que você faça algumas corridas práticas primeiro. Tome cuidado ao semear ou trocar o meio de semeadura, pois isso requer uma abordagem delicada. Comece adicionando 100 microlitros de PBS estéril em temperatura ambiente aos poços de uma placa de cultura de 96 poços.

Inverta a tampa da placa e pipete cuidadosamente gotas de 20 microlitros da suspensão celular no centro de cada ranhura da tampa. Use uma pipeta multicanal, adicionando duas a quatro gotas de cada vez, para garantir a precisão da colocação. Semeie apenas quatro esteróides de cada vez e certifique-se de que as pontas da pipeta estejam todas alinhadas antes de começar.

O ângulo em que você segura o multicanal fará diferença na forma como os esferoides são formados. Certifique-se de que as gotas estejam centralizadas nas ranhuras dos poços na tampa e, em seguida, vire suavemente a tampa na parte superior da placa para que as gotas fiquem penduradas sobre os poços com PBS. Incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três dias antes da transferência do esferóide para a agarose.

Após a incubação, remova a placa da incubadora e levante cuidadosamente a tampa da placa, descarte o PBS, bata na placa para remover qualquer líquido residual e deixe as placas secarem ao ar por dois a três minutos. Depois de derreter a agarose, agite-a suavemente para remover as bolhas e adicione 50 microlitros na base de cada poço. Deixe a placa em temperatura ambiente por dois minutos e, em seguida, adicione 100 microlitros de DMEM pré-aquecido em cima da camada sólida de agarose em cada poço.

Coloque a tampa com essas gotículas esferóides de volta no topo da placa para que os esferóides fiquem pendurados novamente e, em seguida, centrifugue a placa por três minutos a 200 vezes G para transferir os esferóides para os poços individuais da placa. Incube a placa por mais 24 horas para permitir que os esferóides se assentem. Após a dispersão dos nanomateriais projetados, ou ENMs, dilua-os até a concentração final desejada com DMEM pré-aquecido.

Aspire 50 microlitros de meio de cada poço com os esferóides e substitua-o por 50 microlitros de meio com o ENM. Para colher os esferoides, use uma pipeta de 200 microlitros para aspirar os 100 microlitros de meio de cultura celular com o tecido esferóide de cada poço, tomando cuidado para evitar o contato com a agarose. Colete os esferóides em um tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros.

Centrifugar a suspensão esferóide a 230 vezes G durante cinco minutos, retirar o sobrenadante e conservá-lo a 80 graus Celsius negativos até uma análise mais aprofundada. Lave o pellet de esferóides em um mililitro de PBS estéril à temperatura ambiente, centrifugue-os a 230 vezes G por três minutos e descarte o sobrenadante. Ressuspenda os esferóides em 500 microlitros de solução de tripsina-EDTA a 0,05% e incube-os por seis a oito minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Após a incubação, pipete suavemente as células Hep G2 tripsinizadas para cima e para baixo para dissociá-las e ressuspendê-las completamente antes de neutralizá-las com um mililitro de DMEM. Centrifugue a suspensão celular a 230 vezes G por cinco minutos, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em dois mililitros de PBS. Para criar uma configuração de funil de cubeta, coloque a lâmina de microscópio preparada no suporte de metal, coloque um cartão de filtro em cima da lâmina e prenda o funil de cubeta em cima.

Disponha os funis de cubeta na citocentrífuga com o funil voltado para cima de modo que 100 microlitros de suspensão celular possam ser adicionados diretamente a cada um. Em seguida, prossiga com a fixação dos slides de acordo com as instruções do manuscrito. Prepare uma solução de coloração 20%Giemsa diluída em tampão fosfatase.

Pipete suavemente a solução para cima e para baixo para misturá-la e, em seguida, filtre-a com papel de filtro dobrado em um funil. Use uma pipeta Pasteur para adicionar três a cinco gotas de solução Giemsa filtrada ao citodoto em cada lâmina e deixe-a por oito a 10 minutos em temperatura ambiente. Lave as lâminas em duas lavagens sucessivas de tampão fosfatase.

Em seguida, enxágue-os brevemente em água fria para remover qualquer excesso de mancha e deixe-os secar ao ar. Antes de qualquer avaliação toxicológica in vitro, é importante verificar se os esferoides HepG2 3D se formaram corretamente. Quatro dias após a semeadura, esferoides compactos de formato esférico com superfície lisa e sem projeções visuais devem se formar.

Esferóides de boa e baixa qualidade quatro dias após a semeadura são demonstrados aqui. Normalmente, 90 a 95% dos esferóides formados por placa se formarão corretamente e serão viáveis para experimentação posterior. A viabilidade e a funcionalidade hepática foram avaliadas durante um período de cultura de 14 dias para determinar a longevidade do modelo esferóide hepático e estabelecer se ele poderia suportar ENM de longo prazo ou avaliação de risco baseada em produtos químicos.

A concentração de albumina permaneceu consistente durante o período de cultivo, enquanto a produção de uréia por esferóide aumentou antes de começar a cair no dia 14. Para avaliação da genotoxicidade, o ensaio de micronúcleos foi usado para determinar a presença de micronúcleos após exposições agudas e de longo prazo ao ENM. Os esferoides foram expostos a dois ENMs, dióxido de titânio e prata.

Uma tendência semelhante para genotoxicidade foi observada após a exposição aguda a ambos os ENMs, mas a resposta elevada à genotoxicidade não foi evidente após uma exposição prolongada de cinco dias. Seguindo este método, tanto o sobrenadante quanto os esferoides podem ser colhidos para uma infinidade de pontos finais bioquímicos. Isso inclui viabilidade celular, ensaios de função hepática, análise SID 450, marcadores inflamatórios fracos e expressão gênica.

Essa técnica está sendo testada em vários laboratórios de pesquisa contratados que desejam aplicá-la a testes de geotoxicidade de rotina de produtos químicos e nanomateriais. Isso tem o potencial de reduzir a dependência de abordagens de teste in vivo.