Modelos avançados de fígado 3D para testes de genotoxicidade in vitro após exposição nanomaterial de longo prazo
5 de junho de 2020
Este procedimento foi estabelecido para ser utilizado para o desenvolvimento de culturas hepáticas 3D avançadas in vitro, que podem fornecer uma avaliação mais fisiologicamente relevante dos perigos genotoxicos associados a exposições nanomateriais em regimes de dose aguda ou a longo prazo.
Este modelo Hep G2 fornece um sistema de teste in vitro alternativo relevante para avaliar de forma mais confiável a indução potencial de danos fixos ao DNA após exposição prolongada a nanomateriais, com o objetivo de minimizar a necessidade de testes em animais. O modelo esferóide Hep G2 possui a capacidade de permanecer viável e funcional por um período de 14 dias, bem como sustentar um nível adequado de proliferação. Isso apóia o teste de uma variedade de parâmetros bioquímicos e de genotoxicidade, incluindo o ensaio de micronúcleo.
Antes de tentar este protocolo, sugiro que você faça algumas corridas práticas primeiro. Tome cuidado ao semear ou trocar o meio de semeadura, pois isso requer uma abordagem delicada. Comece adicionando 100 microlitros de PBS estéril em temperatura ambiente aos poços de uma placa de cultura de 96 poços.
Inverta a tampa da placa e pipete cuidadosamente gotas de 20 microlitros da suspensão celular no centro de cada ranhura da tampa. Use uma pipeta multicanal, adicionando duas a quatro gotas de cada vez, para garantir a precisão da colocação. Semeie apenas quatro esteróides de cada vez e certifique-se de que as pontas da pipeta estejam todas alinhadas antes de começar.
O ângulo em que você segura o multicanal fará diferença na forma como os esferoides são formados. Certifique-se de que as gotas estejam centralizadas nas ranhuras dos poços na tampa e, em seguida, vire suavemente a tampa na parte superior da placa para que as gotas fiquem penduradas sobre os poços com PBS. Incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três dias antes da transferência do esferóide para a agarose.
Após a incubação, remova a placa da incubadora e levante cuidadosamente a tampa da placa, descarte o PBS, bata na placa para remover qualquer líquido residual e deixe as placas secarem ao ar por dois a três minutos. Depois de derreter a agarose, agite-a suavemente para remover as bolhas e adicione 50 microlitros na base de cada poço. Deixe a placa em temperatura ambiente por dois minutos e, em seguida, adicione 100 microlitros de DMEM pré-aquecido em cima da camada sólida de agarose em cada poço.
Coloque a tampa com essas gotículas esferóides de volta no topo da placa para que os esferóides fiquem pendurados novamente e, em seguida, centrifugue a placa por três minutos a 200 vezes G para transferir os esferóides para os poços individuais da placa. Incube a placa por mais 24 horas para permitir que os esferóides se assentem. Após a dispersão dos nanomateriais projetados, ou ENMs, dilua-os até a concentração final desejada com DMEM pré-aquecido.
Aspire 50 microlitros de meio de cada poço com os esferóides e substitua-o por 50 microlitros de meio com o ENM. Para colher os esferoides, use uma pipeta de 200 microlitros para aspirar os 100 microlitros de meio de cultura celular com o tecido esferóide de cada poço, tomando cuidado para evitar o contato com a agarose. Colete os esferóides em um tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros.
Centrifugar a suspensão esferóide a 230 vezes G durante cinco minutos, retirar o sobrenadante e conservá-lo a 80 graus Celsius negativos até uma análise mais aprofundada. Lave o pellet de esferóides em um mililitro de PBS estéril à temperatura ambiente, centrifugue-os a 230 vezes G por três minutos e descarte o sobrenadante. Ressuspenda os esferóides em 500 microlitros de solução de tripsina-EDTA a 0,05% e incube-os por seis a oito minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Após a incubação, pipete suavemente as células Hep G2 tripsinizadas para cima e para baixo para dissociá-las e ressuspendê-las completamente antes de neutralizá-las com um mililitro de DMEM. Centrifugue a suspensão celular a 230 vezes G por cinco minutos, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em dois mililitros de PBS. Para criar uma configuração de funil de cubeta, coloque a lâmina de microscópio preparada no suporte de metal, coloque um cartão de filtro em cima da lâmina e prenda o funil de cubeta em cima.
Disponha os funis de cubeta na citocentrífuga com o funil voltado para cima de modo que 100 microlitros de suspensão celular possam ser adicionados diretamente a cada um. Em seguida, prossiga com a fixação dos slides de acordo com as instruções do manuscrito. Prepare uma solução de coloração 20%Giemsa diluída em tampão fosfatase.
Pipete suavemente a solução para cima e para baixo para misturá-la e, em seguida, filtre-a com papel de filtro dobrado em um funil. Use uma pipeta Pasteur para adicionar três a cinco gotas de solução Giemsa filtrada ao citodoto em cada lâmina e deixe-a por oito a 10 minutos em temperatura ambiente. Lave as lâminas em duas lavagens sucessivas de tampão fosfatase.
Em seguida, enxágue-os brevemente em água fria para remover qualquer excesso de mancha e deixe-os secar ao ar. Antes de qualquer avaliação toxicológica in vitro, é importante verificar se os esferoides HepG2 3D se formaram corretamente. Quatro dias após a semeadura, esferoides compactos de formato esférico com superfície lisa e sem projeções visuais devem se formar.
Esferóides de boa e baixa qualidade quatro dias após a semeadura são demonstrados aqui. Normalmente, 90 a 95% dos esferóides formados por placa se formarão corretamente e serão viáveis para experimentação posterior. A viabilidade e a funcionalidade hepática foram avaliadas durante um período de cultura de 14 dias para determinar a longevidade do modelo esferóide hepático e estabelecer se ele poderia suportar ENM de longo prazo ou avaliação de risco baseada em produtos químicos.
A concentração de albumina permaneceu consistente durante o período de cultivo, enquanto a produção de uréia por esferóide aumentou antes de começar a cair no dia 14. Para avaliação da genotoxicidade, o ensaio de micronúcleos foi usado para determinar a presença de micronúcleos após exposições agudas e de longo prazo ao ENM. Os esferoides foram expostos a dois ENMs, dióxido de titânio e prata.
Uma tendência semelhante para genotoxicidade foi observada após a exposição aguda a ambos os ENMs, mas a resposta elevada à genotoxicidade não foi evidente após uma exposição prolongada de cinco dias. Seguindo este método, tanto o sobrenadante quanto os esferoides podem ser colhidos para uma infinidade de pontos finais bioquímicos. Isso inclui viabilidade celular, ensaios de função hepática, análise SID 450, marcadores inflamatórios fracos e expressão gênica.
Essa técnica está sendo testada em vários laboratórios de pesquisa contratados que desejam aplicá-la a testes de geotoxicidade de rotina de produtos químicos e nanomateriais. Isso tem o potencial de reduzir a dependência de abordagens de teste in vivo.
Visão Geral
Este estudo apresenta um modelo de esferoide tridimensional de Hep G2 para testes in vitro de genotoxicidade relacionada à exposição a nanomateriais. O modelo tem como objetivo reduzir os testes em animais ao fornecer uma avaliação confiável de danos ao DNA ao longo de períodos prolongados.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biotecnologia
- Toxicologia
Contexto
- O modelo de esferoide Hep G2 mimetiza a funcionalidade e viabilidade hepáticas.
- Ele permite cultura de longo prazo e avaliação de parâmetros bioquímicos.
- Os testes de genotoxicidade são cruciais para avaliar a segurança de nanomateriais.
- A redução da dependência de modelos animais é uma consideração ética significativa.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um sistema de cultura hepática tridimensional para avaliação de riscos genotóxicos.
- Avaliar os efeitos de nanomateriais sobre a integridade do DNA.
- Estabelecer um modelo in vitro confiável para estudos de exposição de longo prazo.
Métodos Utilizados
- Placamento de células Hep G2 em uma placa de 96 poços para formar esferoides.
- Incubação dos esferoides em condições controladas.
- Exposição a nanomateriais projetados (NMPs) para avaliação de genotoxicidade.
- Ensaio de micronúcleo para avaliar danos ao DNA.
Resultados Principais
- Os esferoides mantiveram viabilidade e funcionalidade por 14 dias.
- O ensaio de micronúcleo indicou genotoxicidade após exposição aguda a MNs.
- A exposição de longo prazo mostrou respostas genotóxicas variadas.
- Os parâmetros bioquímicos foram avaliados com sucesso a partir dos esferoides colhidos.
Conclusões
- O modelo de esferoides 3D de Hep G2 é eficaz para testes de genotoxicidade.
- Esse modelo pode minimizar a necessidade de testes em animais nas avaliações de segurança.
- São necessários mais estudos para explorar as implicações da exposição a MNs.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Modelos hepáticos 3D avançados atendem à necessidade crítica de sistemas preditivos in vitro para avaliar genotoxicidade após exposição prolongada a nanomateriais, reduzindo a dependência de testes em animais. O modelo de esferoides HepG2 permite cultivo prolongado por até 14 dias, possibilitando regimes de exposição repetidos e avaliação de danos ao DNA por meio do ensaio de micronúcleo. Essa abordagem aprimora a desmistificação mecanicista na descoberta precoce, fornecendo dados fisiologicamente relevantes sobre atividade metabólica hepática e pontos finais toxicológicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas à genotoxicidade induzida por nanomateriais em um contexto relevante para o fígado.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica por meio da viabilidade sustentada e da capacidade proliferativa ao longo de 14 dias.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança na validação de alvos ao correlacionar a exposição a nanomateriais com a avaliação de danos fixos ao DNA.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem de genotoxicidade utilizando o ensaio de micronúcleo.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade do ensaio por meio da formação consistente de esferoides (diâmetro ≤500 μm).
- Escalabilidade: Facilita a reutilização da plataforma para regimes de exposição aguda (24 h) e de longo prazo (120 h) com múltiplos nanomateriais projetados.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Mantém funcionalidade semelhante à do fígado (produção de albumina e ureia) para conectar achados in vitro à relevância in vivo.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite a avaliação de uma variedade de desfechos toxicológicos (citotoxicidade, inflamação, expressão gênica) para orientar decisões de prosseguimento ou interrupção.
- Redução de Riscos Mecanística: Esclarece respostas genotípicas dependentes de dose e tempo após exposição a nanomateriais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O modelo de esferoides 3D de HepG2 integra-se ao contínuo de descoberta, desde a validação inicial de alvos até a triagem pré-clínica, apoiando fluxos de trabalho de avaliação de riscos para nanomateriais e produtos químicos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre danos ao DNA induzidos por nanomateriais por meio de leituras de micronúcleos.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis para pontos finais genotóxicos e bioquímicos após exposição.
- Análises: Permite a comparação entre os efeitos da exposição aguda e de longo prazo na integridade do DNA e na função hepática.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro à continuidade pré-clínica por meio da atividade metabólica sustentada.
- Reutilização Empresarial: Oferece um sistema escalável e economicamente eficiente para testes de rotina de genotoxicidade em ambientes de pesquisa contratada.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na avaliação de genotoxicidade, redução da ambiguidade mecanicista na caracterização da segurança de nanomateriais.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e capacidade de cultivo prolongado (≤14 dias) para estudos de exposição repetida.
- Valor Estratégico: Decisões de avanço ou interrupção mais precisas, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados do desenvolvimento de nanomateriais.
- Impacto sobre o Portfólio: Priorização ajustada ao risco com base em dados de genotoxicidade e função hepática obtidos em diferentes durações de exposição.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em cultura celular tridimensional, formação de esferoides e execução do ensaio de micronúcleos.
- Depende de instrumentação para centrifugação, citocentrifugação e incubação controlada (37 °C, 5% de CO₂).
- Necessita padronização entre equipes no controle de qualidade dos esferoides (padrão de viabilidade de 90–95%).
- As considerações para adaptação incluem as propriedades variáveis dos nanomateriais e a compatibilidade com os meios de exposição.
- As limitações práticas incluem a necessidade de manipulação cuidadosa do meio durante as etapas de transferência dos esferoides e inclusão em agarose.
