Name: Ensaio fluorométrico baseado em química de cliques para apolipoproteína N-aciltransferase da caracterização enzimática à triagem de alto rendimento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Aprenda um ensaio fluorométrico por química de cliques para caracterizar a apolipoproteína N-aciltransferase bacteriana e triar inibidores em formato de alto rendimento. Este método sensível contribui para o desenvolvimento de novos antibióticos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Fabrice Agou e Alix Boucharlat da Plataforma de Triagem Quimiogenômica e Biológica, Centro de Recursos Tecnológicos e Pesquisa (C2RT) do Institut Pasteur Paris por sugestões úteis sobre o protocolo, a todos os membros da Unidade BGPB por apoio e discussões científicas e a Simon Legood pela leitura crítica do manuscrito. O trabalho foi financiado pelas Iniciativas de Cuidados Globais do Instituto Carnot Doenças Infecciosas e do Instituto Carnot Micróbios e Saúde (15 CARN 0017-01 e 16 CARN 0023-01).

1. Preparação de enzimas e substratos
<ol><li>Purificação da enzima
	<ol><li>Produzir e purificar a enzima Lnt a partir de membranas solubilizadas em detergente, conforme descrito anteriormente 4,8. Resumidamente, induzir a expressão do gene lnt-strep, codificando Lnt com uma etiqueta Strep C-terminal, a OD 600 de 0,6 com tetraciclina anidra (200 ng/mL) a 37 °C por 16 h.</li>
		<li>Colher as células por centrifugação a 4.000 x g durante 10 min e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspeite o pellet celular em buffer WA (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) para 100 OD600 unidades por mL.</li>
		<li>Quebre as células por duas passagens através de uma prensa de células de pressão francesa a 10.000 psi.</li>
		<li>Remova células ininterruptas e detritos por centrifugação a 13.000 x g por 20 min. Mantenha o sobrenadante e descarte o pellet.</li>
		<li>Centrifugar o sobrenadante a 120.000 x g durante 60 min e recolher as vesículas da membrana (pellet de cor castanha translúcida). Descarte o sobrenadante.</li>
		<li>Solubilizar as proteínas integrais da membrana do pellet de membrana com 1% (p/v) de n-dodecil β-D-maltosídeo (DDM) em tampão WA por 30 min à temperatura ambiente (RT). Centrifugar e remover o material insolubilizado a 120.000 x g durante 30 min. Use a fração sobrenadante para purificação.</li>
		<li>Purificar o estreptococo Lnt numa coluna de cromatografia de afinidade (ver Tabela de Materiais) e numa coluna de filtração em gel S400 (ver Tabela de Materiais), conforme descrito por Nozeret et al.8.</li>
		<li>Conservar a enzima purificada em tampão WA contendo 0,05% de DDM e 10% de glicerol a -80 °C. NOTA: A enzima é estável por mais de 5 anos.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de substratos alcinofosfolipídicos e ligantes estimuladores de fibroblastos biotinilados (FSL-1-biotina)
	<ol><li>Alíquota de 100 μL de alquino-PAPA sintetizado sob medida (1-hexadec-15-ynoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, ver Tabela de Materiais) solubilizado em clorofórmio em tubos de 1,5 mL.</li>
		<li>Perfure os tubos com uma seringa e evapore o clorofórmio numa cápsula de velocidade a RT durante 2 h. Conservar as amostras de fosfolipídios secos a -20 °C.</li>
		<li>Dissolva o alquino-PAPA em 0,1% de Triton X-100 a 500 μM antes do uso. Adicione uma etapa de sonicação de 3 minutos em um banho de água ultra-sônico no RT para solubilizar o alquino-PAPE, se necessário.</li>
		<li>Resuspender FSL-1-biotina em água a 445 μM. NOTA: Ambas as soluções podem ser armazenadas a -20 °C durante, pelo menos, 2 meses.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Ensaio do tubo
NOTA: No Dia 1, configure a reação de Lnt em tubos de 1,5 mL (etapa 2.1) e cubra as placas de 96 poços com estreptavidina (etapa 2.2).
<ol><li>Preparação de mistura de reagentes e reação enzimática
	<ol><li>Para um ensaio Lnt padrão, misture alquino-PAPE (50 μM final do estoque de 500 μM) e FSL-1-biotina (concentração final de 50 μM de um estoque de 445 μM) em tampão de reação Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 contendo 1% BSA) a um volume final de 18 μL em tubos de 1,5 mL. Executar todas as condições em triplicado.</li>
		<li>Sonicar a mistura de substrato (preparada na etapa 2.1.1) durante 3 minutos num banho-maria ultra-sónico e incubar a 37 °C durante 5 min antes da adição da enzima Lnt (etapa 2.1.3). NOTA: MTSES (2-sulfonatoetil)metanoetiossulfonato), um reagente específico do tiol, inibe o Lnt8. Adicionar 10 mM MTSES (solução-mãe de 100 mM em DMSO a 100%) aos tubos de reacção (passo 2.1.1) a utilizar como amostras de controlo negativo. Ajuste o volume do tampão de reação Lnt de modo que o volume total seja de 18 μL.</li>
		<li>Adicionar Lnt ativo (1 ng/μL, correspondente a 17,2 nM) ou inativo (C387S) (2 μL de 10 ng/μL em buffer WA contendo 0,05% DDM) e misturar com os substratos (etapa 2.1.2) pipetando para cima e para baixo.</li>
		<li>Incubar a reacção a 37 °C durante 16 h numa termineira com tampa aquecida.</li>
	</ol></li>
	<li>Revestimento de estreptavidina de 96 placas de poço
	<ol><li>Preparar uma solução-mãe de estreptavidina a 2 mg/ml em H2O. NOTA: Esta solução pode ser armazenada a -20 °C até 6 meses.</li>
		<li>A partir da solução-mãe, preparar 10 μg/ml de estreptavidina em água como solução de trabalho. Adicionar 100 μL da solução a cada alvéolo da placa de 96 alvéolos. Ligar a estreptavidina à placa incubando a 37 °C durante a noite sem tampa para secar os poços ao ar.</li>
	</ol></li>
</ol>NOTA: No Dia 2, execute a química de cliques (etapa 2.3), ligue a mistura de reação de Lnt a placas revestidas com estreptavidina (etapa 2.4) e detecte a fluorescência e analise os resultados (etapa 2.5).
<ol start="3"><li>Reação de click-chemistry
	<ol><li>Preparar soluções-mãe de Azido-FAM (5 mM em DMSO), TCEP (cloridrato de Tris(2-carboxietil)fosfina; 50 mM preparado em água), TBTA (Tris[(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina; 2 mM em tert-butanol:DMSO (4:1)) e CuSO4∙5H 2 O (50 mM preparados na hora em H2O).</li>
		<li>Nos tubos de 1,5 mL contendo a mistura de reação Lnt preparada na etapa 2.1.4, realizar click-chemistry adicionando os reagentes na seguinte ordem: 0,2 μL de estoque Azido-FAM (concentração final 50 μM), 0,4 μL de estoque TCEP (concentração final 1 mM), 0,2 μL de estoque TBTA (concentração final 0,02 mM).</li>
		<li>Vórtice a solução para 5 s. Em seguida, adicione 0,4 μL de CuSO4 de estoque (concentração final de 1 mM). Vórtice novamente por 5 s. Incubar as amostras no escuro no RT por 1 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Ligação da mistura de reação de Lnt a placas revestidas de estreptavidina
	<ol><li>Lavar os poços das placas revestidas com estreptavidina após a incubação durante a noite a partir da etapa 2.2.2 3x com 200 μL de PBS-T1 (PBS contendo 0,05% Tween-20). NOTA: As placas de estreptavidina podem ser utilizadas imediatamente ou armazenadas secas a 4 °C.</li>
		<li>Transferir 18 μL da mistura click-chemistry da etapa 2.3.3 para um poço em uma placa revestida com estreptavidina de 96 poços e adicionar 100 μL de PBS-T1 para ligar o produto N-acil-FSL-1-biotina-FAM às placas de estreptavidina.</li>
		<li>Use biotina-fluoresceína (0,26 μM de um estoque de 3,1 mM em DMSO) como controle positivo para ligação de estreptavidina e leitura de fluorescência.</li>
		<li>Incubar as placas no RT por 1 h no escuro em um termifrê, agitando a 300 rpm.</li>
		<li>Execute as etapas de lavagem manual das placas de 96 poços com uma pipeta eletrônica multicanal da seguinte forma: seis lavagens com 200 μL de PBS-T2 (PBS contendo 1% de Tween-20), três lavagens com uma pipeta, três lavagens com 200 μL de PBS, três lavagens com uma pipeta.</li>
	</ol></li>
	<li>Detecção e análise de fluorescência
	<ol><li>Adicione 200 μL de PBS e registre a fluorescência a 520 nm em um leitor de microplacas de fluorescência. Salve os resultados em um software de planilha. NOTA: A biotina-fluoresceína é usada como um controle positivo para a ligação da estreptavidina e detecção de fluorescência a 520 nm. Espera-se uma leitura reprodutível de 30.000–40.000 U.A. com biotina-fluoresceína de 0,26 μM. Todas as amostras são analisadas em triplicata, incluindo os controles.</li>
		<li>Calcular o desvio padrão para cada reação e calcular os valores de P para controles negativos e amostras positivas usando o teste t não emparelhado usando um software estatístico.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Ensaio de placa multipoço
NOTA: No dia 1 configurar a reacção Lnt em placas de 384 poços (passo 3.1) e revestir 384 placas de poço com estreptavidina (passo 3.2).
<ol><li>Preparação de mistura de reagentes e reação enzimática NOTA: A quantidade de reagentes e enzima é reduzida em comparação com o ensaio do tubo e a reação de Lnt é realizada diretamente em placas de 384 poços. Isso permite o uso de menos material e uma redução de etapas que podem ser ainda mais automatizadas.<ol><li>Misture os substratos da seguinte forma: alquino-PAPE (concentração final de 50 μM do estoque de 500 μM) e FSL-1-biotina (50 μM final do estoque de 500 μM) em tampão de reação Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 contendo 1% BSA) a um volume de 13,5 μL por reação por poço em um formato de placa de 384 poços. Executar todas as condições em triplicado. Calcule a quantidade total de reagentes necessários para o número de reações a serem realizadas (ou seja, 5.184 μL para uma placa de 384 poços).</li>
		<li>Sonicate a mistura de substrato por 3 minutos em um banho de água ultra-sônico.</li>
		<li>Alíquota 13,5 μL da mistura de substrato por poço em uma placa de 384 poços. NOTA: Como um controle negativo, 10 mM de MTSES (solução de estoque de 625 mM em 100% DMSO) podem ser adicionados por poço. Ajustar o volume do tampão Lnt (passo 3.1.1) para atingir um volume de reacção final de 13,5 μL.</li>
		<li>Incubar a 37 °C durante 5 minutos antes da adição da enzima Lnt (etapa 3.1.5).</li>
		<li>Adicionar 0,5 ng/μL (correspondente a 8,6 nM) da enzima Lnt ativa, ou variante inativa (C387S) (1,5 μL do estoque de 5 ng/μL em buffer WA contendo 0,05% DDM) no tampão de reação Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 1% BSA) a cada poço contendo a mistura de reação da etapa 3.1.3. Misture os reagentes pipetando para cima e para baixo. O volume total de reação é de 15 μL.</li>
		<li>Sele a placa com folha de plástico para placas de vários poços.</li>
		<li>Incubar a 37 °C durante 16 h numa termineira com tampa aquecida.</li>
	</ol></li>
	<li>Revestimento de estreptavidina 384 placas de poço<ol><li>Use 75 μL de estreptavidina (10 μg/mL em H 2 O) daetapa 2.2.2 para revestir poços de uma placa de 384 poços. Deixar a estreptavidina ligar-se à placa incubando a 37 °C durante a noite sem tampa para secar os poços ao ar.</li>
	</ol></li>
</ol>NOTA: No dia 2, execute a química de cliques (etapa 3.3), ligue a mistura de reação de Lnt a placas revestidas com treptavidina (etapa 3.4), detecte a fluorescência e analise os resultados (etapa 3.5).
<ol start="3"><li>Reação de click-chemistry<ol><li>Preparar soluções-mãe de Azido-FAM (1,2 mM em DMSO), TCEP (cloridrato de fosfina tris(2-carboxietil); 24 mM preparado em H 2 O), TBTA (Tris[(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina; 0,48 mM em tert-butanol:DMSO (4:1)) e CuSO4∙5H 2 O (24 mM preparados na hora em H2O).</li>
		<li>Combine os três reagentes de click-chemistry: uma mistura de Azido-FAM (concentração final de 50 μM), TCEP (1 mM final) e TBTA (0,02 mM final), cada um a 0,75 μL em volume final de 2,25 μL por poço. Calcule o volume necessário por placa de 384 poços (ou seja, use 864 μL quando todos os poços da placa de 384 poços forem usados). Misture vigorosamente.</li>
		<li>Adicionar 2,25 μL da solução reagente por alvéolo directamente à reacção Lnt concluída na placa de 384 alvéolos da fase 3.1.7.</li>
		<li>Misture pipetando para cima e para baixo com uma pipeta eletrônica multicanal.</li>
		<li>Adicione CuSO4 (0,75 μL do estoque de 24 mM para uma concentração final de 1 mM) e misture pipetando para cima e para baixo com uma pipeta eletrônica multicanal.</li>
		<li>Incubar no RT por 1 h no escuro.</li>
	</ol></li>
	<li>Ligação da mistura de reação de Lnt a placas de 384 poços revestidas com estreptavidina
	<ol><li>Lavar os poços das placas revestidas com estreptavidina após a incubação durante a noite a partir do passo 3.2.1 1x com 85 μL PBS-T1.</li>
		<li>Transferir 11 μL da reacção click-chemistry de cada alvéolo da placa de incubação do passo 3.3.6 para a placa revestida de estreptavidina a partir do passo 3.4.1 para ligar o produto N-acil-FSL-1-biotina-FAM às placas de estreptavidina.</li>
		<li>Adicione 64 μL de buffer PBS-T1.</li>
		<li>Incluir biotina-fluoresceína (0,19 μM de um estoque de 3,1 mM em DMSO) como um controle para ligação a poços revestidos com estreptavidina.</li>
		<li>Incubar as placas de 384 poços em RT por 1 h no escuro em uma termificante, agitando a 300 rpm.</li>
		<li>Lave as placas usando uma lavadora de placas automatizada da seguinte forma: 10 lavagens com 85 μL PBS-T2, as placas são agitadas entre as lavagens; 5 lavagens com PBS de 85 μL, as placas são agitadas entre as lavagens.</li>
	</ol></li>
	<li>Detecção e análise de fluorescência
	<ol><li>Adicionar PBS (85 μL) e registrar a fluorescência em um leitor de microplacas de fluorescência a 535 nm.</li>
		<li>Analise os dados conforme descrito (etapa 2.5.2).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanism+of+bacterial+lipoprotein+modification--how%2C+when+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why.</a> FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).</li>
<li>Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoproteins+of+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Lipoproteins of bacterial pathogens.</a> Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).</li>
<li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+fatty+acids+from+the+1-position+of+phosphatidylethanolamine+to+the+major+outer+membrane+lipoprotein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).</li>
<li>Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+phospholipid+specificity+of+apolipoprotein+N-acyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).</li>
<li>Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Visualization+and+Large-Scale+Profiling+of+Bacterial+Lipoproteins+with+Chemical+Reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters.</a> Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).</li>
<li>Thiele, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+fatty+acid+metabolism+by+click-chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry.</a> ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).</li>
<li>Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click-Chemistry+Based+High+Throughput+Screening+Platform+for+Modulators+of+Ras+Palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation.</a> Science Reports. 7, 41147(2017).</li>
<li>Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+fluorescence-based+assay+to+monitor+enzymatic+activity+of+the+essential+integral+membrane+protein+Apolipoprotein+N-acyltransferase+%28Lnt%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt).</a> Science Reports. 9 (1), 15978(2019).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecules+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Mao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+E.+coli+lipoprotein+diacylglyceryl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase.</a> Nature Communication. 7, 10198(2016).</li>
<li>Vogeley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+lipoprotein+signal+peptidase+II+action+and+inhibition+by+the+antibiotic+globomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin.</a> Science. 351 (6275), 876-880 (2016).</li>
<li>Wiktor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+mechanism+of+the+membrane+integral+N-acyltransferase+step+in+bacterial+lipoprotein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis.</a> Nature Communication. 8, 15952(2017).</li>
<li>Noland, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+lipoprotein+N-acylation+by+Escherichia+coli+apolipoprotein+N-acyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).</li>
<li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+E.+coli+apolipoprotein+N-acyl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase.</a> Nature Communication. 8, 15948(2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo para o ensaio de Lnt aqui descrito, baseado na detecção de fluorescência do produto triacilado, é sensível e reprodutível. A ligação específica e eficiente da biotina à estreptavidina é um elemento-chave no ensaio. O substrato Alquino-PAPA deixado após a conclusão da reação Lnt também é marcado fluorescentemente com FAME, mas é eficientemente removido após a ligação às placas de estreptavidina por várias etapas de lavagem. Além disso, a adição de DMSO não afeta a atividade de Lnt e não tem impacto no ensaio. ...

As lipoproteínas bacterianas são caracterizadas por ácidos graxos covalentemente ligados em seus amino-termini através dos quais são ancoradas em membranas 1,2. A parte madura da proteína é altamente diversificada em estrutura e função, explicando assim o papel das lipoproteínas em vários processos biológicos no envelope celular bacteriano.
As lipoproteínas são modificadas por ácidos graxos derivados de fosfolipídios após a inserção na membrana citoplasmática. As prolipoproteínas contêm um motivo de assinatura, a lipocaixa, que contém um resíduo de cisteína invariante que se torna acilado e o primeiro aminoácido na proteína madura. O primeiro passo desta via é catalisado pela prolipoproteína fosfatidilglicerol::d iacylglyceryl transferase (Lgt), que transfere o grupo diacilgliceril do fosfatidilglicerol para a prolipoproteína através de uma ligação tioéter entre diacilgliceril e cisteína. A peptidase de sinal II (Lsp) cliva o peptídeo de sinal da prolipoproteína diacilglicerila, resultando em uma apolipoproteína que é ancorada na membrana através de sua porção diacilgliceril. A terceira e última etapa é catalisada pela apolipoproteína N-aciltransferase (Lnt), que adiciona um ácido graxo da posição sn-1 do fosfolipídeo à apolipoproteína, resultando em lipoproteína madura triacilada (Figura 1)3. A reação Lnt é uma reação de pingue-pongue de duas etapas onde um intermediário estável da enzima tioéster acila é formado. O subproduto lisofosfolipídio é liberado antes da acilação do substrato apolipoprotéico na segunda etapa da reação.
A especificidade do substrato fosfolipídico é determinada em um ensaio de Lnt com base no deslocamento de mobilidade do peptídeo N-acilo diacilglicerilo em uma alta porcentagem de ureia Tris-Tritrina SDS-PAGE4. Fosfolipídios com pequenos grupos polares, saturados [sn-1] e não saturados [sn-2], foram substratos preferenciais 4. O ensaio de deslocamento de gel não é apropriado para estudos cinéticos extensivos da apolipoproteína N-aciltransferase nem para a HTS identificar moléculas inibitórias. A química do clique usando ácidos graxos alquinos tem sido usada com sucesso para estudar a modificação de lipoproteínas em bactérias5 e o metabolismo de ácidos graxos em eucariotas6. Recentemente, um ensaio in vitro de palmitoilação de Ras foi relatado para identificar inibidores7.
No método descrito aqui, o Lnt ativo purificado em detergente é incubado com substratos em micelas mistas para formar peptídeo alquino-triacilado que é subsequentemente detectado por espectrometria de fluorescência.

<table><tbody><tr><td>&Auml; Sistema FPLC Purificador</td><td>kta GE Healthcare</td><td>NA</td><td>Pureza: NA Purificação</td></tr><tr><td>Lnt alcino-POPE</td><td>Avanti Lipídios Polares</td><td>900414P</td><td>Pureza: >99% Substrato Lnt</td></tr><tr><td>Azido-FAM</td><td>Lumiprobe</td><td>A4130</td><td>Pureza: 100% (puro) Reagente Click</td></tr><tr><td>Biofotômetro Plus</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Pureza: NA OD 600 nm</td></tr><tr><td>BioTek ELX 405 Selecione a arruela de placas</td><td>BioTek</td><td>N&deg; série 115800, n&deg; material 405 Selecione</td><td>a pureza: NA Etapas de lavagem</td></tr><tr><td>biotina-fluoresceína</td><td>Sigma</td><td>53608</td><td>Pureza: &ge; 90% Controle de fluorescência</td></tr><tr><td>Sulfato de cobre(II) pentahidratado</td><td>Sigma</td><td>C3036</td><td>Pureza: &ge; 98% Clique no reagente</td></tr><tr><td>DDM</td><td>Anatrace</td><td>D310A</td><td>Pureza: &ge; 99% &beta;+&alpha;; < 15% &alpha; Detergente para purificação de Lnt</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Invitrogen</td><td>D12435</td><td>Pureza: anidro Solbilização Reagente de clique</td></tr><tr><td>Pipeta eletrônica Voyager 8 canais 0,5-12,5 uL</td><td>INTEGRA</td><td>4721</td><td>Pureza: NA Manuseio de reagentes</td></tr><tr><td>Célula de pressão francesa</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Pureza: NA Ruptura celular</td></tr><tr><td>FSL-1-biotina</td><td>Microcoleções EMC</td><td>L7030</td><td>Pureza: substrato NA Lnt</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One Microplaca de poliestireno CELLSTAR padrão de 384 poços</td><td>Greiner</td><td>781091</td><td>Pureza: NA Preto com fundo transparente (leitura para cima ou para baixo)</td></tr><tr><td>Placa de poliestireno estéril Greiner Bio-One de 96 poços, 655097 de alta ligação</td><td>Pureza</td><td></td><td>: NA Preto com fundo transparente (leitura para cima ou para baixo)</td></tr><tr><td>Leitor de microplacas Infinite M1000 pro</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Pureza: NA Detecção de fluorescência</td></tr><tr><td>MTSES (sódio (2-sulfonatoetil)metantiossulfonato)Anatrace</td><td></td> <td>S110MT</td><td>Pureza: ~100% Inibidor específico de tiol</td></tr><tr><td>Folhas de vedação adesiva opticamente transparentes</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1170</td><td>Pureza: NA Folha para selar placa multipoços</td></tr><tr><td>Sephacryl S400 HR 16/60 gel coluna de filtração</td><td>GE Healthcare</td><td>GE28-9356-04</td><td>Pureza: NA Lnt purificação</td></tr><tr><td>StrepTactin Sepharose 50 %</td><td>IBA Biotechnology</td><td>2-1201-010</td><td>Pureza: NA Lnt purificação</td></tr><tr><td>streptavidin</td><td>Sigma</td><td>S4762-1MG</td><td>Pureza: &ge; 13 unidades/mg de proteína Ligação à biotina</td></tr><tr><td>TBTA (tris[(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina</td><td>Sigma</td><td>678937</td><td>Pureza: 97% Clique no reagente</td></tr><tr><td>TCEP (cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina</td><td>Sigma</td><td>75259</td><td>Pureza: &ge; 98% Reagente de clique</td></tr><tr><td>TECAN Infinite F500</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Pureza: NA Detecção de fluorescência</td></tr><tr><td>TECAN Infinite M1000 pro</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Pureza: NA Detecção de fluorescência</td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Pureza: NA Tampa aquecida</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td>Pureza: 10% em H2O Tampão de reação Lnt</td></tr><tr><td>Ultra centrífuga</td><td>Beckman LC</td><td>N/A</td><td>Pureza: NA Fracionamento celular</td></tr></tbody></table>

ensaio fluorométrico baseado em química de cliques para apolipoproteína n-aciltransferase da caracterização enzimática à triagem de alto rendimento

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

As lipoproteínas de proteobactérias são modificadas pós-translacionalmente por ácidos graxos derivados de fosfolipídios de membrana pela ação de três enzimas integrais de membrana, resultando em proteínas triacilatadas. O primeiro passo na via de modificação da lipoproteína envolve a transferência de um grupo diacilglicerila do fosfatidilglicerol para a prolipoproteína, resultando em prolipoproteína diacilglicerila. Na segunda etapa, o peptídeo de sinal da prolipoproteína é clivado formando uma apolipoproteína, que por sua vez é modificada por um terceiro ácido graxo derivado de um fosfolipídio. Esta última etapa é catalisada pela apolipoproteína N-aciltransferase (Lnt). A via de modificação da lipoproteína é essencial na maioria das γ-proteobactérias, tornando-se um alvo potencial para o desenvolvimento de novos agentes antibacterianos. Descrito aqui é um ensaio sensível para Lnt que é compatível com triagem de alto rendimento de pequenas moléculas inibitórias. A enzima e os substratos são moléculas embutidas na membrana; por conseguinte, o desenvolvimento de um ensaio in vitro não é simples. Isso inclui a purificação da enzima ativa na presença de detergente, a disponibilidade de alquinofosfolipídios e substratos peptídicos diacilglicerilos e as condições de reação em micelas mistas. Além disso, para usar o teste de atividade em uma configuração de triagem de alto rendimento (HTS), a leitura direta do produto da reação é preferida às reações enzimáticas acopladas. Neste ensaio enzimático fluorométrico, o produto peptídico alquino-triacilado é tornado fluorescente através de uma reação de click-chemistry e detectado em um formato de placa multipoço. Este método é aplicável a outras aciltransferases que utilizam substratos contendo ácidos gordos, incluindo fosfolipídios e acil-CoA.

Na reação Lnt, o ácido graxo sn-1 dos fosfolipídios é transferido para um peptídeo diacilglicerila, resultando em peptídeo triacilado maduro8. O ensaio de Lnt in vitro descrito aqui é projetado para usar fosfolipídios contendo um ácido graxo alcino (alquino-POPE) e FSL-1-biotina como substratos, resultando na formação de alquino-FSL-1-biotina. Após uma reação de click-chemistry com azido-FAM, este produto deve ser marcado fluorescentemente e detectado por espectrometria de fluorescência (...

Apresentamos aqui um ensaio de fluorescência sensível para monitorar a atividade da apolipoproteína N-aciltransferase usando peptídeo diacilglicerilo e alquino-fosfolipídios como substratos com click-química.

Ensaio fluorométrico baseado em química de cliques para apolipoproteína N-aciltransferase da caracterização enzimática à triagem de alto rendimento

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

Este protocolo aborda dois aspectos importantes, a caracterização de uma membrana integral essencial, a apolipoproteína aciltransferase de bactérias, e o desenvolvimento do ensaio em formato HDS para triagem de inibidores da enzima. O método é muito sensível e adequado para fins de triagem. Pode contribuir para o desenvolvimento de potenciais novos antibióticos.Este vídeo ajudará a destacar as etapas críticas deste protocolo, como mistura, vórtice, sonicação, enquanto trabalha com suspensões contendo lipídios e detergentes não homogêneos. Demonstrando o procedimento estarão Karine Nozeret, Aurelia Pernin, ambas bolsistas do meu grupo. Comece preparando a mistura de reagentes para o ensaio de apolipoproteína e aciltransferase ou LNT.Misture o alcino POPE e a FSL-1-biotina com tampão de reação LNT em tubos de 1,5 mililitro a um volume final de 18 microlitros. Preparar misturas de reagentes triplicados para todas as condições ensaiadas. Sonicar as misturas de reagentes durante três minutos em banho-maria ultrassónico e incubá-las a 37 graus Celsius durante cinco minutos.Em seguida, adicione LNT ativo ou inativo a uma concentração final de um nanograma por microlitro e pipete para cima e para baixo para misturar. Incube a reação a 37 graus Celsius por 16 horas em um misturador térmico com tampa aquecida. Enquanto isso, prepare uma solução estoque de dois miligramas por mililitro de estreptavidina.E dilua-o para 10 microgramas por mililitro para criar uma solução de trabalho. Adicione 100 microlitros da solução a cada poço de uma placa de 96 poços. Em seguida, seque os poços ao ar durante a noite, incubando a placa a 37 graus Celsius sem tampa.No dia seguinte, prepare soluções-mãe de cinco milimolares Azido-FAM, 50 milimolares de TCEP, dois milimolares de TBTA e 50 milimolares de sulfato de cobre pentahidratado. Execute a química do clique adicionando 0,2 microlitros de estoque Azido-FAM, 0,4 microlitros de estoque TCEP e 0,2 microlitros de estoque TBTA aos tubos de reação LNT de 1,5 mililitro. Vortex a solução por cinco segundos.Em seguida, adicione 0,4 microlitros de sulfato de cobre. Vórtice por mais cinco segundos e incube a reação por uma hora em temperatura ambiente no escuro. Enquanto a mistura química do clique está incubando, lave os poços das placas revestidas com estreptavidina três vezes com 200 microlitros de PBST1.Transfira 18 microlitros da mistura química do clique para um poço revestido com estreptavidina e adicione 100 microlitros de PBST1 para ligar o produto N-acil-FSL-1-biotina FAM à placa. Adicione fluoresceína de biotina à placa como um controle positivo para a ligação da estreptavidina e leitura de fluorescência. Em seguida, incube a placa em temperatura ambiente por uma hora no escuro, agitando a 300 RPM.Após a incubação, use uma pipeta eletrônica multicanal para lavar manualmente a placa seis vezes com 200 microlitros de PBST2. Lave três vezes com a pipeta. Lave três vezes com 200 microlitros de PBS e lave mais três vezes.Adicione 200 microlitros de PBS a cada poço e detecte a fluorescência a 520 nanômetros em um leitor de microplacas. Salve todos os resultados em uma planilha e calcule o desvio padrão para cada reação, bem como os valores P para controles negativos e amostras positivas com um teste T não pareado. O ensaio LNT in vitro descrito aqui usa fosfolipídios contendo um ácido graxo alcino e FSL-1-biotina como substratos para formar alcino FSL-1-biotina.Após uma reação química de clique com Azido-FAM, este produto torna-se marcado com fluorescência e detectável por espectrometria de fluorescência. As condições de reação foram otimizadas para leitura máxima de fluorescência em 520 nanômetros. Os controles negativos incluíram reações sem enzima, com uma variante inativa da enzima ou com inibidor específico do tiol, MTSES.A fluoresceína de biotina foi utilizada como controle interno para sinal de fluorescência máxima. Para desenvolver um ensaio de triagem de alto rendimento, as reações foram realizadas diretamente em placas de 384 poços. As etapas de lavagem foram automatizadas e a quantidade de reagentes foi reduzida.A reação foi sensível e reprodutível com diferença significativa no sinal fluorescente entre o controle negativo e a enzima ativa. Para triagem de alto rendimento, o fator primo Z determina se uma resposta em um ensaio é grande o suficiente para fins de triagem. O fator primo Z médio foi maior que 0,6 para o ensaio LNT realizado em um formato de 384 poços, sugerindo que foi excelente.O ensaio em tubo neste vídeo foi desenvolvido em um formato de placa múltipla compatível com HDS. Pode ser usado para estudar outras aciltransferases de uma variedade de organismos.

click-chemistry-based-fluorometric-assay-for-apolipoprotein-n

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Um protocolo para triagem de drogas moleculares pequenas baseado na síntese in-situ de nanoclusters de ouro fluorescentes ultrapequenos (Au NCs) usando proteína carregada de drogas como modelo é apresentado. Este método é simples para determinar a afinidade de ligação de drogas a uma proteína-alvo por um sinal fluorescente visível emitido pelos NCs de Au moldados por proteínas.

Uma rápida e quantitativa método fluorimétrico para-Targeting proteína pequena molécula Rastreio de drogas

Este trabalho apresenta um método de triagem de alto rendimento usando um sistema universal de triagem enzimática genética que pode ser teoricamente aplicado a mais de 200 enzimas. Aqui, o sistema de triagem único identifica três enzimas diferentes (lipase, celulase e fosfatase alcalina) simplesmente alterando o substrato usado (acetato de p-nitrofenila, p-nitrofenil-β-D-celobiosídeo e fenil fosfato).

Multi-enzima Triagem Usando um de alta capacidade Enzyme genética Sistema de Triagem

Nós apresentamos uma análise (HCA) instrumento de alto conteúdo open source utilizando imagens de fluorescência vida automatizado (FLIM) para ensaiar interações proteína usando Förster transferência de energia de ressonância (FRET) leituras base. Aquisição de dados para este instrumento openFLIM-HCA é controlada por software escrito em μManager e análise de dados é realizado em FLIMfit.

Open Source Análise alta Conteúdo Utilizando Automated microscopia de fluorescência Lifetime Imagiologia

Apresenta-se no presente estudo, um ensaio baseado em fluorescência de novo utilizando linfócitos derivados de um ratinho transgénico. Este ensaio é adequado para rastreio de alto rendimento (HTS) de pequenas moléculas dotadas com a capacidade de qualquer inibição ou promoção da activação dos linfócitos.

A Fluorescência baseada em Linfócitos ensaio adequado para high-throughput screening de pequenas moléculas

Descrevemos aqui um ensaio livre celular bioquímico fluorométrica para determinação da peroxidação lipídica-HDL. Este ensaio rápido e reprodutível pode ser usado para determinar a função do HDL em estudos de grande escala e pode contribuir para nossa compreensão da função do HDL em doenças humanas.

Bioquímico celular-free fluorométrica ensaio enzimático para medição do elevado-throughput de peroxidação lipídica em lipoproteína de alta densidade

Medição da capacidade de efluxo de colesterol in vitro de soro ou plasma em modelos de celular de macrófagos é uma ferramenta promissora como um biomarcador para a aterosclerose. No presente estudo, podemos otimizar e padronizar um método de efluxo de colesterol NBD fluorescente e desenvolver uma análise do elevado-throughput usando placas de 96 poços.

Ensaio de efluxo de colesterol Nitrobenzoxadiazole-etiquetadas do elevado-throughput

Um ensaio de ATPase acoplado a nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) foi adaptado à triagem de taxa de transferência semialta de inibidores de miosina de pequena molécula. Este ensaio cinético é executado em um formato de microplaca de 384 poços com volumes de reação total de apenas 20 μL por poço. A plataforma deve ser aplicável a praticamente qualquer enzima produtora de ADP.

Uma adaptação semi-high-throughput do ensaio ATPase NADH-acoplado para a seleção de inibidores pequenos da molécula

Este protocolo apresenta um método para medir a ligação de adenina nucleotídica a receptores em tempo real em ambiente celular. A ligação é medida como transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) entre derivados de nucleotídeos trinitrofenila e proteínas marcadas com um aminoácido fluorescente não canônico.

Medindo a ligação de nucleotídeos a proteínas de membrana intactas e funcionais em tempo real

Monitorar mudanças na temperatura de fusão de uma proteína alvo (ou seja,ensaio de mudança térmica, TSA) é um método eficiente para triagem de bibliotecas de fragmentos de algumas centenas de compostos. Apresentamos um protocolo TSA implementando fluoremetria nano-diferencial assistida por robótica (nano-DSF) para monitorar fluorescência triptofano intrínseca e dispersão de costas leves para triagem de fragmentos.

Fluormetria de varredura nano-diferencial para triagem em descoberta de chumbo baseada em fragmentos

As metiltransferases de DNA são potenciais alvos de drogas contra o câncer. Aqui, um protocolo é apresentado para avaliar pequenas moléculas para inibição da DNA metiltransferase. Este ensaio utiliza uma endonuclease para acoplar a metilação do DNA à geração de fluorescência e permite que a atividade enzimática seja monitorada em tempo real.

Ensaio de metilação de DNA acoplado à endonuclease à base de fluorescência contínua para triagem de inibidores da DNA metiltransferase

Ensaios químicos rápidos e precisos para triagem de inibidores específicos são uma ferramenta importante no arsenal de desenvolvimento de fármacos. Aqui, apresentamos um ensaio químico escalável de acetil-clique para medir a inibição da atividade de acetilação do HAT1.

Um ensaio químico de acetil-clique para medir a acetilação de histona acetiltransferase 1

Aprenda um ensaio fluorométrico por química de cliques para caracterizar a apolipoproteína N-aciltransferase bacteriana e triar inibidores em formato de alto rendimento. Este método sensível contribui para o desenvolvimento de novos antibióticos.

Ensaio fluorométrico baseado em química de cliques para apolipoproteína N-aciltransferase da caracterização enzimática à triagem de alto rendimento (Vídeo) | JoVE Journal

Ensaio fluorométrico baseado em química de cliques para apolipoproteína N-aciltransferase da caracterização enzimática à triagem de alto rendimento

Explorar mais vídeos