Ensaio fluorométrico baseado em química de cliques para apolipoproteína N-aciltransferase da caracterização enzimática à triagem de alto rendimento
13 de maio de 2020
Apresentamos aqui um ensaio de fluorescência sensível para monitorar a atividade da apolipoproteína N-aciltransferase usando peptídeo diacilglicerilo e alquino-fosfolipídios como substratos com click-química.
Este protocolo aborda dois aspectos importantes, a caracterização de uma membrana integral essencial, a apolipoproteína aciltransferase de bactérias, e o desenvolvimento do ensaio em formato HDS para triagem de inibidores da enzima. O método é muito sensível e adequado para fins de triagem. Pode contribuir para o desenvolvimento de potenciais novos antibióticos.
Este vídeo ajudará a destacar as etapas críticas deste protocolo, como mistura, vórtice, sonicação, enquanto trabalha com suspensões contendo lipídios e detergentes não homogêneos. Demonstrando o procedimento estarão Karine Nozeret, Aurelia Pernin, ambas bolsistas do meu grupo. Comece preparando a mistura de reagentes para o ensaio de apolipoproteína e aciltransferase ou LNT.
Misture o alcino POPE e a FSL-1-biotina com tampão de reação LNT em tubos de 1,5 mililitro a um volume final de 18 microlitros. Preparar misturas de reagentes triplicados para todas as condições ensaiadas. Sonicar as misturas de reagentes durante três minutos em banho-maria ultrassónico e incubá-las a 37 graus Celsius durante cinco minutos.
Em seguida, adicione LNT ativo ou inativo a uma concentração final de um nanograma por microlitro e pipete para cima e para baixo para misturar. Incube a reação a 37 graus Celsius por 16 horas em um misturador térmico com tampa aquecida. Enquanto isso, prepare uma solução estoque de dois miligramas por mililitro de estreptavidina.
E dilua-o para 10 microgramas por mililitro para criar uma solução de trabalho. Adicione 100 microlitros da solução a cada poço de uma placa de 96 poços. Em seguida, seque os poços ao ar durante a noite, incubando a placa a 37 graus Celsius sem tampa.
No dia seguinte, prepare soluções-mãe de cinco milimolares Azido-FAM, 50 milimolares de TCEP, dois milimolares de TBTA e 50 milimolares de sulfato de cobre pentahidratado. Execute a química do clique adicionando 0,2 microlitros de estoque Azido-FAM, 0,4 microlitros de estoque TCEP e 0,2 microlitros de estoque TBTA aos tubos de reação LNT de 1,5 mililitro. Vortex a solução por cinco segundos.
Em seguida, adicione 0,4 microlitros de sulfato de cobre. Vórtice por mais cinco segundos e incube a reação por uma hora em temperatura ambiente no escuro. Enquanto a mistura química do clique está incubando, lave os poços das placas revestidas com estreptavidina três vezes com 200 microlitros de PBST1.
Transfira 18 microlitros da mistura química do clique para um poço revestido com estreptavidina e adicione 100 microlitros de PBST1 para ligar o produto N-acil-FSL-1-biotina FAM à placa. Adicione fluoresceína de biotina à placa como um controle positivo para a ligação da estreptavidina e leitura de fluorescência. Em seguida, incube a placa em temperatura ambiente por uma hora no escuro, agitando a 300 RPM.
Após a incubação, use uma pipeta eletrônica multicanal para lavar manualmente a placa seis vezes com 200 microlitros de PBST2. Lave três vezes com a pipeta. Lave três vezes com 200 microlitros de PBS e lave mais três vezes.
Adicione 200 microlitros de PBS a cada poço e detecte a fluorescência a 520 nanômetros em um leitor de microplacas. Salve todos os resultados em uma planilha e calcule o desvio padrão para cada reação, bem como os valores P para controles negativos e amostras positivas com um teste T não pareado. O ensaio LNT in vitro descrito aqui usa fosfolipídios contendo um ácido graxo alcino e FSL-1-biotina como substratos para formar alcino FSL-1-biotina.
Após uma reação química de clique com Azido-FAM, este produto torna-se marcado com fluorescência e detectável por espectrometria de fluorescência. As condições de reação foram otimizadas para leitura máxima de fluorescência em 520 nanômetros. Os controles negativos incluíram reações sem enzima, com uma variante inativa da enzima ou com inibidor específico do tiol, MTSES.
A fluoresceína de biotina foi utilizada como controle interno para sinal de fluorescência máxima. Para desenvolver um ensaio de triagem de alto rendimento, as reações foram realizadas diretamente em placas de 384 poços. As etapas de lavagem foram automatizadas e a quantidade de reagentes foi reduzida.
A reação foi sensível e reprodutível com diferença significativa no sinal fluorescente entre o controle negativo e a enzima ativa. Para triagem de alto rendimento, o fator primo Z determina se uma resposta em um ensaio é grande o suficiente para fins de triagem. O fator primo Z médio foi maior que 0,6 para o ensaio LNT realizado em um formato de 384 poços, sugerindo que foi excelente.
O ensaio em tubo neste vídeo foi desenvolvido em um formato de placa múltipla compatível com HDS. Pode ser usado para estudar outras aciltransferases de uma variedade de organismos.
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Visão Geral
Este protocolo apresenta um ensaio fluorescente sensível para monitorar a atividade da N-aciltransferase de apolipoproteína. Utiliza um peptídeo diacilgliceril e fosfolipídios alquino como substratos, empregando a química click para detecção.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Bioquímica
- Microbiologia
- Ensaios Enzimáticos
Contexto
- As aciltransferases de apolipoproteínas são proteínas integrais de membrana essenciais em bactérias.
- A caracterização dessas enzimas é crucial para compreender seu papel na fisiologia bacteriana.
- O desenvolvimento de ensaios sensíveis pode auxiliar na triagem de inibidores enzimáticos.
- Esses inibidores podem levar ao desenvolvimento de novos antibióticos.
Objetivo do Estudo
- Caracterizar a atividade da N-aciltransferase de apolipoproteína.
- Desenvolver um ensaio de triagem de alto rendimento para inibidores enzimáticos.
- Contribuir para a descoberta de potenciais antibióticos.
Métodos Utilizados
- Preparação de uma mistura de reagentes para o ensaio.
- Uso de métodos de detecção de fluorescência.
- Click-química para marcação de substratos.
- Passos críticos do procedimento incluem mistura, vortexamento e sonicamento.
Resultados Principais
- O ensaio demonstrou alta sensibilidade, adequado para triagem.
- Caracterização bem-sucedida da atividade de N-aciltransferase de apolipoproteína.
- Potencial para identificar inibidores novos da enzima.
- Foram destacadas as contribuições para o desenvolvimento de antibióticos.
Conclusões
- O ensaio desenvolvido é eficaz para monitorar a atividade enzimática.
- Pode facilitar a descoberta de novos agentes antibacterianos.
- Estudos futuros podem expandir a triagem de diversos inibidores.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Ensaios robustos e compatíveis com alto rendimento para enzimas embutidas em membranas, como a apolipoproteína N-aciltransferase (Lnt), são fundamentais para a validação de alvos antibacterianos e para a descoberta precoce de inibidores. Este ensaio fluorométrico baseado em química "click" permite a medição sensível e quantitativa da atividade de Lnt, reforçando a confiança preditiva em campanhas de triagem. Sua compatibilidade com formatos multipoços o posiciona como uma plataforma reutilizável para a identificação abrangente de compostos ativos antibacterianos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta da função enzimática da Lnt in vitro para desvio de risco mecanicista.
- Apoia a validação funcional do alvo ao distinguir estados enzimáticos ativos de inativos.
- Facilita a triagem orientada por hipóteses de inibidores de pequenas moléculas de vias bacterianas essenciais.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece uma leitura padronizada e sensível, adequada para triagem em alta produtividade (HTS) de bibliotecas de inibidores.
- Oferece saídas quantitativas reprodutíveis de fluorescência para métricas robustas de desempenho do ensaio.
- Permite a triagem rápida da atividade de compostos com controles positivos e negativos claros.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Oferece uma plataforma adaptável a outras aciltransferases relevantes para a pesquisa de antibacterianos.
- Permite a continuidade do rastreamento bioquímico até a validação pré-clínica de candidatos antibacterianos.
- Alinha-se a estratégias translacionais de biomarcadores ao permitir a medição direta da inibição enzimática.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este ensaio conecta a fase inicial de descoberta à identificação de compostos líderes, fornecendo uma plataforma quantitativa e pronta para triagem em alta escala (HTS) para a triagem de inibidores da Lnt e validação mecanicista.
- Biologia da Descoberta: Quantifica a atividade da Lnt para esclarecer o envolvimento da via e a viabilidade do alvo.
- Triagem: Demonstra alto fator Z' e reprodutibilidade para avaliação confiável de compostos.
- Análises: Gera dados baseados em fluorescência, permitindo comparação estatística de condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Facilita a validação posterior de hits em modelos bacterianos relevantes para doenças.
- Reutilização Corporativa: Adaptável a outras aciltransferases de membrana e escalonável em diferentes programas antibacterianos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva no engajamento do alvo e na potência do inibidor.
- Valor Operacional: Otimiza a padronização do ensaio, a automação e a escalabilidade em múltiplas poções.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisão quanto ao prosseguimento ou interrupção de projetos e reduz o risco de falhas biológicas em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos antibacterianos que visam vias essenciais.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em purificação de proteínas de membrana e sistemas de ensaio baseados em detergentes.
- Exige acesso a leitores de placas com detecção de fluorescência e infraestrutura de automação para ensaios em multiplacas de alto rendimento (HTS).
- Exige padronização rigorosa entre equipes quanto aos controles e à análise estatística (por exemplo, fator Z', testes T).
- Adaptável a outras aciltransferases com requisitos semelhantes de substrato e químicas de detecção.
- A sensibilidade e a reprodutibilidade do ensaio dependem da preparação otimizada dos reagentes e do manuseio das placas.
