Rastreamento de linhagem e análise clonal no desenvolvimento de córtex cerebral usando análise de mosaico com marcadores duplos (MADM)
May 8th, 2020
Um protocolo para realizar o rastreamento de linhagem e a análise genética funcional dos genes candidatos em um único nível celular usando a análise de mosaico com marcadores duplos (MADM). A análise clonal madm fornece uma estrutura quantitativa para medir o comportamento proliferativo, a saída celular e a relação de linhagem de progenitores individuais e suas células filhas.
A Análise mosaico com tecnologia Double Markers é um método poderoso que pode fornecer informações altamente quantitativas sobre o comportamento de proliferação e saídas de porões de células-tronco individuais. Uma característica única desta técnica, é que permite o rastreamento de linhagem e a análise genética funcional dos genes candidatos no nível de Célula Única.demonização para o procedimento será, Carmen Streicher, sua técnica, Nicole Amberge, pós-doc, Gisselle Cheung, pós-doutor e Andy Hansen, um estudante de doutorado do meu laboratório. Para induzir eventos de recombinação MADM em camundongos experimentais, use uma seringa de 1ml equipada com uma agulha de calibre 25 para fornecer uma única injeção de Tamoxifen Intraperitoneal em uma represa cronometrada para grávida. Da análise clonal madm aos pontos de tempo pós-natal. Nos dias embrionários de 18 a 19 dias, coloque um rato grávida na posição supina e desinfete a pele com 70% de etanol. Faça uma pequena incisão na pele no abdômen inferior acima do útero e faça uma segunda incisão através dos músculos e da parede muscular abdominal para revelar o peritônio. Use uma tesoura para separar o útero dos tecidos circundantes e colocar o útero intacto em uma luva com água morna. Em seguida, use uma tesoura de ponta fina e os dedos para abrir cuidadosamente as paredes uterinas para liberar os embriões. Limpe os filhotes pressionando suavemente os baús de tempos em tempos para iniciar a respiração antes de transferir os animais pré-natais para uma mãe adotiva. Para coletar tecido clone madm neural coloque um animal anestesiado na posição supina em uma bandeja de cirurgia de perfusão e desinfete a pele com 70% de etanol. Use tesouras e fórceps para fazer uma incisão através da pele e uma incisão através da camada muscular. Quando a cavidade torácica estiver visível, fareje e levante o diafragma para revelar o coração e corte cuidadosamente e fixe a caixa torácica na bandeja cirúrgica.insira uma agulha conectada a uma tubulação de bomba peristáltica cheia de PBS no ventrículo inferior esquerdo do coração e use uma pequena tesoura Iris para fazer uma incisão na extremidade posterior do átrio direito. Perfuuse o sistema cardiovascular com o PBS seguido imediatamente por perfusão com gelo recém-preparado frio 4%paraformaldeído na PBS. Quando a perfusão estiver completa, remova o cérebro através de dissecção cuidadosa e coloque o órgão colhido em pelo menos cinco vezes o volume cerebral de fresco 4% de desformaldeído durante a noite em 4
Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para rastreamento de linhagem e análise genética funcional de genes candidatos no nível de célula única utilizando Análise Mosaica com Marcadores Duplos (MADM). A análise clonal MADM permite a medição quantitativa do comportamento proliferativo e da produção celular de progenitores individuais e suas células descendentes.
Principais Componentes do Estudo
Área de Pesquisa
- Rastreamento de linhagem
- Análise genética
- Biologia de células-tronco
Fundo
- A tecnologia MADM é instrumental na compreensão da proliferação celular.
- O método permite o rastreamento no nível de célula única.
- As aplicações incluem avaliação de produção celular e relações de linhagem.
Métodos Utilizados
- Análise Mosaica com Marcadores Duplos (MADM)
- Modelo experimental: Camundongos
- As técnicas incluem injeções intraperitoneais e perfusão de tecido.
Principais Resultados
- Permitiu exame detalhado do comportamento dos progenitores.
- Forneceu insights sobre as relações de linhagem das células-filhas.
- Demonstrou um método confiável para análise genética funcional.
Conclusões
- Este estudo fornece um protocolo abrangente para utilização do MADM na análise genética.
- Os resultados contribuem significativamente para o campo da biologia do desenvolvimento.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Mosaic Analysis with Double Markers (MADM) enables unprecedented single-cell resolution lineage tracing and clonal analysis in the developing cerebral cortex, directly addressing the challenge of mapping neural stem cell fate and division patterns. This capability enhances predictive confidence in early neurodevelopmental target validation and supports mechanistic de-risking for CNS portfolio decisions. MADM's quantitative and qualitative outputs position it as a critical tool for functional genetic interrogation in neurobiology-focused R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of neural stem cell lineage transitions and division modes.
- Supports functional validation of candidate genes in neurodevelopmental pathways.
- Provides mechanistic de-risking by distinguishing control and mutant subclones in vivo.
- Facilitates high-confidence target selection for CNS therapeutic programs.
Screening & Assay Development
- Generates validated single-cell lineage maps for downstream phenotypic screening.
- Delivers reproducible, quantitative readouts of progenitor proliferation and fate specification.
- Supports assay standardization by enabling comparative analysis within the same tissue environment.
- Prepares robust biological systems for compound evaluation in neurodevelopmental contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns lineage tracing outputs with disease-relevant neural circuit formation.
- Enables continuity from discovery-stage genetic manipulation to preclinical model validation.
- Supports risk-adjusted advancement of CNS targets based on in vivo functional evidence.
- Provides translational biomarker insights through clonal analysis of neural progenitors.
Pipeline & Workflow Integration
MADM-based lineage tracing integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation in CNS-focused pipelines.
- Discovery Biology: Delivers high-resolution hypothesis testing of neural stem cell fate and division patterns.
- Screening: Supplies quantitative, reproducible lineage data for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides optical and statistical outputs for comparing control and mutant progenitor behaviors.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by mapping lineage outcomes in vivo.
- Enterprise Reuse: Adaptable to any murine stem cell niche with appropriate CreERT2 drivers, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural lineage studies.
- Operational Value: Standardizes lineage tracing and clonal analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in CNS portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental targets based on in vivo functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetic manipulation, in vivo lineage tracing, and neuroanatomical dissection.
- Demands access to murine models with CreERT2 drivers and advanced imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible clonal analysis and data interpretation.
- Adaptable to various stem cell niches with appropriate genetic drivers and tissue handling protocols.
- Limited to murine systems where genetic tools and tissue access are feasible.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Tamoxifen (TM) Induction in Mosaic Analysis with Double Markers (MADM) Mice
2:00
MADM Clone Brain Tissue Harvest
3:12
MADM Brain Tissue Sectioning
4:30
Adult Tissue Mounting
5:29
Confocal Image Acquisition and MADM Clone Quantification
6:29
Serial 3D Clone Reconstruction
7:30
Results: Representative Lineage Tracing and Clonal Analysis
8:41
Conclusion
