Produção de frangos de corte de crescimento rápido sem germes de uma linha comercial para estudos de microbiota
18 de junho de 2020
Aqui descrevemos um método para a geração de filhotes livres de germes a partir de ovos de uma linha de frango comercial, o Ross PM3. Este método pode ser adaptado para a geração de animais livres de germes de outras espécies de aves.
Até agora, a produção de aves livres de germes era limitada à raça animal para pesquisa. Mostramos aqui que é possível fazê-lo com animais comerciais. Esta técnica permite realizar estudos da influência da microbiota utilizando o background genético de aves de criação.
Ao tentar este protocolo, é importante controlar a reprodução das espécies escolhidas nas condições padrão e possuir um forte conhecimento do trabalho em isoladores. Comece instalando tubos de 50 mililitros, pipetas de plástico, alimentação irradiada, água autoclavada e recipientes de plástico selados estéreis em um isolador rígido sob pressão positiva. Encha a armadilha germicida de transferência com uma solução de amônio quaternário a 2% e esterilize o isolador três vezes com vapor de formaldeído, movendo os materiais dentro do isolador entre cada esterilização para garantir a desinfecção de todas as superfícies de contato.
Pelo menos dois dias antes de introduzir os ovos, ajuste a temperatura do isolador para 37 graus Celsius. No dia da introdução, ajuste o hidrômetro para 65 a 70% de umidade relativa. Depois de selecionar os ovos limpos e sem falhas, descontamine imediatamente a superfície do ovo mergulhando-os em uma solução de ácido peracético a 1,5% por cinco minutos e, em seguida, transporte os ovos para a instalação experimental usando uma caixa descontaminada com vapor de formaldeído.
Armazene os ovos por 24 horas a 14 graus Celsius, depois repita a esterilização com ácido peracético a 1,5% e coloque os ovos em uma incubadora para incubação por 19 dias. No dia 19, verifique a fertilidade, viabilidade e desenvolvimento do embrião usando um candler de ovo leve em condições estéreis. Selecione ovos vivos embrionados e descontamine-os pulverizando-os com uma solução de ácido peracético a 1,5% por 30 segundos ou até que toda a superfície de cada ovo esteja coberta.
Transfira os ovos para os isoladores de incubação estéreis e lave-os com água desmineralizada estéril antes de colocá-los no espaço de incubação. Após a eclosão, os animais são mantidos nos isoladores estéreis, alimentados ad libitum com dieta comercial esterilizada por irradiação gama e regados com água da torneira autoclavada. Um dia após a eclosão, pegue uma amostra fecal diretamente do reto de diferentes pintinhos e agrupe-os em um tubo de vidro esterilizado.
Adicione um mililitro de fezes a nove mililitros de caldo de tioglicolato com resazurina e adicione a amostra restante a nove mililitros de infusão de coração cerebral ou caldo BHI. Incube os tubos a 37 graus Celsius sem agitar por 18 a 48 horas. Às 18 horas, examine visualmente os tubos para qualquer modificação no meio de crescimento.
Após 48 horas, pegue uma gota do meio de caldo fecal BHI, coloque-o em uma lâmina de vidro e observe-o ao microscópio. Se houver suspeita de presença de bactérias, pegue uma amostra da cultura BHI e semeie-a em uma placa de ágar BHI e, em seguida, incube a placa a 37 graus por 18 a 48 horas. Se aparecerem colônias, identifique as bactérias usando uma técnica de alto rendimento, como espectrometria de massa MALDI-TOF.
Seis corridas de geração de pintinhos livres de germes foram conduzidas com ovos ROSS PM3 provenientes de duas fazendas francesas diferentes. Um total de 853 ovos foram coletados e após duas etapas de descontaminação e 19 dias de incubação, 86,40% eram viáveis. Dos ovos viáveis, 490 passaram por uma terceira etapa de descontaminação e foram introduzidos em vários isoladores de incubação para uma taxa média de eclosão de 79,80%Isso representa uma taxa de eclosão de 68,94%em comparação com o número inicial de ovos coletados.
Os resultados de eclosão variam substancialmente de 41,67% a 88,16% dos pintinhos viáveis em comparação com o número de ovos coletados. Esse efeito foi diretamente correlacionado com a idade das galinhas poedeiras, onde os ovos provenientes de galinhas mais velhas eram menos viáveis. As seis execuções foram realizadas usando quatro isoladores de incubação diferentes.
Após o controle bacteriológico, os animais de 14 dos 16 isoladores foram confirmados como livres de germes, correspondendo a uma taxa de sucesso de 86,5%. Isso requer o cumprimento dos procedimentos de desinfecção e, acima de tudo, o controle da introdução dos elementos através da câmara de ar líquida. Este procedimento permite aos animais medir o impacto da microbiota na fisiologia e saúde das aves.
Pode ser adaptado e usado para estudar a microbiota de outras aves de criação ou animais selvagens se os ovos forem acessíveis.
Visão Geral
Este artigo apresenta um método para gerar pintinhos livres de germes a partir de ovos comerciais de frangos de corte, especificamente da linhagem Ross PM3. A técnica permite estudos sobre microbiota utilizando o background genético de aves de granja.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Microbiologia
- Ciência Animal
- Medicina Veterinária
Antecedentes
- Métodos anteriores para aves livres de germes estavam limitados a raças de pesquisa.
- Este estudo demonstra a viabilidade do uso de aves comerciais.
- Compreender a influência da microbiota na saúde é essencial para o manejo avícola.
- A manutenção da esterilidade durante o processo é essencial para o sucesso.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para produzir pintinhos livres de germes.
- Facilitar a pesquisa sobre microbiota em aves comerciais.
- Avaliar o impacto da microbiota na fisiologia e saúde das aves.
Métodos Utilizados
- Preparação de isoladores com protocolos de esterilização.
- Descontaminação de ovos utilizando ácido peracético.
- Incubação e monitoramento do desenvolvimento embrionário.
- Controle bacteriológico de pintinhos após a eclosão.
Resultados Principais
- Do total de 853 ovos, 86,40% eram viáveis após a descontaminação.
- A taxa média de eclosão foi de 79,80% para ovos viáveis.
- A taxa de sucesso de pintinhos livres de germes foi de 86,5% entre os isoladores.
- A viabilidade correlacionou-se com a idade das poedeiras.
Conclusões
- O método fornece um caminho para estudos de microbiota em aves de capoeira.
- Pode ser adaptado para outras aves domesticadas ou animais selvagens.
- A manutenção da esterilidade é essencial para a geração bem-sucedida de animais livres de germes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite estudos de microbiota em linhagens comerciais de aves, abordando uma lacuna fundamental na tradução de descobertas de raças de pesquisa para genéticas relevantes à indústria. Ao produzir aves livres de germes a partir de frangos de corte de crescimento rápido, ele apoia a modelagem preditiva de interações hospedeiro-microbiota em espécies economicamente importantes. A abordagem aumenta a confiança translacional para intervenções nutricionais, imunológicas e fisiológicas na produção avícola.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite testar hipóteses sobre a influência da microbiota no desenvolvimento imunológico e na fisiologia, utilizando backgrounds genéticos de relevância comercial.
- Valor Operacional: Oferece um sistema livre de germes e controlado para isolar variáveis microbianas em estudos de resposta do hospedeiro.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera sistemas biológicos padronizados e livres de microbiota para desempenho consistente em ensaios de triagem de aditivos alimentares ou probióticos.
- Valor Operacional: Apoia medições basais reprodutíveis, essenciais para avaliar os efeitos de compostos na saúde intestinal e na imunidade.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita a desmistificação mecanicista ao permitir a reconstrução controlada da microbiota para avaliar os efeitos específicos de cepas na saúde das aves.
- Valor Operacional: Permite estudos longitudinais desde a eclosão até as fases de crescimento sob condições microbianas definidas, melhorando a confiança preditiva para candidatos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na continuidade entre descoberta e pré-clínico ao fornecer um modelo validado para testes de intervenção na microbiota em estágios iniciais, antes de avançar para ensaios em animais vivos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a validação funcional de alvos e vias microbianas que influenciam o crescimento, a imunidade e a utilização de nutrientes.
- Triagem: Fornece pintinhos livres de germes como uma plataforma reprodutível para avaliar aditivos alimentares, vacinas ou moduladores do microbioma.
- Análises: Permite o monitoramento bacteriológico quantitativo por meio de amostragem fecal e cultivo para confirmar o status livre de germes e acompanhar os resultados de desafios microbianos.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas iniciais à validação pré-clínica utilizando um modelo com relevância genética comercial.
- Reutilização Empresarial: Representa um procedimento escalável e adaptável, aplicável entre espécies de aves e unidades de isoladores para programas sustentados de P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz o ruído biológico em estudos de microbiota ao eliminar variáveis de confusão decorrentes da exposição microbiana não controlada.
- Valor Operacional: Garante a esterilidade do isolador por meio de protocolos de desinfecção validados, favorecendo resultados experimentais consistentes.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou interromper o desenvolvimento de alimentos e produtos para a saúde, fornecendo sinais precoces de eficácia e segurança em um modelo fisiologicamente relevante.
- Impacto sobre o Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos que modulam a microbiota, com base em respostas do hospedeiro validadas em linhagens genéticas comerciais.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em técnica asséptica e manejo de isoladores para manter a esterilidade durante todo o manuseio de ovos e criação de pintinhos.
- Depende do acesso a equipamentos de esterilização, incluindo sistemas de vapor de formaldeído, ácido peracético e suprimentos de ração irradiados por gama.
- Necessita de procedimentos operacionais padronizados para coleta, transporte e descontaminação de ovos, a fim de prevenir contaminação do isolador.
- Envolve controles ambientais de temperatura (37°C) e umidade (65–70% UR) durante as fases de incubação e eclosão.
- Baseia-se na validação bacteriológica utilizando caldos de tioglicolato e BHI, com confirmação microscópica e por cultivo, para comprovar o status livre de germes.
