Introduzindo mutações pontuais em células-tronco pluripotentes humanas usando edição de genoma contínua
May 10th, 2020
Aqui, descrevemos um método detalhado para edição de genes sem costura em células-tronco pluripotentes humanas usando um plasmídeo doador baseado em piggyBac e o mutante Cas9 nickase. Duas mutações pontuais foram introduzidas no éxon 8 do locus do fator nuclear 4 alfa do hepatócito (HNF4α) em células-tronco embrionárias humanas (hESCs).
A edição de genes em células-tronco pluripotentes humanas é um desafio. Este protocolo fornece o procedimento detalhado para edição do genoma nessas células usando o caso Cas-90 emparelhado combinado com o vetor de direcionamento. É confiável e fácil de seguir.
A principal vantagem deste protocolo é que ele é uma edição genômica perfeita. A seleção em duas etapas ajuda a aumentar as células-alvo e tornou a triagem de genotipagem mais eficiente. Manter células-tronco pluripotentes humanas em superfícies codificadas por laminina 21 recombinante em meio mTeSR1.
As células devem atingir 70 a 85% de confluência, 72 horas após uma proporção de uma a três parciais. No dia da transfecção, cubra poços suficientes de uma placa de 24 poços com 300 microlitros da solução de laminina 521 e incube a placa a 37 graus Celsius por pelo menos duas horas. Após a incubação, remova suavemente a solução de revestimento e adicione imediatamente 300 microlitros de meio mTeSR1 fresco, suplementado com inibidor de ROCK 10 micromolar a cada poço.
Em seguida, coloque a placa de volta na incubadora. Retire as células-tronco pluripotentes humanas da incubadora. Remova o meio gasto e lave as células uma vez com um mililitro de DPBS estéril.
Em seguida, adicione um mililitro de reagente de dissociação celular suave a cada poço e incube-o a 37 graus Celsius por seis a oito minutos para dissociar as células. Bata suavemente na placa para garantir que as células possam se soltar facilmente. Em seguida, use uma ponta P1000 para levantar as células pipetando para cima e para baixo.
Adicione dois mililitros de meio mTeSR1 com inibidor de ROCK para encerrar a dissociação. Misture bem a suspensão e transfira para um tubo de 50 mililitros. Centrifugar as células a 200 G durante três minutos.
Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda as células em dois mililitros de meio mTeSR1 com inibidor de ROCK. Conte as células usando um hemocitômetro e azul de tripano. Transferir 800.000 a 1 milhão de células para um tubo de 1,5 mililitro para cada reação de nucleofecção e centrifugá-las a 200 G por três minutos.
Em seguida, aspire cuidadosamente o sobrenadante. Misture três microgramas dos plasmídeos de expressão de RNA guia único Cas-9n emparelhados e cinco microgramas de plasmídeo vetorial alvo em 100 microlitros de solução de nucleofecção mista do kit de nucleofecção de células-tronco humanas. Prepare também uma mistura de plasmídeo de controle GFP.
Ressuspenda as células com a mistura de DNA e transfira-as para uma cubeta de eletroporação, certificando-se de evitar bolhas de ar. Eletroporar as células com o dispositivo de nucleofecção usando a condição otimizada para células-tronco pluripotentes humanas. Adicione imediatamente 500 microlitros de meio mTeSR1 fresco e quente suplementado com inibidor de ROCK 10 micromolar às células eletroporadas.
Em seguida, transfira a mistura para dois poços da placa de 24 poços previamente preparada. Coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius fornecida com 5% de dióxido de carbono para permitir que as células se recuperem. Substitua o meio de manutenção celular após 12 a 16 horas, retirando o inibidor de ROCK se as células estabelecerem contato célula a célula.
Após 24 a 48 horas, verifique a eficiência da nucleofecção examinando a expressão de GFP nas células de controle. Comece a selecionar células suplementando o meio mTeSR1 com um micrograma por mililitro de puromicina, 48 horas após a nucleofecção. Após 72 horas, suplementar o meio com 0,5 microgramas por mililitro de puromicina.
Se a confluência celular for inferior a 30%, também complemente o meio com inibidor de ROCK 10 micromolar. Quatro a seis dias após a nucleofecção passam as células resistentes à puromicina para 10 a 15 placas de 96 poços na concentração de 0,8 células por poço. Certifique-se de suplementar o meio com inibidor de ROCK e puromicina.
Mantenha as células a 37 graus Celsius e 10% de dióxido de carbono por 10 a 12 dias para formar colônias derivadas de células únicas. Completando o meio sete dias após a semeadura. Marque os poços contendo uma única colônia e substitua o meio por meio mTeSR1 fresco, contendo 0,5 microgramas por mililitro de puromicina, mas nenhum inibidor de ROCK.
Cultive as células por mais dois dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, troque o meio para poços contendo colônias indiferenciadas. Raspe suavemente as colônias e transfira a suspensão celular de uma colônia para dois novos poços em placas separadas de 96 poços.
Um para genotipagem e outro para manutenção. Quando a confluência das células de genotipagem atingir 50% ou mais, despeje o meio gasto e lave as células uma vez com DPBS. Lise as células com o Bradley Lysis Buffer e isole o DNA genômico de cada poço.
Depois de realizar três PCR de junção de primer e sequenciar os produtos, mantenha as colônias com o genótipo correto e descarte o restante. Expanda as colônias corretas sob seleção contínua de puromicina e congele-as o mais rápido possível. Este protocolo foi usado para introduzir duas mutações pontuais no Exon8 do gene alfa do fator nuclear quatro do hepatócito.
Um método de PCR baseado em três primers foi usado para rastrear células corretamente direcionadas, e o sequenciamento de Sanger foi realizado para confirmar os resultados da PCR. Após a remoção do de seleção, a região modificada foi sequenciada novamente para confirmar a introdução correta das mutações pontuais desejadas. Colônias com o genótipo correto foram selecionadas e as células foram caracterizadas antes de uma análise posterior.
As células editadas possuem a mesma morfologia que as células parentais e expressam marcadores representativos de células-tronco pluripotentes humanas, incluindo os fatores de transcrição Nanog e Oct4, bem como marcadores de superfície celular, SSEA-4 e TRA-160. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de verificar a confluência celular após a seleção de puromicina durante as primeiras 24 horas. É essencial suplementar a mediana com inibidor de ROCK.
Se a confluência celular for inferior a 30% para manter as células funcionando. Uma vez que as linhagens de células-tronco pluripotentes editadas pelo genoma tenham sido estabelecidas, elas podem ser usadas para estudar a função do gene ou a diferenciação direcionada. Essa técnica abre caminho para os pesquisadores estudarem diferentes questões, como a função específica dos genes ou a correção genética direcionada para doenças genéticas.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para edição de genes sem emendas em células-tronco pluripotentes humanas usando um plasmídeo doador baseado em piggyBac e mutante de nickase Cas9. O método introduz com sucesso duas mutações pontuais no locus HNF4α em células-tronco embrionárias humanas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Edição de Genes
- Biologia de Células-tronco
- Genômica
Fundamento
- A edição de genes em células-tronco pluripotentes humanas é complexa.
- O nickase Cas9 emparelhado fornece um método de edição confiável.
- A edição genômica sem emendas é vantajosa para modificações precisas.
- A triagem eficiente de genotipagem é crucial para uma edição bem-sucedida.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para edição de genes precisa em células-tronco pluripotentes humanas.
- Introduzir mutações específicas no gene HNF4α.
- Aumentar a eficiência na seleção de células editadas.
Métodos Utilizados
- Manutenção de células-tronco em superfícies de laminina recombinante.
- Nucleofecção de células com Cas9 e plasmídeos de vetores direcionados.
- Uso de seleção de puromicina para isolar células editadas com sucesso.
- Genotipagem e sequenciamento para confirmar edições bem-sucedidas.
Principais Resultados
- Duas mutações pontuais foram introduzidas com sucesso no locus HNF4α.
- As células mantiveram características pluripotentes após a edição.
- Métodos eficientes de seleção e genotipagem foram estabelecidos.
- As células editadas expressaram marcadores pluripotentes importantes.
Conclusões
- O protocolo permite uma edição de genes precisa em células-tronco pluripotentes humanas.
- Ele fornece uma base para estudar a função dos genes e a diferenciação.
- As aplicações futuras incluem investigar papéis específicos de genes no desenvolvimento.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Seamless genome editing in human pluripotent stem cells enables precise interrogation of gene function and disease modeling at the earliest stages of drug discovery. The protocol's efficiency and reliability in introducing point mutations at the HNF4α locus support high-confidence target validation and mechanistic de-risking. This capability strengthens translational continuity from discovery biology to preclinical research, directly impacting portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise introduction of disease-relevant mutations for functional genomics studies.
- Supports robust target validation by generating isogenic cell lines with defined genetic alterations.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing direct assessment of gene function in human cellular contexts.
- Improves predictive confidence for downstream therapeutic hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Provides validated, genetically defined cell systems for assay development and compound screening.
- Ensures reproducibility and standardization through seamless editing and rigorous genotyping.
- Enables quantitative readouts by confirming precise genomic modifications via PCR and sequencing.
- Supports scalable generation of cell lines for high-throughput screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered cell models with disease-relevant genotypes for translational biomarker studies.
- Maintains pluripotency and differentiation potential, supporting continuity into preclinical validation.
- Reduces biological risk by confirming genetic and phenotypic fidelity of edited lines.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on validated genetic models.
Pipeline & Workflow Integration
This genome editing protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, enabling seamless transition from target validation to disease modeling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling targeted gene modification.
- Screening: Delivers reproducible, genetically defined cell lines for assay readiness and quantitative evaluation.
- Analytics: Provides robust genotyping and sequencing outputs for confident comparison of edited versus parental lines.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by generating models with disease-relevant mutations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating custom-edited pluripotent stem cell lines across multiple targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes genome editing workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of genetically validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, nucleofection, and molecular genotyping.
- Needs access to electroporation devices, high-quality plasmids, and sequencing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for cell handling and selection protocols.
- Adaptation may be needed for different gene targets or cell line backgrounds.
- Cell viability and confluency must be closely monitored during selection and expansion phases.
