Fabricação de guias de ondas de modo zero para microscopia de molécula única de alta concentração
12 de maio de 2020
Descrito aqui é um método de litografia de nanosfera para fabricação paralela de guias de onda de modo zero, que são matrizes de nanoaperaturas em uma microscopia de vidro revestida de metal para imagens de moléculas únicas em concentrações de nano-a-micromolar de fluoroforos. O método aproveita a automontagem de cristal coloidal para criar um modelo de guia de onda.
O protocolo de litografia de nanoesferas apresentado aqui para a fabricação de guias de onda de modo zero é um método acessível e de baixo custo que não requer ferramentas ou instalações de fabricação especializadas. Este método será útil para a biofísica de molécula única e permitirá que mais pesquisadores realizem experimentos de molécula única em concentrações biologicamente relevantes de reagentes fluorescentes. Para criar uma superfície limpa para a deposição evaporativa de partículas coloidais, coloque lamínulas de vidro de borossilicato óptico nas inserções ranhuradas de um frasco de coloração de vidro Coplin.
Encha o frasco de coloração com acetona suficiente para cobrir as lamínulas e cubra o frasco. Sonicar o frasco por 10 minutos a 40 graus Celsius. Despeje a acetona e enxágue as lamínulas três vezes com água destilada.
Depois de repetir a sonicação e a acetona, encha o frasco com hidróxido de potássio suficiente para cobrir as lamínulas. Sonicar novamente o frasco, tapado, durante 20 minutos a 40 graus Celsius. Enxágue as lamínulas com água destilada seis vezes e, em seguida, sonicate-as em etanol por 10 minutos a 40 graus Celsius.
Depois de lavar as lamínulas três vezes com água destilada, pegue suavemente cada lamínula na borda usando uma pinça. Seque cada lamínula com gás nitrogênio e coloque cada lamínula limpa e seca e sua própria placa de Petri. Centrifugue 50 microlitros de esferas de poliestireno não funcionalizado de um mícron.
Descarte o sobrenadante, deixando o mínimo de água possível. Ressuspenda as esferas em 50 microlitros de solvente e misture bem por pipetagem. Para configurar uma câmara de umidade para deposição, organize seis placas de Petri em uma fileira.
Coloque uma lamínula em cada placa de Petri e deixe as tampas entreabertas com as lamínulas posicionadas para ficarem expostas ao ambiente. Centralize um higrômetro e um pequeno ventilador elétrico atrás das placas de Petri e registre a umidade relativa no laboratório. Encha um copo de 200 mililitros com 150 a 200 mililitros de água a aproximadamente 75 graus Celsius e coloque o copo atrás do ventilador.
Ligue o ventilador e cubra as placas de Petri, o ventilador, o béquer e o higrômetro com um recipiente de armazenamento de plástico transparente virado. Quando a umidade relativa atingir 70 a 75%, levante ligeiramente o recipiente de armazenamento de plástico e feche rapidamente as tampas das placas de Petri para evitar o excesso de umidade das lamínulas. Quando a umidade relativa na câmara atingir 85%, pipete cinco microlitros da suspensão do cordão no centro de cada lamínula.
Cubra cada placa de Petri imediatamente após a deposição e mantenha tudo coberto no recipiente de armazenamento entre as deposições. As deposições de contas devem ser concluídas o mais rápido possível para minimizar a perda de umidade. Se as deposições estiverem muito secas ou úmidas, a umidade da câmara é a variável mais importante a ser otimizada.
Quando todas as seis deposições estiverem completas, registre a umidade relativa na câmara e deixe as gotículas de contas se espalharem e secarem por cinco minutos. Para fornecer uma superfície de temperatura uniforme para o recozimento dos grânulos de poliestireno, coloque uma placa de alumínio plana e fresada em cima de uma placa quente de cerâmica padrão e defina a temperatura da placa quente para 107 graus Celsius, a temperatura de transição vítrea do poliestireno. Coloque uma lamínula contendo o gabarito de contas na placa de alumínio quente.
Depois de recozentá-lo por 20 segundos, remova a lamínula da placa de alumínio e coloque-a imediatamente em uma superfície de alumínio em temperatura ambiente para esfriar. Usando deposição evaporativa térmica, deposite 300 nanômetros de cobre a dois angstroms por segundo sobre lamínulas contendo os modelos de contas. Isso gerará postes nos interstícios entre as contas.
Para remover o excesso de cobre das contas, pressione suavemente um pedaço de fita adesiva na superfície e, em seguida, retire lentamente a fita. Dissolva as contas de poliestireno colocando as lamínulas em toleune e deixando-as durante a noite. Manuseando as lamínulas com cuidado, lave-as uma vez com clorofórmio e duas vezes com etanol.
Seque os modelos com nitrogênio. Coloque-os em um limpador de plasma de oxigênio por 30 minutos para remover polímeros residuais e contaminantes. Usando deposição evaporativa térmica, deposite três nanômetros de uma camada de adesão de titânio a um angstrom por segundo e, em seguida, deposite 100 a 150 nanômetros de alumínio a quatro angstroms por segundo ao redor e em cima dos postes de cobre.
Certifique-se de que as amostras não estejam girando durante a deposição, como é feito automaticamente em algumas unidades de deposição. Para dissolver os postes de cobre, mergulhe as lamínulas em ácido de cobre por duas horas. Depois de enxaguar as lamínulas em água destilada, seque-as com nitrogênio e, em seguida, lustre suavemente a superfície com papel para lentes para expor quaisquer postes que ainda estejam cobertos de revestimento.
Mergulhe as lamínulas em ácido de cobre por mais duas horas, depois enxágue-as novamente com água destilada e seque-as com nitrogênio. Após a passivação da superfície, as lamínulas de guia de onda de modo zero podem ser emparelhadas com lâminas de quartzo usando fita adesiva dupla face para fazer câmaras de fluxo microfluídico para imagens de molécula única. O sucesso da automontagem do molde coloidal depende criticamente da umidade relativa.
Em um modelo bem formado, a região das contas é circular com bordas definidas por um anel opaco de várias camadas. Em modelos bem formados, a maioria dos modelos deve conter contas hexagonalmente compactadas. Haverá alguns defeitos entre os grãos devido ao emperramento durante a sedimentação evaporativa.
Após a deposição de cobre e dissolução dos grânulos de poliestireno, os postes de cobre devem ter menos de 150 nanômetros de diâmetro. Para uma profundidade de deposição de cobre de 300 nanômetros, os postes têm cerca de 250 nanômetros de altura. Após a deposição do revestimento de alumínio e subsequente dissolução dos postes de cobre, os guias de onda devem ser visíveis por microscopia de força atômica e espaçados cerca de 550 nanômetros.
O recozimento dos modelos de poliestireno por 20 segundos produziu guias de onda de alumínio com um diâmetro de 118 nanômetros, suficientemente pequenos para cortar a propagação da luz visível. Um campo típico de ZMWs para imagens contém 3.000 guias de onda em um campo de visão de 40 por 80 mícrons. FRET de molécula única foi realizado para testar a funcionalidade do ZMW.
Traços de FRET de molécula única foram detectáveis em todas as concentrações de fluoróforo Cy5 ambiente testadas. Em comparação, moléculas únicas só seriam detectáveis na iluminação TERF com concentrações picomolares a nanomolares baixas. Após a fabricação do guia de onda de modo zero, os dispositivos podem ser passivados com polímeros para reduzir interações não específicas durante a imagem de molécula única.
Os fundos de vidro dos guias de onda de modo zero também podem ser levemente gravados para aumentar a emissão de uma única molécula. No geral, este novo método de fabricação de guia de onda de modo zero permitirá que os pesquisadores investiguem mais facilmente processos bioquímicos dinâmicos, como transcrição ou tradução em concentrações e taxas mais próximas das da célula.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método de litografia com nanoesferas para a fabricação paralela de guias de onda de modo zero, permitindo a imagem individual de moléculas em baixas concentrações de fluoróforos. O método utiliza a auto-organização de cristais coloidais para criar um molde de guia de onda em uma lamínula de vidro.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Biofísica
- Nanotecnologia
- Imagem individual de moléculas
Contexto
- As guias de onda em modo zero são essenciais para o estudo de moléculas individuais.
- Os métodos tradicionais de fabricação podem ser onerosos e exigem ferramentas especializadas.
- Este método tem como objetivo simplificar o processo.
- A auto-organização coloidal é uma técnica promissora para a criação de nanoestruturas.
Objetivo do Estudo
- Apresentar um método acessível para a fabricação de guias de onda de modo zero.
- Permitir que mais pesquisadores realizem experimentos com moléculas individuais.
- Facilitar estudos em concentrações biologicamente relevantes de reagentes fluorescentes.
Métodos Utilizados
- Uso de lamínulas de vidro borossilicato óptico.
- Sonicação em acetona para limpeza da superfície.
- Deposição evaporativa de partículas coloidais.
- Criação de um molde de guia de onda para imageamento.
Resultados Principais
- O método é de baixo custo e não requer ferramentas especializadas.
- Ele produz guias de onda eficazes para imagem de molécula única.
- Os pesquisadores podem obter imagens em concentrações de nano a micromolar.
- O protocolo é simples e reprodutível.
Conclusões
- Este método de litografia com nanoesferas democratiza o acesso a técnicas de imagem individual de moléculas.
- Abre novas possibilidades para pesquisas em biofísica de molécula única.
- Estudos futuros podem aproveitar este método para diversas aplicações em biologia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a imagem individual de moléculas em concentrações micromolares de fluoróforos, superando uma limitação fundamental em ensaios bioquímicos onde a fluorescência de fundo restringe as concentrações utilizáveis a faixas de pico- a nanomolar. Ao facilitar o estudo de processos moleculares em concentrações e taxas relevantes para células, ele possibilita uma validação de alvos mais fisiologicamente relevante e a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta. A acessibilidade dessa abordagem de fabricação de baixo custo amplia a utilidade das guias de onda de modo zero, estendendo-se além de instalações centrais especializadas para laboratórios mais amplos de P&D em biofármacos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas e a clarificação de vias ao possibilitar a observação de moléculas individuais em concentrações que refletem os níveis fisiológicos de ligantes.
- Valor Operacional: Reduz a dependência de equipamentos caros de nanofabricação, tornando a enzimologia de molécula única acessível a mais equipes de descoberta.
- Confiabilidade Preditiva: Apoia a redução de riscos biológicos por meio da visualização direta de interações de moléculas individuais em condições próximas às nativas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece uma plataforma para preparar sistemas biológicos validados que permitem avaliação confiável de compostos em concentrações mais altas e mais relevantes de fluoróforo.
- Valor Operacional: Melhora a padronização e reprodutibilidade dos ensaios por meio da fabricação paralela de milhares de guias de onda de modo zero utilizando equipamentos laboratoriais comuns.
- Escalabilidade: Permite reutilização e escalabilidade da plataforma para fluxos de trabalho de triagem posteriores, gerando matrizes uniformes de guias de onda.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Facilita o estudo de processos bioquímicos dinâmicos, como transcrição ou tradução, em concentrações e taxas mais próximas das encontradas na célula, aumentando a relevância para modelos de doenças.
- Desvio de Risco Mecanístico: Permite a observação de sinais de FRET de molécula única em concentrações micromolares, inatingíveis com a iluminação tradicional por fluorescência de reflexão interna total (TERF).
- Avanço Ajustado ao Risco: Apoia decisões baseadas em dados ao fornecer leituras quantitativas de molécula única que esclarecem o mecanismo e reduzem ambiguidades na otimização de compostos líderes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a fase inicial de testes de hipóteses até a identificação de compostos líderes, permitindo a caracterização biofísica que orienta a seleção e otimização de compostos antes da avaliação pré-clínica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a redução de riscos biológicos ao permitir a observação direta do comportamento de moléculas individuais em ambientes complexos.
- Triagem: Fornece nanoestruturas prontas para ensaios e reprodutíveis, com resultados quantitativos que permitem a comparação da ligação de ligantes ou da atividade enzimática entre diferentes condições.
- Análises: Oferece leituras de fluorescência e FRET em nível de molécula única que fornecem informações cinéticas e mecanicistas de alta resolução, superiores às médias de população.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas científicas à relevância pré-clínica ao possibilitar estudos em concentrações próximas às fisiológicas e em condições de crowding molecular.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade de fabricação reutilizável que pode ser compartilhada entre departamentos, reduzindo a dependência de serviços externos de nanofabricação.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista por meio da visualização direta de moléculas individuais.
- Valor Operacional: Melhora a padronização, reprodutibilidade e produtividade por meio da fabricação paralela utilizando equipamentos acessíveis, como evaporadores térmicos e placas aquecedoras.
- Valor Estratégico: Aumenta a eficiência do capital e permite decisões mais assertivas de prosseguimento ou interrupção ao gerar dados biofísicos confiáveis em estágios iniciais do processo de descoberta.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao fornecer clareza mecanicista que reduz a desistência em fases tardias devido a comportamentos biológicos inesperados.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em auto-organização coloidal, evaporação térmica e protocolos de limpeza de superfícies.
- Depende do acesso a um evaporador térmico, placa aquecedora, sonicator e equipamentos básicos de laboratório de química para deposição e gravação de metais.
- Necessita padronização do depósito de microesferas em ambientes com umidade controlada para garantir a formação consistente do molde de guia de onda.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método a diferentes materiais de substrato ou metais de guia de onda (por exemplo, alumínio versus ouro).
- Inclui limitações práticas, como sensibilidade à umidade relativa durante a auto-organização das microesferas e a necessidade de manipulação cuidadosa para evitar defeitos no molde.
