Um ensaio de eletroquimioluminescência de alto rendimento 7-plex rastreando simultaneamente diabetes tipo 1 e múltiplas doenças autoimunes
29 de maio de 2020
Modelamos um ensaio de ECL multiplexado simples que combina 7 ensaios de autoanticorpos juntos. O ensaio é capaz de rastrear DM1 e várias outras doenças autoimunes, simultaneamente, incluindo doença celíaca, doença tireoidiana autoimune e síndrome poliglandular autoimune 1.
O ensaio de eletroquimioluminescência pode rastrear simultaneamente diabetes tipo 1 e outras doenças autoimunes relevantes, incluindo doença criogênica autoimune, doença celíaca e síndrome poliglandular autoimune-1. O ensaio ECR muito complexo combina até 10 ensaios de anticorpos múltiplos em um único poço, resultando em um alto rendimento, menos bibliotecas e ensaio mais barato que requer um volume menos amplo. Demonstrando o procedimento estará Xiaofan Jia, um post do meu laboratório.
Para preparar uma solução mista de antígeno acoplado a ligante, primeiro selecione a concentração ideal para cada antígeno, com base no ensaio quadriculado, e dilua o antígeno marcado com biotina e rutênio até a concentração de trabalho racional. Para ligar diferentes ligantes a cada um dos antígenos biotinilados exclusivamente, para um ensaio de 96 bem reproduzido, misturou 240 microlitros de um ligante conjugado com STREPTAVIDIN apropriado com 4 microlitros das proteínas biotiniladas de interesse. Em seguida, adicione 156 microlitros de 1% BSA por tubo e incube a mistura em temperatura ambiente por 30 minutos.
No final da incubação, adicione 160 microlitros de solução de parada a cada tubo e incube os tubos em temperatura ambiente por mais 30 minutos. No final da incubação, remova 400 microlitros de antígeno acoplado ao ligante de cada tubo e puxe todas as sete suspensões de antígeno em um único tubo. Em seguida, adicione 1,2 mililitros de solução de parada e 4 microlitros de GAD65, TPO, tTg, ThG, interferon-alfa pró-insulina e antígeno IA-2 marcados com Ru sulfo-NHS à mistura.
Antes de incubar amostras de soro com a mistura de antígenos marcada, adicione 15 microlitros de soro por poço de uma placa de PCR de 96 poços e misture 18 microlitros de ácido 0,5 molar com cada poço de soro para uma incubação de 45 minutos em temperatura ambiente. Durante a incubação, adicione 35 microlitros de antígeno e 13 microlitros de tampão Tris molar por poço de uma nova placa de PCR de 96 poços. No final da incubação, transfira imediatamente 25 microlitros do soro tratado com ácido para cada poço da placa de antígeno.
Cubra a placa com papel alumínio de PCR e coloque a placa em um agitador em baixa velocidade em temperatura ambiente por uma hora. No final da incubação, coloque a placa a 4 graus Celsius por 18 a 24 horas. Retire o prato da geladeira e deixe-o atingir a temperatura ambiente.
Em seguida, adicione 150 microlitros de tampão A bloqueador de 3% a cada poço. Quando todos os poços tiverem sido tratados, cubra a placa com papel alumínio e coloque-a em uma geladeira a 4 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, vire a placa de cabeça para baixo e lave as amostras três vezes com 150 microlitros de PBS-T por poço, por lavagem.
Bata na placa até que nenhum tampão permaneça em nenhum dos poços. Adicione 30 microlitros de incubação de antígeno sérico em cada poço. Quando todas as incubadas tiverem sido adicionadas, cubra a placa com papel alumínio e coloque a placa em uma coqueteleira em velocidade baixa por uma hora, em temperatura ambiente.
No final da incubação, remova as incubadas sacudindo e lave os poços três vezes com 150 microlitros de PBS-T por poço, conforme demonstrado. Após a última lavagem, adicione 150 microlitros de tampão de leitura a cada poço e leia a placa em um leitor de placas, em contagens por segundo. Nesta análise de uma grande coorte de amostras de 1026 pacientes com diabetes tipo 1 recém-diagnosticados, os níveis de autoanticorpos de um ensaio de sete mais eletroluminescência foram comparados com os níveis de cada ensaio de eletroluminescência único estabelecido correspondente e de cada ensaio de ligação de rádio padrão único correspondente e ELISA.
As especificidades do ensaio foram idênticas nos percentis 99 para todos os ensaios de autoanticorpos, exceto para autoanticorpos da tireoide, para os quais o percentil 95 foi usado. Um pequeno número de amostras discordantes para cada um dos sete autoanticorpos foi encontrado em torno do limite dos pontos de corte para cada ensaio. Aqui, os dados correspondentes para 1022 controles saudáveis para cada ensaio podem ser observados.
A coisa mais importante a lembrar é encontrar um ligante diferente para cada um dos antígenos biotinilados exclusivamente e misturar cada antígeno com as propriedades para fornecer o ligante conjugado. Essa técnica de ensaio permitirá que os pesquisadores planejem a triagem de várias doenças autoimunes simultaneamente em populações de grande escala e permitirá que as clínicas rastreiem facilmente várias doenças relevantes com diabetes tipo 1.
Visão Geral
Este estudo apresenta um ensaio multiplexado de eletroquimioluminescência (ECL) que permite a triagem simultânea de diabetes tipo 1 e diversas doenças autoimunes. O ensaio combina múltiplos testes de autoanticorpos em um único poço, aumentando a eficiência e reduzindo os custos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Autoimunidade
- Diagnóstico
- Ensaios de eletroquimioluminescência
Antecedentes
- A diabetes tipo 1 (T1D) está frequentemente associada a outras doenças autoimunes.
- Ensaios tradicionais podem exigir múltiplos testes, aumentando o tempo e os custos.
- Ensaios multiplexos podem agilizar o processo diagnóstico.
- A eletroquimioluminescência oferece alta sensibilidade e especificidade.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um ensaio ECL multiplexado para triagem de DMT1 e doenças autoimunes relacionadas.
- Comparar o desempenho do ensaio multiplexado com ensaios únicos estabelecidos.
- Facilitar a triagem em larga escala em ambientes clínicos.
Métodos Utilizados
- Preparação de soluções de antígenos conjugados com ligantes mistos.
- Incubação de amostras de soro com antígenos marcados.
- Uso de um formato de placa de 96 poços para triagem de alto rendimento.
- Comparação dos níveis de autoanticorpos em pacientes com DM1 e controles saudáveis.
Resultados Principais
- O ensaio multiplex demonstrou especificidade comparável à dos ensaios individuais.
- Identificou um pequeno número de amostras discordantes próximas aos limites de corte.
- Forneceram dados de uma grande coorte de pacientes recém-diagnosticados com DMT1.
- Permitiu triagem eficiente para múltiplas doenças autoimunes.
Conclusões
- O ensaio ECL multiplexado é uma ferramenta viável para triagem simultânea.
- Este método pode aumentar a eficiência diagnóstica na prática clínica.
- Recomenda-se nova validação em populações maiores.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A detecção simultânea de múltiplos autoanticorpos em um único poço aborda um gargalo crítico na triagem em larga escala de doenças autoimunes, reduzindo a complexidade do ensaio e o consumo de recursos. Essa abordagem eletroquimioluminescente multiplexada aumenta a confiança preditiva na identificação precoce de doenças, fornecendo leituras correlacionadas de biomarcadores em diabetes tipo 1 e condições autoimunes comórbidas. O ensaio apoia a triagem de portfólios e a redução de riscos mecanicistas no desenvolvimento de imunoterapias, permitindo a estratificação eficiente de pacientes com base em perfis de múltiplos autoanticorpos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da correlação entre agrupamentos de autoanticorpos e endotipos da doença em modelos pré-clínicos.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos mediante a validação funcional de respostas imunes específicas ao antígeno em sistemas relevantes para a doença.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança na seleção de alvos ao identificar subgrupos de pacientes com assinaturas convergentes de autoanticorpos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara painéis padronizados e quantitativos de biomarcadores para campanhas de triagem posteriores que exigem alta reprodutibilidade.
- Valor Operacional: Garante prontidão para ensaios por meio de complexos antígeno-ligante imobilizados que asseguram ligação consistente em fase líquida entre poços.
- Escalabilidade: Facilita a reutilização da plataforma para triagem de até 10 autoanticorpos por poço, aumentando a produtividade sem necessidade de readequação.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Alinha-se a sistemas relevantes para doenças ao detectar autoanticorpos associados à progressão clínica no diabetes tipo 1 e em distúrbios autoimunes comórbidos.
- Avanço Ajustado ao Risco: Apoia decisões de continuidade ou interrupção ao identificar pacientes com perfis de autoanticorpos de alta penetrância, preditivos de autoimunidade multissistêmica.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Reduz ambiguidades na interpretação dos mecanismos imunológicos por meio da medição simultânea de autoanticorpos contra ilhotas pancreáticas, tireoide, intestino e vias de interferon.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio atua como uma ponte entre descoberta e aplicação translacional, permitindo o fenotipagem imunológico precoce que orienta a identificação de compostos promissores e as etapas de validação pré-clínica por meio de perfis multiplexados de autoanticorpos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao associar padrões de coexpressão de autoanticorpos a vias patogênicas na patogênese autoimune.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis que permitem a comparação de respostas imunes entre diferentes condições de tratamento ou origens genéticas.
- Análises: Oferece leituras normalizadas em contagens por segundo, permitindo a comparação estatística dos níveis de autoanticorpos entre coortes de pacientes e controles.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao validar painéis de biomarcadores em amostras humanas que refletem a desregulação imunológica associada à doença.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de imunoensaio reutilizável, adaptável a outros painéis de doenças autoimunes ou inflamatórias além da configuração inicial de 7 analitos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir falsos negativos por meio da medição simultânea de autoanticorpos.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade ao eliminar a variabilidade entre poços por meio da apresentação de antígeno imobilizado.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao consolidar sete testes diagnósticos em uma única etapa do fluxo de trabalho.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos terapêuticos com base em populações de pacientes definidas por biomarcadores.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em design de imunoensaios e química de ligantes para imobilização de antígenos.
- Depende de leitora de placas capaz de detecção por eletroquimioluminescência em formato de 96 poços.
- Necessita padronização de protocolos de bloqueio e lavagem entre os centros em estudos multicêntricos.
- Requer adaptação das concentrações de antígenos ao estender-se a novos alvos de autoanticorpos além dos sete originais.
- Limitado pela necessidade de pares ligante-antígeno otimizados para prevenir reatividade cruzada em formato multiplex.
