Name: Esclarecimento Primário do Fluido de Cultura Celular Colhida cho usando um separador acústico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Aprenda a usar um separador acústico para clarificação primária de culturas de células CHO. Este método oferece vantagens em bioprocessamento contínuo, reduzindo riscos de contaminação e aumentando a eficiência da separação celular.

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Os autores gostariam de reconhecer Nilou Sarah Arden e Zhong Zhao por sua revisão construtiva deste manuscrito. Os autores também gostariam de agradecer a Lindsey Brown pela contribuição essencial durante este projeto. O financiamento interno parcial e apoio para este trabalho foi fornecido pelo Programa CDER Critical Path (CA #1-13) e pelo CDER Manufacturing Science, Innovation Center of Excellence Program (Berilla-CoE-19-49). Este projeto foi apoiado em parte pelo Programa de Participação em Estágio/Pesquisa no Escritório de Produtos de Biotecnologia, Administração de Alimentos e Medicamentos dos EUA, administrado pelo Oak Ridge Institute for Science and Education através de um acordo interagências entre o Departamento de Energia dos EUA e a FDA.
Esta publicação reflete as opiniões do autor e não deve ser interpretada para representar as opiniões ou políticas da FDA.

1. Preparação da AWS
NOTA: Este protocolo foi desenvolvido utilizando uma câmara acoustopforética. No entanto, o AWS em escala de banco tem cinco sondas de turbidez que podem operar 4 câmaras acoustopforéticas em série, se necessário.
<ol><li>Conecte os cabos de turbidez em suas respectivas portas rotuladas como F, 1, 2, 3, 4 (por exemplo, sonda de turbidez 1 na Figura 1c e porta 1 na Figura 2a) e os cabos BNC de potência de câmara na parte de trás do sistema AWS rotulados como 1, 2, 3, 4(Figura 2b). NOTA: Não conecte a outra extremidade do cabo BNC de potência da câmara(Figura 3c) à parte de trás da câmara acoustopforética(Figura 3d) até o passo 2.6 quando a câmara estiver cheia de fluido. Se a potência da câmara for ligada sem fluido na câmara, danificará o transdutor piezo na câmara e não funcionará mais.</li>
	<li>Insira as sondas de turbidez no medidor de turbidez e na carcaça do termômetro e aperte os parafusos(Figura 1c e Figura 3).</li>
	<li>Conecte a tubulação de alimentação à entrada da porta de turbidez de alimentação(Figura 4a)através da bomba de alimentação (Figura 1b a 1c).</li>
	<li>Conecte o tubo y da saída da porta de turbidez de alimentação(Figura 4b) às portas de entrada da câmara acoustopforética(Figura 4c).</li>
	<li>Conecte a tubulação estágio1 da porta de resíduos da câmara acoustopforética(Figura 4d) através da bomba estágio1 a um recipiente de coleta de células(Figura 1d via 1e a 1f).</li>
	<li>Conecte a tubulação da porta permeada da câmara acoustopforética(Figura 4e) à entrada da porta de turbidez sonda1(Figura 4f).</li>
	<li>Conecte a tubulação de colheita de fora da porta de turbidez sonda1(Figura 4g) a um vaso de coleta de produto(Figura 1c a 1g).</li>
</ol>2. Prime o sistema com HCCF
NOTA: Este protocolo foi desenvolvido utilizando células CHO-K1 cultivadas em meio quimicamente definido (ActiCHO P com 6 mM L-glutamina) produzindo o anticorpo monoclonal IgG1 VRC0113 e pode precisar ser ajustado para outras linhas e produtos celulares. O HCCF utilizado neste protocolo foi obtido no final de 7-8 dias de culturas CHO-K1 a partir de um frasco agitado ou processo bioreator.
<ol><li>Ligue o AWS ligando os interruptores de alimentação na parte traseira e frente do AWS.</li>
	<li>Ligue o computador e clique duas vezes no ícone da mesa para o software associado (ver Tabela de Materiais). Do painel "Leituras", pressione o botão "Iniciar teste" para iniciar a gravação de dados (Figura 5). Uma vez iniciado o registro de dados, todos os dados coletados serão registrados em uma planilha exportável até que o teste seja interrompido.</li>
	<li>Conecte a extremidade da tubulação de alimentação ao vaso HCCF que está sendo agitado.</li>
	<li>Inicie a bomba de alimentação digitando a taxa de bomba na tela "Controles" dentro da "Imagem da Bomba de Alimentação" epressione" Enter " no teclado. Certifique-se de que o " Ícone daseta de direçãoda bomba " (sentido horário ou no sentido anti-horário) esteja corretamente selecionado na caixa cinza à direita da imagem da bomba de alimentação para bombear HCCF do vaso para a câmara acoustopforética. Clique no "Ícone do Triângulo" ao lado das palavras " Ligue"dentro da caixa cinza sob a imagem da bomba de alimentação para "Iniciar" a bomba (Figura 6a). NOTA: A taxa máxima de bomba é de 10 L/h (167 mL/min), mas recomenda-se que a taxa de fluxo nominal, de 60 mL/min, seja usada para esta etapa para encher rapidamente o tubo e a câmara sem correr o risco de sobrecarregar a câmara antes do início da separação.</li>
	<li>Monitore as medidas de turbidez alimentar observando o "Painel de Redução percentual"(Figura 5c) durante o preenchimento da câmara acoustopforética. Os valores de turbidez permanecerão consistentes durante o carregamento da câmara se o HCCF estiver sendo misturado suficientemente no vaso HCCF.</li>
	<li>Uma vez que o líquido esteja acima do transdutor piezo na parte de trás da câmara acoustopforética,pressione" Desligar " dentro da caixa cinza sob a imagem da bomba de alimentação para parar a bomba. Conecte o cabo de alimentação BNC(Figura 3c) à câmara acoustopforética(Figura 3d). NOTA: O volume de espera de cada câmara acoustopforética é de cerca de 190 mL.</li>
</ol>3. Operação da AWS
<ol><li>Uma vez que a câmara acoustopforética esteja preenchida e o cabo de alimentação BNC esteja conectado à parte de trás da câmara acoustopforética, altere a taxa de alimentação da bomba de alimentação para a taxa de funcionamento desejada(Figura 6a e Tabela 1). Várias taxas de bomba de alimentação devem ser testadas para identificar os parâmetros de operação ideais para um determinado processo.</li>
	<li>Ligue o poder piezo do palco 1 deslizando a barra no módulo de alimentação para 10 W(Figura 6d) e pressionando o ícone "Ligue" no lado direito da caixa do Estágio 1(Figura 6c). Conforme sugerido pelo fabricante, use 10 W, a configuração de alimentação recomendada para células CHO. Isso vai gerar uma frequência fixa de 2 MHz para operação. Após vários segundos, as células começarão a aglomerados visivelmente nos nódulos de onda na câmara acoustopforética(Figura 7a).</li>
	<li>Uma vez que as células comecem a se fixar na parte inferior da câmara acoustopforética(Figura 7b),inicie a bomba estágio1 com uma taxa adequada com base na densidade celular e na taxa da bomba de alimentação(Figura 6b). Com base na otimização do fabricante e na planilha de operação de estado estável, a taxa de bomba estágio1 pode ser calculada com base na massa celular embalada e na taxa de fluxo de alimentação usando a seguinte equação <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ01.jpg"><ol>
<li>Para calcular a massa celular embalada, renas uma balança com um tubo vazio de 15 mL (ou outro tubo compatível com centrifugação). Encha o tubo com material de alimentação e regise o peso total do tubo com alimentação. Centrifugar o tubo por 10 min a 3.700 x g. Decante o supernatante em um recipiente separado. Meça o peso do tubo com a pelota celular. A porcentagem de massa celular embalada do material alimentar = (peso do tubo decantado/peso do tubo preenchido) x 100%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monitore o perfil de turbidez da turbidez estágio 1 à medida que o transbordamento da câmara acoustopforética entra na sonda de turbidez1(Figura 8).</li>
	<li>À medida que a separação celular continua, a eficiência de remoção celular <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg"> aumentará.</li>
	<li>Além disso, monitore a diferença de temperatura entre alimentação e estágio1, pois aumentará à medida que a separação celular continuar(Figura 9). A temperatura pode aumentar quando a alimentação de maior densidade celular é usada, mas geralmente pode ser reduzida alterando a taxa de fluxo de alimentação. NOTA: Ao usar várias câmaras acoustopforéticas, pode-se conectar sequencialmente o tubo da câmara acoustopforética anterior através de sondas de turbidez à entrada da câmara acoustopforética atual. Além disso, pode-se conectar tubos de estágio a partir da parte inferior das câmaras acoustopforéticas através de bombas de estágio para vasos de coleta de células. Um total de quatro câmaras acoustopforéticas podem ser conectadas em série para uma eficiência ideal de remoção celular, se necessário.</li>
</ol>4. Terminando AWS
<ol><li>Quando a corrida terminar, pare a alimentação e a bomba estágio 1 pressionando Desligue dentro da caixa cinza sob a bomba de alimentação e as imagens da bomba estágio 1, respectivamente, para parar as bombas.</li>
	<li>Desligue a energia da câmara pressionando Desligar no lado direito da caixa do Estágio 1 e desconectar o cabo de alimentação BNC.</li>
	<li>Leve o material de colheita do produto coletado para maiores procedimentos de esclarecimento e purificação, como filtragem de profundidade e métodos de cromatografia. Descarte o material de colheita celular.</li>
	<li>Escorra o fluido restante na câmara acoustopforética colocando o tubo de resíduo em um vaso vazio, desconectando o tubo da entrada da câmara acoustopforética e permeando portos e liberando o tubo de resíduos da cabeça da bomba.</li>
	<li>Reconecte a tubulação, coloque o tubo de resíduo de volta na cabeça da bomba e flua através da água DI do final da tubulação de alimentação usando uma taxa de bomba de alimentação de 60 mL/min e taxa de bomba estágio1 de 60 mL/min. Continue por 15-20 min. Descarte o fluxo através.</li>
	<li>Bombeie 70% de álcool isopropílico (IPA) através da tubulação e da câmara usando a bomba de alimentação por 15-20 min. Descarte o fluxo através.</li>
	<li>Repita o procedimento de limpeza com água DI para limpar os tubos e a câmara usando a bomba de alimentação por 15-20 min. Descarte o fluxo através.</li>
	<li>Desmonte o tubo das sondas de turbidez e câmaras acoustopforéticas e limpe a área com 70% de IPA.</li>
	<li>Desmonte as sondas de turbidez e limpe dentro das sondas de turbidez com 70% de IPA. Deixe todas as peças secarem e depois se remontem para o próximo uso. NOTA: As câmaras acoustopforéticas são fabricadas para uso único, mas podem ser reutilizadas se manuseadas e limpas adequadamente, conforme descrito neste protocolo.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm interesses financeiros nos produtos descritos neste manuscrito e não têm mais nada a revelar.

Descrito é um protocolo passo-a-passo para a implementação de um AWS em escala de banco no esclarecimento primário de um modelo de anticorpo monoclonal de HCCF de uma linha celular CHO. Como mostrado nos resultados representativos, o uso da AWS no esclarecimento primário resultou em esclarecimento celular efetivo e recuperação do produto. Além disso, o baixo nível de manutenção e requisitos operacionais e a capacidade de scale-up permitem um potencial de aplicação mais amplo no esclarecimento primário.
É importante ressaltar que os resultados representativos sugerem que a taxa de bomba de alimentação é fundamental para a separação das células. Além disso, devido a limitações na detecção de alta densidade celular na medição da turbidez, a densidade celular de trabalho é outro fator a ser considerado ao usar um sistema AWS. Como a sonda de turbidez será saturada ao executar material de alimentação de alta densidade celular, pode ser melhor calcular a eficiência de separação celular medindo as densidades celulares do material alimentar e o fluido de cultura celular esclarecido offline. Com uma medição de esclarecimento off-line precisa, uma estratégia de processo que pode ser considerada na resolução desses problemas é usar várias câmaras em série. Embora este protocolo esteja focado principalmente no uso de uma única câmara, este sistema pode operar três câmaras adicionais para esclarecimento sequencial das células que podem afetar minimamente a condição das células e resultar em alta recuperação do produto. Além disso, outros parâmetros, como energia para AWS e taxas de fluxo de remoção de células, podem ser ainda mais otimizados para tipos de células específicas ou modo de operação. No geral, recomenda-se uma otimização dos parâmetros de operação e estratégia utilizando essas considerações antes da implementação da AWS.
Entre muitos potenciais de aplicação, o uso de AWS em bioprocessamento contínuo é promissor. Como a AWS pode substituir a centrifugação e reduzir drasticamente a área da superfície do filtro14,o uso de AWS permitiria um fluxo constante de material livre de células para processos subsequentes de filtragem e cromatografia compatíveis com a biomataturação contínua. Devido a essa compatibilidade e disponibilidade de tecnologia de perfusão para alta densidade celular (por exemplo, >50 x 106 células/mL) e maior duração da cultura (por exemplo, >14 dias), a AWS tem o potencial de desenvolver uma nova estratégia de sangramento celular contínuo, além do esclarecimento primário.
Em alguns casos, até 30% da proteína terapêutica produzida é removida durante a operação de estado estável no material de sangramento celular15,16. Além disso, para que os anticorpos monoclonais removidos sejam agrupados com o material coletado padrão, certos atributos de qualidade devem ser atendidos. Quando essas especificações não são atendidas, o resultado pode ser uma rejeição do material que pode afetar o rendimento do produto. Para compensar essa perda de produto, um esclarecimento contínuo do material de sangramento celular utilizando AWS pode ser implementado em uma condição de estado estável durante um processo de perfusão de longo prazo17. Essa estratégia pode reduzir a perda do produto no material de sangria e utilizar mais da proteína produzida. Além disso, as células após o esclarecimento contínuo usando AWS poderiam potencialmente ser adicionadas de volta ao bioreator se desejadas para maior densidade celular e produtividade. Assim, o esclarecimento contínuo do material de sangramento celular com AWS pode oferecer uma oportunidade para aumentar o rendimento e/ou diminuir a área de superfície do filtro secundário em um determinado processo.
Em resumo, a utilidade da AWS não se limita a um simples esclarecimento primário, mas pode ter utilidade para aplicações em bioprocessamento contínuo que podem melhorar a taxa de fabricação e a flexibilidade operacional.

Um passo crítico em um processo de biomafafacturing envolvendo proteínas terapêuticas secretadas é a remoção da biomassa do fluido de cultura celular colhida (HCCF). Tradicionalmente, os biomanufaturadores têm adotado a centrifugação seguida da filtragem de profundidade como seus principais métodos de esclarecimento na produção de anticorpos monoclonais1. No entanto, a centrifugação pode levar a um alto estresse de tesoura nas células, resultando em aumento de detritos celulares no HCCF. Isso pode potencialmente levar à incrusção do filtro durante a filtragem e resultar em contaminantes extras pós-filtração que podem reduzir posteriormente a eficiência da cromatografia a jusante1,2,3. Além disso, a personalização das centrífugas para um determinado processo pode ser cara e pode exigir conexões adicionais para sistemas limpos no local e esterilizados no local que também podem ser um fator limitante para a escalabilidade. O uso de filtros de profundidade pode compensar as limitações da centrifugação e também aproveitar a tecnologia de uso único4. No entanto, os filtros de profundidade são usados principalmente como esclarecimento secundário porque não podem suportar altas densidades de cultura celular5. Alternativamente, dispositivos de retenção de células de filtragem de fluxo tangencial (TFF) foram empregados para mitigar o estresse da cisalhamento, mas podem experimentar desafios como a polarização da membrana e os baixos rendimentos da colheita6. As questões acima decorrentes do uso de centrifugação mais filtragem de profundidade ou TFF criam uma oportunidade para a melhoria do processo de esclarecimento primário do HCCF.
A separação acústica foi introduzida como uma tecnologia que pode ser utilizada para a colheita de proteínas secretadas de culturas celulares com produtos proteicos de alta qualidade7,8. A separação acústica é alcançada através da propagação e reflexão de ondas permanentes multidimensionais que interagem com fluidos suspensos e partículas retidas9,10. Essas partículas experimentam três forças: arrasto de fluidos, gravidade e radiação acústica. Quando cada uma das forças se opõe igualmente umas às outras, atingindo o equilíbrio, as partículas são suspensas e presas dentro da onda ultrassônica em pé10. Em uma suspensão da cultura celular, as células são mantidas dentro deste plano de nódulo de pressão de ondas paradas, o nó cresce à medida que as células se fundem, e eventualmente esses aglomerados de nós celulares caem da força gravitacional9. Essas células sedimentadas são então removidas da mídia, o que permite que a mídia clarificada seja bombeada para um processamento mais a jusante. A utilização de ondas ultrassônicas como método de separação começou a se traduzir em aplicações biológicas que vão desde a separação de partículas lipídicas e glóbulos vermelhos11 até a cultura celular de perfusão de mamíferos12. Com suas capacidades relativas para reduzir custos, mão-de-obra e estresse celular, evitando centrifugação, filtragem de profundidade ou TFF, os biomanufadores estão explorando as aplicações potenciais do uso da separação acústica.
Este estudo fornece um protocolo geral para operar um separador de ondas acústicas (AWS) para esclarecimento da cultura celular CHO, apresenta dados representativos e demonstra como alcançar esclarecimentos celulares eficazes e recuperação de produtos.

<table><tbody><tr><td>Câmara acústica</td><td>Pall</td><td>CAS-AC-K1 Kit</td><td></td>de câmara acústica de cadência</tr><tr><td>ActiCHO P</td><td>GE</td><td>SH31025.01</td><td>meio em pó</td></tr><tr><td>AWS</td><td>Pall</td><td>CAS-SYS (60500101-SP)</td><td></td></tr><tr><td>Software de Separador Acústico de Cadência</td><td>Pall</td><td>Interface de Separador Acústico de Cadência Ver. 1.0.4</td><td></td></tr><tr><td>células CHO-K1</td><td>VRC</td><td>VRC01</td><td></td></tr><tr><td>Computador</td><td>Dell</td><td>Latitude 3470</td><td>Windows 7, sistema operacional de 64 bits</td></tr><tr><td>Isopropanol (70%)</td><td>LabChem</td><td>LC157605</td><td>20L preparado 70% IPA</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Corning</td><td>25-005-CV</td><td>200 mM solução de estoque</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 14 tubulação</td><td>Cole-Parmer</td><td>96400-14</td><td>tubulação de silicone curada com peróxido, 25ft</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 16 tubulação</td><td>Cole-Parmer</td><td>96400-16</td><td>tubulação de silicone curada com peróxido,</td></tr><tr><td>conjunto de tubulação</td> de 25 pés <td>Pall</td><td>CAS-FP-K1 Conjunto</td><td></td>de tubulação</tr><tr><td>Sonda de turbidez</td><td>Pall</td><td>CAS-TS-S1 (60500106)</td><td></td></tr></tbody></table>

esclarecimento primário do fluido de cultura celular colhida cho usando um separador acústico

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

O esclarecimento primário é um passo essencial em um processo de biomamatificação para a remoção inicial de células de produtos terapêuticos dentro do fluido de cultura celular colhida. Embora métodos tradicionais como centrifugação ou filtragem sejam amplamente implementados para remoção de células, os equipamentos para esses processos têm grandes pegadas e a operação pode envolver riscos de contaminação e incrustação de filtros. Além disso, os métodos tradicionais podem não ser ideais para esquemas contínuos de bioprocessamento para esclarecimento primário. Assim, uma aplicação alternativa usando ondas acústicas (sonoras) foi investigada para separar continuamente as células do fluido da cultura celular. Apresentado neste estudo é um protocolo detalhado para o uso de um separador de ondas acústicas em escala de banco (AWS) para a separação primária do fluido cultural contendo um anticorpo IgG1 monoclonal de uma colheita bioreatorial de células CHO. Os dados representativos são apresentados da AWS e demonstram como alcançar esclarecimentos celulares eficazes e recuperação do produto. Finalmente, são discutidas aplicações potenciais para AWS em bioprocessamento contínuo. No geral, este estudo fornece um protocolo prático e geral para a implementação da AWS em esclarecimento primário para culturas celulares CHO e descreve ainda seu potencial de aplicação em bioprocessamento contínuo.

Como descrito no protocolo, o AWS foi usado para esclarecer hccf a uma densidade de 12,4 x 106 células/mL, como mostrado na Figura 1. A bomba de alimentação foi definida para 3,5 mL/min (5 L/dia), representando uma taxa de sangramento celular dentro da faixa de presumida adequada para uma cultura de 10-20 L. À medida que o HCCF entrou na câmara AWS, as medidas de turbidez da sonda de turbidez alimentar permaneceram consistentes, cerca de 1.000-1.100 NTU, e as medições da sonda de turbidez sonda 1 permaneceram em torno de 40-50 NTU(Figura 8). Usando as duas medidas, eficiência de remoção celular
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg">
foi calculado e média de 95%. Verificou-se que uma medição de turbidez de 40-50 NTU era o nível mínimo de turbidez alcançável e, portanto, nenhuma separação adicional de uma câmara adicional de AWS em série era viável.
Embora o AWS pudesse se separar com alta eficiência a taxas de fluxo mais baixas, manter o HCCF por mais tempo dentro da câmara causou aumentos de temperatura, o que deve ser uma consideração ao selecionar taxas de fluxo mais baixas. A Figura 9 é um exemplo da diferença de temperatura do HCCF antes de entrar na câmara acoustopforética e após a separação acústica a uma taxa de fluxo de alimentação de 3,5 mL/min, que mostrou um aumento &gt;6 °C na temperatura devido ao tempo prolongado dentro da câmara acústica.
Outra consideração importante ao executar colheitas de alta densidade celular (ou seja, &gt;20 x 106 células/mL) é a saturação das sondas de turbidez. As medidas de turbidez para a sonda de turbidez alimentar ficaram saturadas em mais de 4.400 NTU(Figura 10),o que pode resultar em subestimação no cálculo da eficiência de remoção celular.
Para testar o efeito de diferentes taxas de alimentação no esclarecimento celular, a eficiência de remoção celular foi medida em diferentes taxas de alimentação. Como mostrado na Figura 11,a eficiência de remoção de células diminuiu significativamente de ~100% para 57% à medida que a taxa de bomba de alimentação aumentava. Em geral, quanto mais lenta a taxa de bomba de alimentação, melhor o esclarecimento celular. No entanto, a otimização da taxa de alimentação é recomendada para cada aplicação.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig01.jpg"> Figura 1: Configuração AWS. Uma vez que as bombas foram ligadas com o software(a ), o HCCF foi canalizado através de uma bomba de alimentação (b) através da sonda de turbidez de alimentação(c) e depois para a câmara AWS(d). Dentro da câmara, forças acústicas aprisionaram células do fluxo em nódulos de ondas e causaram desajeitados. A diminuição da flutuação fez com que as células caíssem através da força gravitacional, e as células foram removidas da porta de resíduos da câmara acoustopforética via bomba estágio 1(e)para uma garrafa de colheita celular (f)enquanto o material esclarecido saiu para a sonda de turbidez sonda(c)através do porto permeado da câmara para uma garrafa de colheita de produtos(g). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig02.jpg"> Figura 2: Parte de trás do sistema AWS. As sondas de turbidez e as câmaras estão conectadas às suas respectivas portas na parte de trás do sistema AWS via ethernet sonda de turbidez(a) e cabos BNC(b)de potência de câmara. Além disso, o computador é conectado via cabo ethernet pc(c). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig03.jpg"> Figura 3: Sondas de turbidez e habitação. Cada sonda de turbidez (a) deve ser devidamente inserida no respectivo medidor de turbidez e na carcaça do termômetro(b)e apertada com os parafusos. O cabo BNC de potência de câmara(c)deve ser conectado à parte de trás da câmara acoustopforética(d)somente após o transdutor piezo na câmara estar cheio de fluido. As sondas são indicadas como seguintes: F = turbidez alimentar, 1 = sonda1 turbidez, e 2, 3 e 4 são sondas não utilizadas (ou podem ser usadas para serializar o procedimento). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig04.jpg"> Figura 4: Conexão entre a carcaça de turbidez e a câmara acoustopforética. A tubulação de alimentação está conectada à entrada da porta de turbidez de alimentação (a) através da bomba de alimentação. A saída da porta de turbidez de alimentação (b) está conectada às portas de entrada da câmara acoustopforética(c)através de tubos y. A tubulação estágio1 é conectada a partir do porto de resíduos da câmara acoustopforética(d)através da bomba estágio1 a um vaso de coleta de células. A porta permeada da câmara austopforética (e)está conectada à entrada da porta de turbidez sonda1(f). A tubulação de colheita é conectada de fora da porta de turbidez probe1 (g) a um navio de coleta de produtos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig05.jpg"> Figura 5: Painel de leituras no software Separador Acústico. O programa tem dois painéis, "Leituras" e "Controles". Dentro do painel "Leituras", a turbidez (a),temperatura(b)e redução percentual(c) são monitoradas. Para iniciar a gravação de dados, o botão "Iniciar teste"(d) precisa ser clicado, o que mudará a cor do botão para verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig06.jpg"> Figura 6: Painel de controles no programa. Dentro do painel "Controles", as bombas podem ser ligadas ou desligadas, e a taxa de bombeamento pode ser alterada para alimentação (a) e outros estágios(b). Além disso, a potência da câmara no transdutor piezo pode ser ligada ou desligada(c)e ser alterada com uma barra de slides(d). Os experimentos utilizaram 10 W, pois é a configuração de energia recomendada para células CHO, conforme recomendado pelo fabricante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig07.jpg"> Figura 7: Câmara AWS. Uma vez que as células estavam dentro da câmara, as forças acústicas aprisionaram células em nós de ondas e fizeram com que as células se aglomerassem (a). Esses aglomerados de células aumentaram de tamanho até perderem sua flutuação e eventualmente se estabelecerem pela força gravitacional (b). Em seguida, as células assentadas foram removidas da porta de resíduos da câmara acoustopforética através da bomba estágio 1 para uma garrafa de colheita celular (c). O produto saiu da câmara através da porta permeada (d) enquanto o HCCF preencheu continuamente a câmara através de portas de entrada (e). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig08.jpg"> Figura 8: Medições de turbidez para uma cultura celular 12 x 106 células/mL CHO com uma taxa de bomba de alimentação de 3,5 mL/min. A turbidez alimentar (azul) foi de aproximadamente 1.000 NTU e permeado saindo do estágio 1 medidor de turbidez (laranja) foi de 40-60 NTU. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig09.jpg"> Figura 9: Medições de temperatura para uma cultura celular 12 x 106 células/mL CHO com uma taxa de bomba de alimentação de 3,5 mL/min. A temperatura do alimento (azul) foi de aproximadamente 21 °C e permear a saída do medidor de turbidez estágio 1 (laranja) foi de aproximadamente 27 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig09large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig10.jpg"> Figura 10: Exemplo de medição de turbidez para uma amostra de alta densidade celular. Quando a densidade celular foi &gt;20 x 106 células/mL, a medição da turbidez alimentar foi saturada ao valor máximo de 4.400 NTU, resultando na subestimação da eficiência de remoção celular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig10large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig11.jpg"> Figura 11: Comparação de eficiência de remoção celular. À medida que a taxa de alimentação aumentava, a separação celular diminuiu. Assim, à medida que a taxa de alimentação aumentava, a eficiência do esclarecimento celular diminuiu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig11large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Parâmetro</td>
			<td>Especificação</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vazão</td>
			<td>0 – 10 L/h</td>
		</tr>
<tr>
<td>Faixa de pressão</td>
			<td>0 – 2 bar (0 – 30 psi)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temperatura do fluido de alimentação</td>
			<td>0 – 40 °C (32 – 104 °F)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temperatura de operação</td>
			<td>0 – 40 °C (32 – 104 °F)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Condições de funcionamento. As condições de operação recomendadas do fabricante AWS para taxa de fluxo, faixa de pressão, fluido de alimentação e temperatura de operação.

Apresentado aqui é um protocolo para o esclarecimento primário da cultura celular CHO usando um separador acústico. Este protocolo pode ser usado para o esclarecimento primário de culturas de frascos de shake ou colheitas de bioreatores e tem a aplicação potencial para esclarecimento contínuo do material de sangramento celular durante operações de bioreator de perfusão.

Esclarecimento Primário do Fluido de Cultura Celular Colhida cho usando um separador acústico

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Nosso protocolo demonstra como usar um separador de ondas acústicas em escala de bancada para a separação primária de células CHO do fluido de cultura colhido contendo um modelo de anticorpo monoclonal. A separação por ondas acústicas oferece algumas vantagens em comparação com os métodos tradicionais de clarificação primária, como centrifugação e filtração, como pegada pequena, baixo risco de contaminação e redução do risco de incrustação do filtro. Como a separação de ondas acústicas fornece um fluxo contínuo de material livre de células para processos subsequentes de filtração e cromatografia, há potencial para sua aplicação em bioprocessamento contínuo.Para preparar o separador de ondas acústicas, conecte os cabos de turbidez às suas respectivas portas e conecte os cabos BNC de alimentação da câmara à parte traseira do sistema separador de ondas acústicas. Insira as sondas de turbidez no medidor de turbidez e no compartimento do termômetro e aperte os parafusos. Conecte a tubulação de alimentação à entrada da porta de turbidez de alimentação através da bomba de alimentação.E conecte a tubulação em y da saída da porta de turbidez de alimentação à porta de entrada da câmara acústica. Conecte o stage 1 tubulação da porta de resíduos da câmara acústica a um recipiente de coleta de células através do stage bomba 1, e conecte a tubulação da porta de permeado da câmara acústica à entrada da porta de turbidez da sonda 1. Em seguida, conecte a tubulação de coleta da porta de turbidez da sonda 1 a um recipiente de coleta de produtos.Para preparar o sistema com fluido de cultura de células coletado, ligue o separador de ondas acústicas e abra o programa de software associado. No painel Leituras, clique em Iniciar teste para iniciar a gravação de dados. E conecte a extremidade do tubo de alimentação ao recipiente de fluido de cultura de células colhido que está sendo agitado.Para iniciar a bomba de alimentação, insira a taxa da bomba e pressione Enter. Confirme se a seta de direção da bomba está orientada corretamente para garantir que o fluido da célula seja bombeado do recipiente para a câmara acústica e clique no ícone de triângulo para iniciar. Monitore as medições de turbidez de alimentação no Painel de Redução Percentual durante o enchimento da câmara acústica.Se o fluido de cultura de células colhidas estiver sendo misturado suficientemente dentro do vaso de fluido celular, os valores de turbidez serão consistentes durante o carregamento da câmara. Quando o líquido estiver acima do transdutor piezo na parte traseira da câmara acústica, clique em Desligar para parar a bomba. E conecte a outra extremidade do cabo de alimentação BNC à câmara acústica.Assim que a câmara acústica estiver cheia e ligada, altere a taxa da bomba de alimentação para a taxa de operação desejada. Para ligar a alimentação piezoelétrica do estágio 1, deslize a barra no módulo de potência para 10 watts e clique em Ligar.Assim que as células começarem a se assentar na parte inferior da câmara acústica, inicie a bomba do estágio 1 com uma taxa apropriada com base na densidade da célula e na taxa da bomba de alimentação, enquanto observa as câmaras separadoras de ondas acústicas de perto e ajusta as taxas da bomba conforme necessário. Para calcular a massa celular compactada, tara uma balança com um tubo vazio de 15 mililitros e encha o tubo com material de alimentação.Depois de registar o peso total do tubo com alimentação, centrifugar o tubo e decantar o sobrenadante para um novo recipiente. Meça o peso do tubo com o pellet celular. Em seguida, monitore o perfil de turbidez da turbidez do estágio 1 à medida que o transbordamento da câmara acústica entra na sonda de turbidez 1.Quando a corrida terminar, pare as bombas de alimentação e stage 1 e desligue a energia da câmara. Desconecte o cabo de alimentação BNC e colete o material de coleta do produto para análise a jusante. Para drenar o fluido restante da câmara acústica, coloque o tubo de resíduos em um recipiente vazio.Desconecte a tubulação da entrada da câmara acústica e das portas de permeado e libere a tubulação residual do cabeçote da bomba. Quando a câmara estiver vazia, reconecte a tubulação, coloque a tubulação de resíduos de volta no cabeçote da bomba e use uma taxa de alimentação e bomba de estágio 1 de 60 mililitros por minuto para lavar a água deionizada da extremidade da tubulação de alimentação por 15 a 20 minutos. No final do enxágue com água, bombeie álcool isopropílico a 70% através do tubo e da câmara por 15 a 20 minutos, seguido por um enxágue adicional de 15 a 20 minutos com água deionizada.Nesta análise representativa, à medida que o fluido celular colhido entrou na câmara separadora de ondas acústicas, as medições de turbidez da sonda de turbidez de alimentação permaneceram consistentes, em torno de 1000 a 1100 NTU. E as medições da sonda de turbidez da sonda 1 permaneceram em torno de 40 a 50 NTU. Manter o fluido celular colhido dentro da câmara por períodos de tempo mais longos causa aumentos de temperatura, como neste exemplo de uma diferença de temperatura superior a seis graus Celsius do fluido celular colhido antes de entrar na câmara acústica e após a separação acústica.Outra consideração importante ao executar colheitas de alta densidade celular é a saturação das sondas de turbidez, pois as medições de turbidez para a sonda de turbidez de alimentação ficam saturadas acima de 4600 NTU, provavelmente resultando em uma subestimação no cálculo da eficiência de remoção de células. Além disso, a eficiência de remoção de células diminui significativamente de aproximadamente 100% para 57% à medida que a taxa da bomba de alimentação é aumentada, com uma taxa de bomba de alimentação mais lenta normalmente correlacionada diretamente com uma melhor clarificação da célula. À medida que os fabricantes de produtos biotecnológicos avançam para a fabricação contínua, o uso da tecnologia de ondas acústicas pode ter aplicações adicionais para operações contínuas de bioprocessamento e biorreator de profusão.

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Acoustopforese microfluidica para flowthrough separação de bactérias gram-negativas usando Contas de Afinidade De Aptamer

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