Name: Imagem em tempo real da migração induzida por CCL5 de células-tronco esqueléticas periósteis em camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Aprenda a rastrear em tempo real a migração de células-tronco esqueléticas periósteis induzida por CCL5 em camundongos usando microscopia intravital. Este protocolo permite observar comportamentos celulares dinâmicos in vivo.

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Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Doenças Ósseas do Texas Award, o Caroline Wiess Law Fund Award, e o NIAMS dos Institutos Nacionais de Saúde sob os números de premiação R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 para D.P.  Agradecemos a M.E. Dickinson e T.J. Vadakkan no BCM Optical Imaging and Vital Microscopy Core e nos BCM Advanced Technology Cores com financiamento do NIH (AI036211, CA125123 e DK056338).
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Todos os camundongos foram mantidos em condições livres de patógenos, e todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Baylor College of Medicine.
1. Preparação do rato
<ol><li>Cross Mx1-Cre17 e Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 ratos (comprados do Laboratório Jackson) com camundongos αSMA-GFP (fornecidos aqui pelos Drs. Ivo Kalajzic e Henry Kronenberg) para gerar ratos repórteres Mx1-Cre+Rosa26-Tomate+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomate/αSMA-GFP) (Figura 2A).</li>
	<li>Para indução Mx1-Cre, injete camundongos com 25 mg/kg pIpC a cada dois dias durante 10 dias.</li>
	<li>Camundongos irradiados com 9,5 Gy 1 dia antes do transplante intravenoso de 1 x 106 células mononucleares de medula óssea inteiras de camundongos tipo selvagem C57BL/6 (WT-BMT)19.</li>
	<li>Após 6 a 8 semanas de recuperação, sujeitos a camundongos a imagem in vivo do protocolo de migração celular periosteal descrito abaixo. NOTA: Irradiação e WT-BMT de camundongos Mx1-Cre são necessários para eliminar células hematopoiéticas endógenas rotuladas por Mx1 que podem responder a uma lesão. De seis a oito semanas após a irradiação, a contagem de células hematopoiéticas do hospedeiro está em <5% e, portanto, pronta para imagens19.</li>
</ol>2. Contenção do rato e montagem de imagem
<ol><li>Crie uma contenção do mouse com um tubo cônico de 50 mL (Figura 1A).<ol>
<li>Usando uma tesoura pontiaguda, faça um buraco na parte inferior do cônico. Corte do orifício inferior até o topo do cônico (o lado cortado será o topo da contenção).</li>
		<li>Faça um corte de aproximadamente 4-5 cm de comprimento paralelo ao corte anterior e metade abaixo (~2 cm) do topo da contenção. Remova esta seção do cônico e liso as bordas foram necessárias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Construa um suporte de imagem de tubo cônico usando uma placa angular ajustável, um poste óptico de 0,5" e um grampo de ângulo reto para o poste de 0,5", Hex de 0,1875" (Figura 1B e Tabela de Materiais).<ol>
<li>Ajuste a placa angular para um ângulo de 35°. No lado esquerdo da placa angular, enrosque o poste óptico no segundo orifício da parte de trás da placa.</li>
		<li>No lado direito da placa ajustável, insira um parafuso de 0,1875" hexarifado de 0,25" na segunda furo da frente e último furo na placa. O grampo de ângulo reto será usado com o poste óptico para fixar a contenção cônica do mouse no lugar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Procedimento cirúrgico pré-operatório
<ol><li>Anestesia do rato<ol>
<li>Para o tratamento da dor, injete subcutâneamente o camundongo com buprenorfina de liberação sustentada (1 mg/kg BW) 30-60 min antes da cirurgia.</li>
		<li>Camundongos anestesiadores usando a combinação de roedor III CCM (combo III) anestésia contendo 37,5 mg/mL de cetamina, 1,9 mg/mL de xilazina e acepromazina de 0,37 mg/mL. A dosagem apropriada para camundongos é de 0,75-1,50 mL por 1 kg de peso corporal. A dose durará de 30 a 45 min.</li>
		<li>Uma vez que o rato seja anestesiado, aplique pomada oftálmica nos olhos com um cotonete estéril para evitar a desidratação dos olhos.</li>
		<li>Para imagens de longo prazo (>45 min), administre novamente a anestesia para manter a profundidade anestésica adequada da seguinte forma.<ol>
<li>Prepare uma seringa de 1 mL com uma quantidade suficiente de combo III para manter a anestesia para a duração da imagem planejada (0,75 mL/kg BW por 30 min de sedação adicional). Conecte um conjunto de infusão de agulha de borboleta de 25 G com tubos de 12" à seringa e empurre o anestésico através da tubulação e agulha.</li>
			<li>Insira a agulha borboleta intraperitoneally e, em seguida, grave a agulha no lugar. NOTA: É assim que o combo III adicional será administrado durante a imagem de tal forma que não há necessidade de mover o animal ou interromper o plano de visão.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Forneça suporte térmico com uma almofada de aquecimento mantida a 37°C durante todo o procedimento. Para uma imagem prolongada (>1hr) será necessário suporte adicional de fluido.  Os fluidos suplementares podem ser fornecidos I.P. com combo III adicional durante a imagem ou 33 mL/kg salino (0,9 NaCl) subcutânea.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Contenção do rato e preparação do local cirúrgico<ol>
<li>Use cortadores para remover o máximo de cabelo possível da parte superior da cabeça. Aplique creme depilatório na área raspada para remover qualquer cabelo restante no local cirúrgico.</li>
		<li>Certifique-se de que o mouse está totalmente anestesiado pela falta de resposta às pitadas dos dedos dos dedos. Após 15 min, se o mouse não estiver totalmente anestesiado, administre uma segunda dose menor de combo III (<0,75 mL/kg BW).</li>
		<li>Coloque o mouse na tampa da cauda primeiro, deslizando-o para trás o suficiente para trás, de tal forma que o nariz paira ligeiramente sobre a borda do cônico.</li>
		<li>Grave as patas dianteiras na parte inferior do tubo cônico usando fita médica.</li>
		<li>Coloque o tubo cônico com o mouse em uma montagem de imagem que é definida em um ângulo de 35° e fixe usando o grampo de ângulo reto (Figura 1C).</li>
		<li>Uma vez que o rato esteja seguro no suporte de imagem, limpe o local cirúrgico 3x com esfoliantes alternados de esfoliação betadina e 70% de álcool isopropílico. Novamente, verifique se o animal está totalmente sedado.</li>
		<li>Mova o mouse para uma almofada absorvente limpa e coloque uma cortina sobre o mouse para criar um grande campo estéril.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Procedimento cirúrgico
<ol><li>Abertura incisão<ol>
<li>Usando fórceps finos, pegue a pele imediatamente medial para a orelha direita. Com uma tesoura de microdisseção, corte a pele que está sendo mantida pelos fórceps. NOTA: Iniciar a incisão utilizando o método descrito acima cria uma incisão arredondada mais adequada para sutura após o procedimento.</li>
		<li>Faça uma incisão transversal a partir da incisão inicial em direção à orelha esquerda (<1 cm).  Faça outra incisão, a partir da incisão inicial, em direção ao nariz do animal (~2-3 mm além do olho direito).</li>
		<li>Separe a pele do periósteo usando as fórceps e a tesoura para cortar suavemente o tecido conjuntivo que separa a pele do periosteum calvaria.</li>
		<li>Usando um cotonete estéril, aplique alguma pomada oftálmica no topo da aba da pele.  Pegue suavemente a aba da pele e dobre-a sobre o olho esquerdo. A intersecção das suturas sagiais e coronais deve ser claramente exposta (Figura 1E). NOTA: A pomada oftalmômica é usada para manter a aba da pele no lugar.</li>
		<li>Lave a superfície aberta com PBS estéril para limpar a área de qualquer sangue e cabelo residual. NOTA: Se necessário, use fórceps finos para remover os cabelos que permanecem após a descarga, mas tenha cuidado para não danificar o periósteo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Microfratura<ol>
<li>Para gerar microfraturas na calvária, remova o êmbolo de uma seringa de insulina de 29 G e corte a parte de trás da seringa, em torno das marcas de 300-400 uL. NOTA: Esta etapa facilita a manobra sob um escopo de dissecção ao produzir a lesão.</li>
		<li>Coloque a ponta de um bisel (uma a duas larguras de agulha) em direção ao nariz a partir da sutura coronal e de uma a duas larguras de agulha à direita da sutura sagital (Figura 1E).</li>
		<li>Gire suavemente a seringa no sentido horário, depois no sentido anti-horário várias vezes. NOTA: Em camundongos jovens, uma quantidade muito pequena de pressão descendente é necessária para criar uma microfratura circular. Tenha cuidado para não deixar a agulha penetrar no cérebro, pois isso causará sangramento e interferirá com a imagem.</li>
		<li>Use uma agulha de 27 G para ampliar a microfratura para ~0,4 mm. Se os fragmentos ósseos permanecerem na microfratura, lave a área com PBS. Se os fragmentos ósseos ainda permanecerem na microfratura, use a agulha de 29 G para retirá-los suavemente.</li>
		<li>Repita os passos 4.2.1-4.2.4 para criar uma lesão no lado esquerdo da sutura sagital. NOTA: Neste ponto, há duas opções: 1) seguir imediatamente para o tratamento CCL5 (seção 4.3) e imagem (seção 5); ou 2) fechar o local cirúrgico seguindo os procedimentos pós-operatórios na seção 6. Às 24 horas depois, anestesiar novamente o camundongo, reabrir a visão cirúrgica, tratar a lesão com CCL5 (seção 4.3) e realizar imagens intravitais (seção 5) e cuidados pós-operatórios (seção 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tratamento CCL5<ol>
<li>A partir de um estoque de RANTES (100 ng/mL), faça uma solução de 10 ng/mL usando matriz de membrana de porão (Tabela de Materiais). Mantenha esta solução no gelo para manter a matriz em forma líquida.</li>
		<li>Trate cada lesão com 2 μL de CCL5 (10 ng/μL) usando uma pipeta de 2-20 μL (esta ponta de pipeta tem um diâmetro maior, que é mais eficaz ao usar um líquido viscoso). Permita que a matriz se solidifique.</li>
		<li>Uma vez que a matriz se solidificou, cubra suavemente a calvaria com a aba da pele para garantir que o tecido não fique desidratado. Incubar por 1h antes da imagem.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Imagem intravital
<ol><li>Configurações de microscópio<ol>
<li>Ligue o laser multifotônio (laser de femtosegundo de titânio-safira). Ajuste o comprimento de onda para 880 nm e ajuste a potência para a segunda imagem de geração harmônica (SHG) (440 nm) do osso.</li>
		<li>Ligue os lasers de estado sólido de 488 nm e 561 nm para excitação de células de voz de GFP e tdTomato, respectivamente.</li>
		<li>Ligue os detectores PMT (tubo fotomultiplier) para sinais de segunda geração harmônica (detecção de 405 a 455 nm) e GFP (detecção de 505-550 nm). Ligue o detector HyD 3 para o sinal de tomate (detecção de 590-620 nm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montagem<ol>
<li>Antes de mover o mouse para o escopo, verifique o plano visual da calvaria pressionando suavemente a parte de trás da cabeça do mouse. Se o plano não estiver nivelado, ajuste a posição girando suavemente a contenção do mouse para a esquerda ou para a direita. NOTA: Esta é uma etapa crítica para garantir qualidade de imagem suficiente.</li>
		<li>Aplique 2% de metilcelulose estéril na água (c/v) para cobrir toda a panturrilha e retalho da pele e evitar a secagem do tecido.</li>
		<li>Coloque o mouse no estágio do microscópio motorizado do eixo XYZ (Figura 1G). Utilizando a luz epifluorescente, alinhe o mouse de modo que 1) ele está voltado para o microscópio e 2) a intersecção das suturas coronais e sagita é o ponto de referência central do palco.</li>
		<li>Coloque a tampa de vidro na área de imagem e verifique novamente o alinhamento (Figura 1H).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imagem de lapso de tempo<ol>
<li>Use uma lente de baixa ampliação (objetivo de imersão em água de 25x com NA = 0,95) para escanear a calvaria. Adquirir uma imagem de referência da intersecção sagital e coronal de sutura.</li>
		<li>Usando os sinais SHG e fluorescentes das células, localize cada visão de lesão e registre as coordenadas XYZ, bem como as distâncias das suturas sagita e coronal (Figura 2B).</li>
		<li>Escolha um local nas suturas coronais ou sagitas para imagens de longo prazo. Tire uma imagem detalhada da pilha Z desta área a partir da referência durante a imagem. NOTA: Como as suturas representam um nicho P-SSC conhecido, é de onde as células migrarão em resposta à lesão da calvária.</li>
		<li>Use as configurações do software time-lapse para gravar uma imagem a cada 1 minuto por pelo menos 1 h. No tempo entre instantâneos, compare o campo de visão atual com o campo de visão inicial. Se forem diferentes, use a imagem da pilha Z para determinar em que direção o campo de visão precisa ser ajustado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Cuidados com animais pós-operatórios
<ol><li>Após a imagem, enxágue a calvária exposta com PBS estéril para remover o metilcelulose.</li>
	<li>Para fechar a incisão, coloque suavemente a aba da pele sobre a calvaria. Use cotonetes estéreis para remover a pomada oftalmómica residual e secar o local da incisão.</li>
	<li>Utilizando suturas nãoabsorbáveis de nylon de monofilamento 5-0 com uma agulha de corte reversa C-1 anexada, feche o local cirúrgico. Use um cotonete estéril para aplicar pomada antibiótico tripla à incisão fechada. NOTA: As cicatrizes são reduzidas com técnicas de sutura de alta qualidade e sangramento mínimo.</li>
	<li>Coloque o mouse em uma gaiola limpa em uma superfície quente e verifique a cada 15 minutos até que a recumedência severa seja alcançada.</li>
	<li>Administre uma segunda dose de buprenorfina de liberação sustentada 72 h após a cirurgia.</li>
	<li>Monitore diariamente o comportamento amontoado, a pele de babados e/ou a falta de ambulação até que as suturas sejam removidas (~1 semana).</li>
</ol>

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</ol>

L.C.O. e D.P. divulgam uma patente pendente intitulada "Células-Tronco Esqueléticas Periosteais em Reparação Óssea" (BAYM. P0264Us. P1). Os demais autores não declaram interesses concorrentes.

Durante a cicatrização óssea, as células periosteais são a principal fonte de condrócitos e osteoblastos recém-diferenciados dentro de um calo de lesão3. Semelhante à medula óssea, os SSCs osteogênicos/condrogênicos também foram identificados no periosteum4,5,6. Avaliar características funcionais P-SSC endógenas é tecnicamente desafiador. Muitas vezes, a dinâmica migratória dos SSCs é avaliada in vitro, t...

O reparo da fratura é um processo dinâmico e multicelular distinto do desenvolvimento e remodelação esquelético embrionário. Durante esse processo, a indução de sinais de lesão do tecido danificado é seguida pelo rápido recrutamento, proliferação e subsequente diferenciação das células esqueléticas de tronco/progenitor, que são todas fundamentais para a estabilidade geral e fixação de fraturas1. Em particular, os estágios iniciais da cicatrização da fratura requerem a formação de calo macio, que é atribuída principalmente às células residentes periosteis2. Quando os ossos são feridos, um subconjunto de células periosteais responde rapidamente e contribui para intermediários de cartilagem e osteoblastos recém-diferenciados dentro do calo3, implicando a presença de uma distinta população de células-tronco/progenitoras esqueléticas dentro do peristeum. Portanto, a identificação e caracterização funcional das células-tronco esqueléticas residentes no periosteum (SSCs) constituem uma abordagem terapêutica promissora para doenças ósseas degenerativas e defeitos ósseos4.
Acredita-se que os SSCs residam em vários locais de tecido, incluindo a medula óssea. Semelhante à medula óssea, os SSCs osteogênicos/condrogênicos também foram identificados no periosteum4,5,6.  Estes SSCs periosteais (P-SSCs) podem ser rotulados com marcadores de linhagem mesenquimal precoces (ou seja, Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 e Axin2-CreER8) durante o desenvolvimento do osso fetal4,7,8,9,10. Uma limitação significativa desses modelos de rastreamento de linhagem genética única é que há heterogeneidade substancial dentro de populações celulares rotuladas. Além disso, eles não podem distinguir SSCs rotulados de seus descendentes in vivo. Para lidar com essa limitação, desenvolvemos recentemente um mouse repórter duplo (Mx1-Cre+Rosa26-Tomate+α SMA-GFP+) para visualizar distintamente P-SSCs de SSCs de medula óssea (BM-SSCs)11. Com este modelo, foi determinado que os P-SSCs são marcados pela rotulagem dupla Mx1+αSMA+, enquanto as células Mx1+ mais diferenciadas residem nas superfícies de medula óssea, endosteal e periosteal, e ossos cortical e trabecular11,12.
Várias citocinas e fatores de crescimento são conhecidos por regular a remodelação e reparação óssea e foram testados para o aprimoramento da reparação esquelética em defeitos críticos do segmento1,13. No entanto, devido à complexidade celular dos modelos de lesões gerados pela ruptura da barreira física do compartimento ósseo, os efeitos diretos dessas moléculas na migração e ativação endógena P-SSC durante a cicatrização não são claros. As características funcionais e a dinâmica migratória dos SSCs são frequentemente avaliadas in vitro pela realização de um ensaio transwell ou scratch, em combinação com citocinas ou fatores de crescimento conhecidos por induzir migração em outras populações celulares. Assim, a interpretação dos resultados desses experimentos in vitro para aplicação em seus sistemas in vivo correspondentes é desafiadora. Atualmente, a avaliação in vivo da migração de células-tronco/progenitor esqueléticos não é normalmente observada em tempo real; em vez disso, é medido em pontos de tempo fixos após a fratura5,7,14,15,16.
Uma limitação desse método é que a migração não é avaliada em um nível unicelular; em vez disso, é medido através de mudanças nas populações celulares. Devido aos recentes avanços na microscopia intravital animal vivo e à geração de ratos repórteres adicionais, o rastreamento in vivo de células individuais agora é possível. Utilizando microscopia intravital animal viva, observamos a migração distinta de P-SSCs do nicho de sutura da calvaria para uma lesão óssea dentro de 24-48 h pós-lesão em camundongos Mx1/Tomate/αSMA-GFP.
O CCL5/CCR5 foi recentemente identificado como um mecanismo regulatório que influenciou os P-SSCs de recrutamento e ativação durante a resposta precoce de lesões. Curiosamente, não houve detecção de migração P-SSC substancial em resposta a uma lesão em tempo real. No entanto, o tratamento de uma lesão com CCL5 produz uma migração robusta e direcionalmente distinta de P-SSCs, que pode ser capturada em tempo real. Portanto, o objetivo deste protocolo é fornecer uma metodologia detalhada para o registro da migração in vivo de P-SSCs em tempo real após o tratamento com CCL5.

<table><tbody><tr><td>&frac12; &rdquo; poste óptico</td><td>ThorLabs</td><td>TR2</td><td>Para montagem de imagem</td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>agulha 27G</td><td>BD PercisionGlide</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>seringa de insulina 29G</td><td>McKesson</td><td>102-SN05C905P</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubo de conicol</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td>Para contenção de mouse</td></tr><tr><td>Placa de ângulo ajustável</td><td>Renishaw</td><td>R-PCA-5023-50-20</td><td>Para montagem de imagem</td></tr><tr><td>Toalhetes com álcool</td><td>Coviden</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>betadine esfoliante cirúrgico</td><td>Henry Schen</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina SR-LAB</td><td>ZooPharm</td><td></td><td>1mg/mL Combinação de Liberação</td></tr><tr><td>Sustentada III</td><td>Obtido do veterinário da equipe</td><td>N/A</td><td>37,6 mg/mL Cetamina; 1,9 mg/mL Xilazina; 0,37 mg/mL Acepronazina</td></tr><tr><td>Lamínula</td><td>Fisher</td><td>12-545-87</td><td>24 x 40 superslip premium</td></tr><tr><td>Forcepts de ponta fina</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>KetaVed</td><td>50989-161-06</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8MP com DM6000CFS</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>R & D Systems</td><td>344500101</td><td></td></tr><tr><td>Fita médica</td><td>McKesson</td><td>100199</td><td>7,6 cm x 9,1 m (3" x 10 jardas)</td></tr><tr>Ciências de <td>Microscopia Eletrônica</td> de <td>Metocelulose</td><td>19560</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de microdissecção</td><td>FST</td><td>1456-12</td><td></td></tr><tr><td>Platina motorizada</td><td>Anaheim automation</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulhas</td><td>FST</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Suturas não absorvíveis</td><td>McKesson</td><td>S913BX</td><td>monofilamento nylon 5-0 suturas inabsorvíveis com agulha de corte reverso C-1 anexada</td></tr><tr><td>Pomada oftálmica</td><td>Rugby</td><td>0536-1086-91</td><td></td></tr><tr><td>RANTES</td><td>Biolegend</td><td>594202</td><td>10 &micro; g/50 &micro; L</td></tr><tr><td>Grampo de ângulo reto para &frac12; &rdquo; poste, 3/16" Hex</td><td>ThorLabs</td><td>RA90</td><td>Para montagem de imagem</td></tr><tr><td>Mola 3/16" Trava hexagonal &frac14; &rdquo; parafuso de aperto manual</td><td>ThorLabs</td><td>TS25H</td><td>Para montagem de imagem</td></tr><tr><td>Cotonetes estéreis</td><td>Henry Schen</td><td>100-9249</td><td></td></tr><tr><td>DPBS estéril (1x)</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Campos estéreis</td><td>McKessen</td><td>25-517</td><td></td></tr><tr><td>Luvas cirúrgicas</td><td>McKessen</td><td>3158VA</td><td></td></tr><tr><td>Pomada antibiótica tripla</td><td>Taro Pharmaceuticals EUA, Inc. </td><td>51672-2120-2</td><td></td></tr><tr><td>conjunto de coleta de sangue Vacutainer</td><td>BD</td><td>REF 367298</td><td>25G conjunto de infusão de agulha borboleta com tubulação de 12 "</td></tr></tbody></table>

imagem em tempo real da migração induzida por ccl5 de células-tronco esqueléticas periósteis em camundongos

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

As células-tronco esqueléticas periosteais (P-SSCs) são essenciais para a manutenção e reparação óssea ao longo da vida, tornando-as um foco ideal para o desenvolvimento de terapias para melhorar a cicatrização da fratura.  As células periosteais migram rapidamente para uma lesão para fornecer novos condrócitos e osteoblastos para cicatrização de fraturas. Tradicionalmente, a eficácia de uma citocina para induzir a migração celular só tem sido conduzida in vitro realizando um ensaio transwell ou scratch. Com os avanços na microscopia intravital utilizando excitação multifotífica, descobriu-se recentemente que 1) P-SSCs expressam o gene migratório CCR5 e 2) tratamento com o ligante CCR5 conhecido como CCL5 melhora a cicatrização da fratura e a migração de P-SSCs em resposta ao CCL5. Estes resultados foram capturados em tempo real. Descrito aqui é um protocolo para visualizar a migração P-SSC do nicho de células-tronco esqueléticas de sutura calvarial (SSC) para uma lesão após o tratamento com CCL5. O protocolo detalha a construção de um suporte de contenção e imagem do rato, preparação cirúrgica do rato calvaria, indução de um defeito de calvaria e aquisição de imagens de lapso de tempo.

Progenitores esqueléticos foram propostos para ter potencial migratório ou circulatório20. Recentemente, foram gerados ratos repórteres Mx1-Cre+Rosa26-Tomate+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomate/αSMA-GFP), nos quais os P-SSCs são marcados por rotulagem dupla Mx1+α SMA+ (Figura 2A,B). A migração substancial de Mx1+α SMA<s...

Este protocolo descreve a detecção da migração de células-tronco periósteis periósteis mediadas pelo CCL5 em tempo real usando microscopia intravital animal viva.

Imagem em tempo real da migração induzida por CCL5 de células-tronco esqueléticas periósteis em camundongos

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

O protocolo padronizado pode ser usado para avaliar a migração celular endógena e pode ser aplicado a vários tipos de células, bem como fenótipos esqueléticos. A vantagem dessa técnica é que ela permite que a migração celular in vivo seja rastreada para células individuais, em vez de uma população de células em resposta a lesões e / ou tratamento com citocinas. Antes de iniciar o procedimento, confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé no camundongo anestesiado e aplique pomada nos olhos do animal.Em seguida, faça uma incisão transversal de menos de um centímetro da orelha imediatamente medial à direita em direção à orelha esquerda e faça uma segunda incisão da incisão inicial, aproximadamente dois a três milímetros após o olho direito em direção ao nariz. Use uma pinça para separar a pele do periósteo e use uma tesoura para cortar suavemente o tecido conjuntivo para separar a pele do periósteo da calvária. Usando um cotonete estéril, aplique pomada oftálmica na parte superior da aba da pele e dobre suavemente a aba sobre o olho esquerdo.A intersecção das suturas sagital e coronal deve ser claramente exposta. Lave a superfície aberta com PBS estéril para limpar a área de qualquer sangue e cabelo residual e coloque a ponta de um chanfro de uma a duas larguras de agulha em direção ao nariz da sutura coronal e uma a duas larguras de agulha à direita da sutura sagital. Usando uma quantidade muito pequena de pressão para baixo, gire cuidadosamente a seringa no sentido horário uma vez e no sentido anti-horário várias vezes.Em seguida, use uma agulha de calibre 27 para alargar a microfratura para aproximadamente 40 micrômetros. Se os fragmentos ósseos permanecerem, lave a microfratura com PBS. Se os fragmentos ósseos ainda permanecerem, use uma agulha de calibre 29 para retirar suavemente os fragmentos.Para o tratamento com CCL5, use uma solução CCL5 de estoque de 100 nanogramas por mililitro e uma matriz de membrana basal para obter uma solução quimioatraente de trabalho de 10 nanogramas por mililitro. Para tratar a lesão, carregue uma pipeta de 220 microlitros com cinco microlitros da solução e aplique dois microlitros da quimiocina na sutura. Em seguida, deixe a matriz solidificar e cubra suavemente a calvária com o retalho cutâneo para garantir que o tecido não fique desidratado durante o tratamento de quimiocina de uma hora.Para imagens intravitais da migração de células-tronco periosteais em tempo real, antes de mover o mouse para o microscópio, aplique uma leve pressão na parte de trás da cabeça do camundongo para verificar o plano visual da calvária. Se o plano não estiver nivelado, gire suavemente o retentor do mouse para a esquerda ou para a direita para ajustar a posição. Em seguida, cubra toda a calvária no retalho cutâneo com 2% de metilcelulose estéril em água e coloque o mouse no estágio de microscópio motorizado do eixo XYZ.Usando a luz epifluorescente, alinhe o mouse de forma que ele fique voltado para o microscópio e que a interseção das suturas coronal e sagital seja o ponto de referência centralizado do estágio. Em seguida, coloque uma tampa de vidro na área de imagem e verifique novamente o alinhamento. Para imagens de lapso de tempo da migração para dentro e para fora da sutura, selecione uma lente de imersão em água de baixa ampliação para escanear a calvária.Adquira uma imagem de referência da intersecção da sutura sagital e coronal e, usando o SHG e os sinais fluorescentes das células, localize cada local da lesão e registre as coordenadas XYZ, bem como as distâncias das suturas sagital e coronal. Selecione um local nas suturas coronal ou sagital para imagens de longo prazo e obtenha uma imagem ZStack detalhada dessa área a partir da referência durante a imagem. Use as configurações do software de lapso de tempo para gravar uma imagem a cada minuto por pelo menos uma hora, comparando o campo de visão atual com o campo de visão inicial no tempo entre os instantâneos.Se os campos de visão forem diferentes, use a imagem ZStack para determinar em qual direção o campo de visão precisa ser ajustado. Recentemente, foram gerados camundongos repórter Mx1 alfa-SMA GFP de tomate nos quais as células-tronco esqueléticas periosteal são marcadas por marcação dupla positiva de alfa-SMA Mx1. Pouca ou nenhuma migração de células-tronco esqueléticas periosteal positivas para alfa-SMA positiva para Mx1 é observada durante um período de uma hora de imagem, 24 horas após a colocação da sutura.O tratamento com quimiocina CCL5 de um defeito da calvária 24 horas após a lesão induz uma migração direcionalmente distinta para longe da sutura coronal e em direção ao local da lesão. Nesta análise representativa, dentro de uma hora após a imagem, uma das células-tronco esqueléticas periosteal positivas para alfa-SMA Mx1 positivas migrou aproximadamente 50 micrômetros em direção à lesão. O aspecto mais importante deste protocolo a ser lembrado é limitar o tratamento com CCL5 ao local da lesão, a fim de estimular a migração específica da célula.Uma vez concluído este procedimento, o tratamento localizado pode ser continuado por uma semana. Uma microtomografia computadorizada pode ser usada para avaliar a cicatrização da lesão da calvária e a deposição mineral.

real-time-imaging-ccl5-induced-migration-periosteal-skeletal-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Imagem Multimodal de implante de células-tronco no sistema nervoso central de camundongos

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