Imagem em tempo real da migração induzida por CCL5 de células-tronco esqueléticas periósteis em camundongos

Este protocolo descreve a detecção da migração de células-tronco periósteis periósteis mediadas pelo CCL5 em tempo real usando microscopia intravital animal viva.

O protocolo padronizado pode ser usado para avaliar a migração celular endógena e pode ser aplicado a vários tipos de células, bem como fenótipos esqueléticos. A vantagem dessa técnica é que ela permite que a migração celular in vivo seja rastreada para células individuais, em vez de uma população de células em resposta a lesões e / ou tratamento com citocinas. Antes de iniciar o procedimento, confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé no camundongo anestesiado e aplique pomada nos olhos do animal.

Em seguida, faça uma incisão transversal de menos de um centímetro da orelha imediatamente medial à direita em direção à orelha esquerda e faça uma segunda incisão da incisão inicial, aproximadamente dois a três milímetros após o olho direito em direção ao nariz. Use uma pinça para separar a pele do periósteo e use uma tesoura para cortar suavemente o tecido conjuntivo para separar a pele do periósteo da calvária. Usando um cotonete estéril, aplique pomada oftálmica na parte superior da aba da pele e dobre suavemente a aba sobre o olho esquerdo.

A intersecção das suturas sagital e coronal deve ser claramente exposta. Lave a superfície aberta com PBS estéril para limpar a área de qualquer sangue e cabelo residual e coloque a ponta de um chanfro de uma a duas larguras de agulha em direção ao nariz da sutura coronal e uma a duas larguras de agulha à direita da sutura sagital. Usando uma quantidade muito pequena de pressão para baixo, gire cuidadosamente a seringa no sentido horário uma vez e no sentido anti-horário várias vezes.

Em seguida, use uma agulha de calibre 27 para alargar a microfratura para aproximadamente 40 micrômetros. Se os fragmentos ósseos permanecerem, lave a microfratura com PBS. Se os fragmentos ósseos ainda permanecerem, use uma agulha de calibre 29 para retirar suavemente os fragmentos.

Para o tratamento com CCL5, use uma solução CCL5 de estoque de 100 nanogramas por mililitro e uma matriz de membrana basal para obter uma solução quimioatraente de trabalho de 10 nanogramas por mililitro. Para tratar a lesão, carregue uma pipeta de 220 microlitros com cinco microlitros da solução e aplique dois microlitros da quimiocina na sutura. Em seguida, deixe a matriz solidificar e cubra suavemente a calvária com o retalho cutâneo para garantir que o tecido não fique desidratado durante o tratamento de quimiocina de uma hora.

Para imagens intravitais da migração de células-tronco periosteais em tempo real, antes de mover o mouse para o microscópio, aplique uma leve pressão na parte de trás da cabeça do camundongo para verificar o plano visual da calvária. Se o plano não estiver nivelado, gire suavemente o retentor do mouse para a esquerda ou para a direita para ajustar a posição. Em seguida, cubra toda a calvária no retalho cutâneo com 2% de metilcelulose estéril em água e coloque o mouse no estágio de microscópio motorizado do eixo XYZ.

Usando a luz epifluorescente, alinhe o mouse de forma que ele fique voltado para o microscópio e que a interseção das suturas coronal e sagital seja o ponto de referência centralizado do estágio. Em seguida, coloque uma tampa de vidro na área de imagem e verifique novamente o alinhamento. Para imagens de lapso de tempo da migração para dentro e para fora da sutura, selecione uma lente de imersão em água de baixa ampliação para escanear a calvária.

Adquira uma imagem de referência da intersecção da sutura sagital e coronal e, usando o SHG e os sinais fluorescentes das células, localize cada local da lesão e registre as coordenadas XYZ, bem como as distâncias das suturas sagital e coronal. Selecione um local nas suturas coronal ou sagital para imagens de longo prazo e obtenha uma imagem ZStack detalhada dessa área a partir da referência durante a imagem. Use as configurações do software de lapso de tempo para gravar uma imagem a cada minuto por pelo menos uma hora, comparando o campo de visão atual com o campo de visão inicial no tempo entre os instantâneos.

Se os campos de visão forem diferentes, use a imagem ZStack para determinar em qual direção o campo de visão precisa ser ajustado. Recentemente, foram gerados camundongos repórter Mx1 alfa-SMA GFP de tomate nos quais as células-tronco esqueléticas periosteal são marcadas por marcação dupla positiva de alfa-SMA Mx1. Pouca ou nenhuma migração de células-tronco esqueléticas periosteal positivas para alfa-SMA positiva para Mx1 é observada durante um período de uma hora de imagem, 24 horas após a colocação da sutura.

O tratamento com quimiocina CCL5 de um defeito da calvária 24 horas após a lesão induz uma migração direcionalmente distinta para longe da sutura coronal e em direção ao local da lesão. Nesta análise representativa, dentro de uma hora após a imagem, uma das células-tronco esqueléticas periosteal positivas para alfa-SMA Mx1 positivas migrou aproximadamente 50 micrômetros em direção à lesão. O aspecto mais importante deste protocolo a ser lembrado é limitar o tratamento com CCL5 ao local da lesão, a fim de estimular a migração específica da célula.

Uma vez concluído este procedimento, o tratamento localizado pode ser continuado por uma semana. Uma microtomografia computadorizada pode ser usada para avaliar a cicatrização da lesão da calvária e a deposição mineral.