Name: Estudando efeitos da fumaça do cigarro na infecção por pseudomonas em células epiteliais pulmonares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Aprenda a investigar o efeito do extrato de fumaça de cigarro na colonização bacteriana por Pseudomonas em células epiteliais pulmonares. Este método reprodutível permite avaliar a carga bacteriana e pode ser adaptado para outros tipos celulares.

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Este trabalho foi apoiado em parte por um Instituto Nacional de Saúde R01 concede HL125435 e HL142997 (para CZ).

1. Preparação 100% CSE
<ol><li>Desenhe 10 mL de mídia de cultura celular livre de soro (DMEM/F12 para células BEAS-2B; meio basal de célula epitelial das vias aéreas para células HSAEC) em uma seringa de 60 mL.</li>
	<li>Anexar inversamente uma ponta de pipeta de 1 mL apropriadamente aparada ao bocal da seringa como adaptador para segurar o cigarro (3R4F).</li>
	<li>Remova o filtro do cigarro. Coloque um cigarro no adaptador de ponta e que combustão o cigarro.</li>
	<li>Desenhe 40 mL de ar contendo fumaça em 10 mL de mídia sem soro. Misture a fumaça com o meio tremendo vigorosamente (30 s por sorteio).</li>
	<li>Repita o passo 1.4 cerca de 11x em ~7 min até que o cigarro esteja completamente queimado.</li>
	<li>Filtre os 10 mL de mídia defumada com um filtro de 0,22 μm para excluir quaisquer microrganismos e partículas insolúveis. Transfira para um tubo estéril fechado. Prepare o CSE 100% não mais do que 30 minutos antes do ensaio subsequente.</li>
</ol>2. Cultura pseudomonas
<ol><li>Inoculado congelado P. aeruginosa (cepa PAO1) ou P. fluorescens Migula (cepa PAO143) em uma placa de ágar de caldo de soja tripptic (TSB) para cultura durante a noite a 37 °C. NOTA: Para obter bactérias suficientes para o cultivo, espalhe o máximo de bactérias na placa de ágar TSB possível.</li>
	<li>Colete uma mancha bacteriana e incubar em 20 mL de TSB com 5% de glicerol como fonte de carbono.</li>
	<li>Agite a suspensão bacteriana em uma incubadora de 37 °C a 200 rpm por 1h até o valor OD600 = 0,6. ATENÇÃO: Não deixe que a velocidade de agitação exceda 200 rpm. Velocidades de agitação mais altas podem danificar a morfologia da flagela bacteriana e impactar a invasão bacteriana na epitélia pulmonar. Da mesma forma, limitar o tempo de agitação a 1h para obter bactérias altamente invasivas. Meça o valor de600 OD para estimar o número de bactérias. Um OD600 = 1 corresponde a ~109 unidades formadoras de colônias (CFU)/mL.</li>
</ol>3. Cultura de células epiteliais pulmonares humanas e tratamento de ESC
<ol><li>Cultura células BEAS-2B humanas em meio HITES (500 mL de DMEM/F12, 2,5 mg de insulina, 2,5 mg de transferrina, 2,5 mg de selenita de sódio, 2,5 mg de transferrina, 10 μM de hidrocortisona, 10 μM β-estradiol, 10 mM HEPES e 2 mM L-glutamina) suplementadas com 10% de soro bovino fetal (FBS) como descrito anteriormente24.</li>
	<li>Cultura células epiteliais primárias das pequenas vias aéreas humanas (HSAEC) no meio de cultura de células epiteliais das vias aéreas (500 mL de Airway Cell Basal Medium, 500 μg/mL HSA, 0,6 μM ácido linoleico, 0,6 μg/mL lecitina, 6 mM L-glutamina, extrato de 0,4% P, 1,0 μM de epinefrina, 5 μg/mL transferrina, 10 nM T3, 1 μg/mL hidrocortisona, rh EGF 5 ng/mL e 5 μg/mL rh insulina rh). Incubar as células a 37 °C em 5% de CO2.</li>
	<li>Dissociar as células com 1 mL de 0,25% de trippsina por 5 minutos até que as células se desprendem completamente do fundo da placa.</li>
	<li>Adicione 10 mL de meio HITES completo para neutralizar a trippsina e colete as células em um tubo de 15 mL. Centrifugar a 4 °C a 300 x g por 5 min. ATENÇÃO: Monitore cuidadosamente o tempo para digestão de trippsina por microscopia, pois a superdigestão pode causar morte celular.</li>
	<li>Descarte o supernascer e resuspenque as células em 2 mL de meio HITES com 10% de FBS.</li>
	<li>Pipeta 10 μL da suspensão celular acima na placa e inseri-la em um contador celular automatizado para obter a concentração em células/mL.</li>
	<li>Placas BEAS-2B a uma concentração de 3 × 105 células/mL em 6 placas de poço em um volume total de 2 mL em meio HITES suplementado com 10% de FBS para cultura noturna.</li>
	<li>Trate as células com aproximadamente 80% de confluência, ou 5 x 105 células/mL, com 4% de CSE por 3 h. Antes do tratamento CSE, altere o meio com meio HITES com 1% de FBS.</li>
</ol>4. Infecção bacteriana
<ol><li>Adicione P. aeruginosa ou P. fluorescens Migula (~1 × 107 UFC/mL) a cada poço das células tratadas com CSE e incubar por 1 h a 37 °C em 5% DE CO2.</li>
	<li>Aspire os supernantes e substitua por 2 mL de meio HITES fresco para tratar com 4% de CSE e 100 μg/mL de gentamicina. NOTA: A gentamicina é usada porque é incapaz de penetrar membranas celulares epiteliais pulmonares humanas. Assim, pode matar todas as bactérias do meio, mas não aquelas que invadiram as células epiteliais pulmonares.</li>
	<li>Após 1h de tratamento de CSE/gentamicina a 37 °C em 5% de CO2,aspire os supernacantes e lave as células 3x com PBS para a subsequente determinação de concentração bacteriana. NOTA: Para confirmar as bactérias internalizadas, as células infectadas com P. fluorescens Migula, com a rotulagem GFP, foram observadas sob microscopia fluorescente.</li>
</ol>5. Determinação da concentração bacteriana utilizando o método da placa de gota
<ol><li>Para determinar a carga bacteriana em células infectadas com o método de placa de gota, lave as células tratadas com gentamicina 2x com 2 mL de PBS frio.</li>
	<li>Adicione 1 mL de tampão de lise celular (0,5% tritão X-100 em PBS) a cada poço.</li>
	<li>Diluir as células contendo as bactérias internalizadas em um gradiente (1:10, 1:100, 1:1.000 e 1:10.000) para a seguinte inoculação na placa de ágar TSB.</li>
	<li>Após 16 h de incubação, obtenha os resultados da UFC contando as colônias bacterianas.</li>
</ol>6. Detecção RT-qPCR de rRNA bacteriana 16S
<ol><li>Trate as células epiteliais pulmonares infectadas por Pseudomonas(~1 x 106 células/mL) com gentamicina conforme descrito acima. Aspire o meio e lave as células 2x com 2 mL de PBS frio.</li>
	<li>Adicione 0,35 mL do tampão de lise de tiocianato guanidium por poço de uma placa de 6 poços. Colete as células com um raspador de células. Pipete o lise em um tubo de microcentrifutura e misture suavemente com a pipeta.</li>
	<li>Adicione o mesmo volume (0,35 mL) de 70% de etanol recém-preparado no lise e misture bem. Transfira todas as amostras para uma coluna de spin colocada em um tubo de coleta de 2 mL. Centrifugar a 10.000 x g para 30 s a 20-25 °C. Em seguida, descarte o tampão no tubo de coleta.</li>
	<li>Lave a coluna com 0,7 mL de tampão de lavagem 1. Centrifugar a coluna a 10.000 x g para 30 s. Lave a coluna 2x com 0,5 mL de tampão para lavar o RNA ligado à membrana. Repita a centrifugação a 10.000 x g por 2 min.</li>
	<li>Coloque a coluna em um novo tubo de coleta de 1,5 mL. Adicione 30-50 μL de água sem RNase. Centrifugar a 10.000 x g por 1 min. Colete o fluxo e meça a concentração de RNA.</li>
	<li>Realize uma reação de transcrição reversa de acordo com o protocolo do fabricante. Misture 1 μg de RNA total com 10 mL de tampão de reação, 1 μL de transcriptase reversa e água sem RNase para uma reação de 20 μL. Conduza a reação de transcrição reversa a 37 °C por 1h e depois 95 °C por 5 min.</li>
	<li>Misture os modelos cDNA (1 μL de cada reação de transcrição reversa acima), 5 μL do Mix Mestre contendo corante SYBR, 1 μL de cada primers específicos de 200 nM e água em uma mistura de 20 μL para a análise de PCR a seguir, de acordo com as recomendações do fabricante. NOTA: Os seguintes são os primers direcionados ao rRNA 16S de P. aeruginosa: forward 5'-CAAAACTGAGAGCTAGAGTACG-3′; reverter 5'-TAAGATCTCAAG GATCCCAACGGC-3′. GAPDH foi usado como um controle de carregamento com os seguintes primers: para a frente: 5'-GGGGGGACTGGTCATGA-3′; reverso: 5'-TTCACCATGGAGAAGGC-3′.</li>
	<li>Use o método de tomografia comparativa para determinar a expressão.</li>
</ol>7. Detecção de Pseudomonas fluorescentes com citometria de fluxo
<ol><li>Trate as células epiteliais pulmonares infectadas por Pseudomonas(~1 x 106 células/mL) com gentamicina como descrito anteriormente. Aspire o meio e lave as células 2x com 2 mL de PBS frio.</li>
	<li>Analise as amostras com um citômetro de fluxo a um comprimento de onda de 509 nm para detecção de GFP. Termine cada leitura em 100.000 contagens. Analisar os dados adquiridos com softwares relacionados.</li>
</ol>

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<li>Amatngalim, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+epithelial+differentiation+by+cigarette+smoke+dysregulates+respiratory+host+defence%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence.</a> European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009(2018).</li>
<li>Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+airway+organoid+engineering+as+a+step+toward+lung+regeneration+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling.</a> Biomaterials. 113, 118-132 (2017).</li>
<li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A invasão bacteriana em células epiteliais pulmonares é um passo crucial na patogênese das infecções bacterianas. O processo de invasão bacteriana nas células pode ser dividido nas seguintes três etapas: Primeiro, as bactérias entram em contato e aderem à superfície da célula epitelial usando sua flagela. Em segundo lugar, as bactérias são submetidas à internalização ou penetram na membrana celular. Finalmente, as bactérias se replicam e colonizam as células se escapam com sucesso dos mecanismos de defesa celular<sup cla...

O tabagismo afeta a saúde pública de milhões de pessoas em todo o mundo. Muitas doenças deletérios, incluindo câncer de pulmão e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), estão relacionadas ao tabagismo1,,2. O tabagismo aumenta a suscetibilidade a infecções microbianas agudas no sistema respiratório3,,4,5. Além disso, evidências crescentes comprovam que o tabagismo aumenta a patogênese de muitas doenças crônicas6,,7,8. Por exemplo, o tabagismo pode aumentar as infecções virais ou bacterianas que causam a exacerbação da DPOC9. Entre os patógenos bacterianos que contribuem etiologicamente para a exacerbação aguda da DPOC, um patógeno de bacilo gram-negativo oportunista, Pseudomonas aeruginosa,causa infecções que se correlacionam com prognósticos ruins e maiores mortalidades10,11. A exacerbação da DPOC piora a doença acelerando a progressão patológica. Não há terapias eficazes contra a exacerbação da DPOC, exceto para a gestão antissintomática12. A exacerbação da DPOC promove a mortalidade do paciente, diminui a qualidade de vida e aumenta a carga econômica sobre a sociedade13.
As vias respiratórias são um sistema aberto, continuamente submetido a vários patógenos microbianos presentes externamente. Patógenos bacterianos oportunistas são geralmente detectados nas vias aéreas superiores, mas às vezes são observados nas vias aéreas inferiores14,15. Nos modelos animais P. aeruginosa pode ser detectado em sacos alveolares logo 1h após a infecção16. Como um grande mecanismo de defesa, células imunes como macrófagos ou neutrófilos eliminam as bactérias nas vias aéreas. As células epiteliais pulmonares, como a primeira barreira fisiológica, desempenham um papel único na defesa do hospedeiro contra infecções microbianas. As células epiteliais pulmonares podem regular a invasão microbiana, colonização ou replicação independente das células imunes17. Algumas moléculas encontradas em células epiteliais, incluindo PPARg, exercem funções antibacterianas, regulando assim a colonização bacteriana e a replicação nas células epiteliais pulmonares18. O tabagismo pode alterar as moléculas e prejudicar a função normal de defesa nas células epiteliais pulmonares19,20. Estudos recentes relataram exposição direta da fumaça do cigarro às células epiteliais pulmonares usando o aparelho de fumo robô21,22. A exposição à fumaça pode ser realizada de outras formas, incluindo a aplicação de CSE. A preparação do CSE é uma abordagem reprodutível com aplicações potenciais em outros tipos de células, incluindo células endoteliais vasculares que são indiretamente expostas à fumaça de cigarro.
Este relatório descreve um protocolo para gerar extrato de fumaça de cigarro para alterar a carga bacteriana em células epiteliais pulmonares. O CSE aumenta a carga bacteriana de P. aeruginosa,e pode contribuir para a recidiva de infecções bacterianas geralmente vistas na exacerbação da DPOC. Um método convencional é usado para a preparação de CSE. As células epiteliais pulmonares, em seu estágio de crescimento exponencial, são tratadas com 4% de ESC por 3 h. Alternativamente, as células epiteliais pulmonares cultivadas por monocamadas podem ser diretamente expostas à fumaça do cigarro em uma interface ar-líquido. As células tratadas com CSE são então desafiadas com Pseudomonas em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10. As bactérias são propagadas a uma velocidade de agitação particular para garantir que a morfologia de sua flagela permaneça intacta para manter sua capacidade invasiva total. A gentamicina é empregada para matar as bactérias deixadas no meio da cultura, reduzindo assim a contaminação potencial durante a subsequente determinação da carga bacteriana. O protocolo também usa Pseudomonascom a etiqueta GFP, que tem sido utilizada como uma poderosa ferramenta para estudar a infecção por Pseudomonas em diferentes modelos. Uma cepa representativa é P. fluorescens Migula23. O grau de infecção ou carga bacteriana após o tratamento de ESE é determinado de três maneiras: o método de placa de gota com contagem de colônias, PCR quantitativo usando primers pseudomonas 16S rRNA ou citometria de fluxo em células infectadas com Pseudomonasfluorescentes . Este protocolo é uma abordagem simples e reprodutível para estudar o efeito da fumaça de cigarro em infecções bacterianas em células epiteliais pulmonares.

<table><tbody><tr><td>Seringa de 50mL</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>célula epitelial das vias aéreas meio basal</td><td>ATCC</td><td>PCS-300-030</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de bactérias</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kit de crescimento de células epiteliais brônquicas</td><td>ATCC</td><td>PCS-300-040</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Sistema</td> <td>de PCR em tempo realBio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA-to-DNA KIT de alta capacidade</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4387406</td><td></td></tr><tr><td>HITES médio</td><td>ATCC</td><td>ATCC 30-2004</td><td></td></tr><tr><td>células BEAS-2B humanas</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>células epiteliais primárias humanas de pequenas vias aéreas</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-300-030</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal Nikkon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leitor OD</td><td>EUA Primers de PCR científicos</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ITD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>ATCC</td><td>ATCC 47085</td><td>PAO1-LAC</td></tr><tr><td>Pseudomonas fluorescens Migula</td><td>ATCC ATCC</td><td>27853</td><td>P.aeruginosa GFP</td></tr><tr><td>Cigarros de grau de pesquisa (3R4F)</td><td>Universidade de Kentucky</td><td>TP-7-VA</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Transprent PET Transwell Insert</td><td>Corning Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

estudando efeitos da fumaça do cigarro na infecção por pseudomonas em células epiteliais pulmonares

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

O tabagismo é a principal causa etiológica para enfisema pulmonar e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). O tabagismo também promove a suscetibilidade a infecções bacterianas no sistema respiratório. No entanto, os efeitos do tabagismo em infecções bacterianas em células epiteliais pulmonares humanas ainda não foram estudados minuciosamente. Descrito aqui é um protocolo detalhado para a preparação de extratos de tabagismo de cigarro (ECA), tratamento de células epiteliais pulmonares humanas com ESC, e determinação de infecção bacteriana e infecção. O CSE foi preparado com um método convencional. As células epiteliais pulmonares foram tratadas com 4% de CSE para 3 h. As células tratadas com CSE foram, então, infectadas com Pseudomonas em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10. As cargas bacterianas das células foram determinadas por três métodos diferentes. Os resultados mostraram que a CSE aumentou a carga de Pseudomonas em células epiteliais pulmonares. Este protocolo, portanto, fornece uma abordagem simples e reprodutível para estudar o efeito da fumaça de cigarro em infecções bacterianas em células epiteliais pulmonares.

Um diagrama é usado para ilustrar o protocolo na Figura 1. As células BEAS-2B epiteliais pulmonares foram tratadas com ETE e desafiadas com Pseudomonas. Pseudomonas no meio de cultura foram mortas pela gentamicina adicionada e as células foram submetidas ao ensaio da placa de gota, detecção RT-qPCR de Pseudomonas ribossomo 16S RNA, e citometria de fluxo. Em comparação com o controle, o tratamento de ECs aumentou substancialmente a infecção bacteriana nos métodos de...

Descrito aqui é um protocolo para estudar como o extrato de fumaça de cigarro afeta a colonização bacteriana em células epiteliais pulmonares.

Estudando efeitos da fumaça do cigarro na infecção por pseudomonas em células epiteliais pulmonares

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

Este protocolo usa três abordagens para determinar se a fumaça do cigarro afeta a carga bacteriana pseudomonas em células epiteliais pulmonares. Este método pode ser expandido para células endoteliais ou outras torneiras celulares. A preparação da extração da fumaça do cigarro, a infecção bacteriana e a determinação com uma carga bacteriana são bem descritas em detalhes neste vídeo.Este procedimento é muito fácil de seguir para os novos usuários. Desenhe 10 mililitros de cultura celular sem soro em uma seringa de 60 mililitros. Conecte a extremidade estreita de uma guarnição a uma ponta de pipeta mililitro no bocal da seringa, como adaptador para segurar o cigarro.Retire o filtro do cigarro e conecte o cigarro ao adaptador. Não mais do que 30 minutos antes de realizar o ensaio combustão do cigarro e desenhar 40 mililitros de fumaça contendo ar na seringa. Misture a fumaça com o meio sacudindo vigorosamente a seringa.Repita o processo de desenho até que o cigarro esteja completamente queimado, o que exigirá cerca de 11 empates em aproximadamente sete minutos. Para remover microrganismos e partículas insolúveis do meio, filtre-o através de um filtro de 0,22 míccro. Em seguida, transfira o meio para um tubo estéril fechado.Inocular um caldo de soja trippático ou placa de auger TSB com uma cepa de pseudomonas selecionada. Incubar a placa durante a noite a 37 graus Celsius. Prepare um tubo contendo 20 mililitros de TSB com 5% de glicerol como fonte de carbono.Recolhe uma mancha da placa de auger e inocula o TSB. Incubar a suspensão pseudomonas em um shaker de 37 graus Celsius a 200 RPM, por aproximadamente uma hora, até que a densidade óptica em 600 nanômetros seja de 0,6. Após a cultura das células epiteliais pulmonares, como descrito no manuscrito, adicione um mililitro de 0,25% de trippsina às células.Após aproximadamente cinco minutos, quando as células tiverem se separado completamente da parte inferior da placa, adicione 10 mililitros de altura completa para neutralizar a trippsina. Transfira as células para um tubo de 15 mililitros. Em seguida, centrifugar as células por cinco minutos a quatro graus Celsius e 300 vezes G.Remova e descarte o supernasce.Em seguida, suspenda novamente as células em mililitros de heights médios com 10% de FBS. Pipeta 10 microliters da suspensão da célula epitelial em uma nova placa. Use um contador celular automatizado para obter a concentração celular.Plaque as células epiteliais pulmonares a uma concentração de três vezes 10 a quinta células por mililitro, em um volume total de dois mililitros de médio por poço. Incubar as placas durante a noite. Quando as células atingirem aproximadamente 80% de confluência, substitua o meio por alturas médias, mais 1%FBS.Em seguida, adicione 4%CSE aos poços e incuba as placas por três horas. Adicione um pseudomonas a cada poço de células epiteliais pulmonares tratadas com ESE. Em seguida, incubar as placas por uma hora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.Em seguida, substitua o meio nas seis placas de poço por dois mililitros de altura fresca, contendo 4% de CSE e 100 microgramas por mililitro de gentamicina. Depois de incubar as placas por uma hora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono, aspire o meio dos poços. Lave as células tratadas com gentamicina, duas vezes, com dois mililitros de PBS frio.A carga de bactérias nas células epiteliais pulmonares pode então ser detectada pelo método de placa de gota, qRT-PCR ou citometria de fluxo. Adicione um mililitro de tampão de lise celular a cada poço de células epiteliais pulmonares. Reparar diluições seriais do lise celular, variando de 1 a 10 a 10.000.Em seguida, inocular a placa de auger TSB. Após 16 horas de incubação, determine quantas unidades formadoras de colônias estavam presentes nas células epiteliais pulmonares, contando o número de colônias bacterianas. Adicione 0,35 mililitros do tampão de tiocianato guanidinium a cada poço de células epiteliais pulmonares.Colete as células com um raspador de células. Pipete o lise em um tubo de microcrédito e misture suavemente com a pipeta. Adicione 0,35 mililitros de recém-preparado a 70% de etanol ao lise e misture bem.Transfira todas as amostras para uma coluna de spin colocada em um tubo de coleta de dois mililitros. Centrifugar o tubo de coleta por 30 segundos a 10.000 vezes G e 20 a 25 graus Celsius. Descarte o tampão no tubo de coleta e lave a coluna com 0,7 mililitros de tampão de lavagem.Centrifugar a coluna a 10.000 vezes G por 30 segundos. Lave a coluna duas vezes com 0,5 mililitros de tampão. Repita a centrifugação a 10.000 vezes G por dois minutos.Coloque a coluna em um novo tubo de coleta de 1,5 mililitro e adicione 30 a 50 microliters de água sem RNase. Depois de centrifugar o tubo a 10.000 vezes G por um minuto, coletar o fluxo através e medir a concentração de RNA. Preparar-se para uma reação de transcrição reversa de 20 microliteres faz um micrograma de RNA total com 10 microliters de tampão de reação, um microliter de transcriptase reversa e água sem RNase.Conduza a reação de transcrição reversa a 37 graus Celsius por uma hora e depois a 95 graus Celsius por cinco minutos, de acordo com o protocolo do fabricante. Em seguida, misture um microliter de cada amostra de cDNA com cinco microliters da mistura mestre contendo corante cibernético e um microliter de cada 200 primer específico nanomolar. Adicione água para um volume total de 20 microliters.Realizar a análise de PCR, de acordo com as recomendações do fabricante. E, em seguida, use o método de tomografia comparativa para determinar a expressão. Nas células BEAS-2B, a viabilidade não mudou consideravelmente quando as células foram tratadas com 4% de CSE por três horas.Uma hora como infecção por pseudomonas também não afetou substancialmente a viabilidade. Finalmente, eles usam a gentamicina para matar pseudomonas no meio da cultura não teve um efeito estatisticamente significativo na viabilidade celular. Medida pelo método da placa de gota, a infecção bacteriana nas células BEAS-2B foi substancialmente aumentada pelo tratamento com ESC.O mesmo aconteceu com o tratamento de ECS do HSAEC. A infecção bacteriana das células BEAS-2B tratadas com CSE também foi avaliada pelo uso de RT-PCR para quantificar a quantidade de rRNA 16S presente, o que indicou um aumento em Pseudomonas aeruginosa. As células BEAS-2B tratadas com CSE e infectadas com Pseudomonas fluorescens Migula foram analisadas por citometria de fluxo em 509 nanômetros.O resultado também indicou que o tratamento de ESC aumenta a infecção bacteriana. Os resultados da microscopia fluorescente mostraram que as bactérias rotuladas por GFP co-localizadas com células BEAS-2B em um experimento de infecção por Pseudomonas fluorescens Migula. As células podem ser expostas à fumaça de cigarro com robôs fumando, o que pode imitar o comportamento humano e tornar possível estudar diretamente os efeitos da fumaça do cigarro nas células epiteliais pulmonares.Esta técnica poderia ser usada para explorar uma fumaça de cigarro em outras torneiras de celular no contexto de uma infecção pulmonar. A abordagem descrita é a base para o desenvolvimento de terapias eficazes contra uma lesão pulmonar dorsal do cigarro e C0PD extra

studying-effects-cigarette-smoke-on-pseudomonas-infection-lung

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Células epiteliais pulmonares podem ser isolados do trato respiratório de camundongos e cultivadas em ar-líquido interface como um modelo de epitélio respiratório diferenciado. Um protocolo é descrito para o isolamento, cultura e expondo essas células à fumaça de cigarro mainstream, a fim de estudar as respostas moleculares para esta toxina ambiental.

Isolamento de rato células epiteliais respiratórias e exposição à fumaça de cigarro Experimental da Air interface líquido

Source: Li, T., et al. Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates how cigarette smoke extract weakens antimicrobial defense in lung epithelial cells by reducing AMP production, leading to increased bacterial invasion. The procedure measures intracellular bacterial load to assess the impact of smoke exposure on host-pathogen interactions.

Analyzing the Effects of Cigarette Smoke on Antimicrobial Defense in Lung Epithelial Cells

Descreve-se o método de ágar-esferas de estabelecer infecção das vias aéreas persistente a longo prazo crônica Pseudomonas aeruginosa no modelo de mouse.

Crônica de Longo Prazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infecção das vias aéreas em ratos

O objetivo deste protocolo é fornecer métodos automatizados para quantificar patologias pulmonares crônicas em um modelo murino de DPOC. O protocolo inclui a exposição de camundongos à fumaça de cigarro (CS), medição da função pulmonar, insuflação dos pulmões e uso de métodos de morfometria para medir o enfisema e a remodelação das pequenas vias aéreas em camundongos.

Automáticos de medição de enfisema pulmonar e das vias aéreas pequenas Reformas em cigarro expostas ao fumo Mice

O objetivo deste protocolo é expor modelos organotípicos de tecido brônquico e nasal 3D humanos à fumaça de cigarro convencional (CS) na interface ar-líquido. O impacto do CS nos tecidos é então investigado usando um ensaio de atividade do citocromo P450, uma medição de batimento de cílios e uma abordagem de biologia de sistemas.

Avaliação do Impacto da exposição repetida de Organotípicas 3D brônquica e cultura nasal Tissue Models para Whole fumo do cigarro

Usando ensaios ex vivo otimizados de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC), mostramos que uma preparação de produto de tabaco combustível suprime acentuadamente as citocinas secretadas intracelularmente mediadas por receptores e a capacidade citolítica de PBMCs efetores. Esses ensaios rápidos podem ser úteis na avaliação do produto e na compreensão dos potenciais efeitos a longo prazo da exposição ao tabaco.

Métodos para avaliar a citotoxicidade e Imunossupressão de combustível tabaco Preparações Produto

Embora o estudo in vitro das interações patógeno-hospedeiro permita a caracterização de respostas imunes específicas, modelos in vivo são necessários para observar os efeitos de respostas complexas. Usando a exposição a Candida albicans seguida de infecção pulmonar mediada por Pseudomonas aeruginosa, estabelecemos um modelo murino de interações microbianas envolvidas na patogenicidade da pneumonia associada à ventilação mecânica.

Estudar comunidades microbianas<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um modelo de interação mediada por anfitrião entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nas Airways

É apresentado aqui um protocolo útil para a fixação do pulmão que cria uma condição estável para a avaliação histológica de espécimes do pulmão de um modelo do rato do enfisema. A vantagem principal deste modelo é que pode fixar muitos pulmões com a mesma pressão constante sem colapso ou deflação do pulmão.

Fixação pulmonar pressão constante para avaliação de enfisema em camundongos

Este protocolo demonstra o estudo dos efeitos fisiofisiológicos da fumaça do cigarro (SC) com um sistema de exposição de inalação total (WBI) construído internamente. Este sistema pode expor animais a CS sob condições repetíveis controladas para pesquisa de efeitos mediados pela CS em enfisema pulmonar e hematopoiese.

Exposição à fumaça de cigarro em camundongos usando um sistema de inalação de corpo inteiro

Apresentamos aqui um método reprodutível, acessível e robusto para o isolamento e expansão de células epiteliais brônquicas primárias para biobanco de longo prazo e geração de células epiteliais diferenciadas por cultura na interface ar-líquido.

Isolando Células Epiteliais Brônquicas de Tecido Pulmonar Ressecado para Biobanco e Estabelecendo Culturas de Interface Ar-Líquido Bem Diferenciadas

Aqui, descrevemos um modelo in vitro para isolar e diferenciar células epiteliais das vias aéreas murinas, com foco em sua aclimatação ao extrato de fumaça de cigarro crônico (CSE). O modelo pode ser utilizado para caracterizar de forma abrangente o impacto multi-ômico do CSE, o que possivelmente fornece informações sobre as respostas celulares sob exposição crônica à fumaça.

Modelo in vitro para estudo da diferenciação e alterações de multiômicas em células epiteliais das vias aéreas murinas estimuladas com extrato de fumaça de cigarro

Aprenda a investigar o efeito do extrato de fumaça de cigarro na colonização bacteriana por Pseudomonas em células epiteliais pulmonares. Este método reprodutível permite avaliar a carga bacteriana e pode ser adaptado para outros tipos celulares.

Estudando efeitos da fumaça do cigarro na infecção por pseudomonas em células epiteliais pulmonares

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