Name: Preparação de extratos celulares por criogrinding em um moinho de congelador automatizado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min
Description: Aprenda a preparar extratos celulares de levedura por criomagem em moinho de congelador automatizado. Este método preserva a integridade proteica e melhora o rendimento de macromoléculas funcionais para estudos bioquímicos.

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A pesquisa no laboratório Gunjan é apoiada por financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde, Fundação Nacional de Ciência e do Departamento de Saúde da Flórida. Agradecemos ao estudante de graduação John Parker pela assistência técnica.

1. Preparação de Pipoca de Levedura
<ol><li>Cultivar células de levedura em 0,5 L de mídia YPD a uma densidade de 1 x 107 células/mL. Conte células usando um Contador Coulter ou qualquer outro meio.</li>
	<li>Centrífugas por 10 min a 2.400 g e 4 °C.</li>
	<li>Lave cada amostra uma vez com 500 mL de água desionizada de gelo 18 mega Ohm Milli-Q.</li>
	<li>Pelotas resuspend em 15 mL de tampão de lyse gelado [20 mM HEPES-KOH pH 7.5, 110 mM KCl, 0,1% Tween, 10% glicerol, com agente redutor recém-adicionado 10 mM β-mercaptoetanol, coquetel inibidor de protease, 10 μM inibidor proteasome MG-132, 1 mM inibidor de butilato de sódio e inibidores de fosfatose (1 mM vanadato de sódio, flúor de sódio de 50 mM, 50 mM de sódio β-glicerofosfato)]. Consulte a Tabela de Materiais para obter mais detalhes. Mantenha células resuspended no gelo até que as amostras estejam prontas para o próximo passo. NOTA: Uma grande variedade de tampões de lise contendo uma série de detergentes não iônicos pode ser usado com as amostras e inibidores específicos incluídos nele com base na aplicação a jusante. A inclusão de inibidores protease e proteassômicos são cruciais para prevenir a degradação proteica, especialmente quando os extratos são descongelados.</li>
	<li>Faça pipoca de levedura congelada snap adicionando lentamente a suspensão celular uma gota de cada vez usando uma pipeta sorológica pré-refrigerada em um ou mais tubos de centrífugas de 50 mL mantidos em gelo seco e preenchidos com LN2 até pouco abaixo da borda. Cubra o nitrogênio líquido no tubo com frequência para compensar sua perda devido à rápida evaporação. Trabalhe em uma área bem ventilada para evitar os perigos associados à asfixia por nitrogênio.<ol>
<li>Em vez de um tubo de 50 mL, use vários tubos de 50 mL amarrados (ou qualquer recipiente com uma boca grande, como uma grande garrafa de centrífuga plástica que pode tolerar temperaturas criogênicas) para preparação de milho pop(Figura 1A). Quanto maior o recipiente e sua abertura, mais fácil é a preparação da pipoca, pois isso evita o agrupamento da pipoca para formar grandes agregados. Uma faixa de tamanho de 0,3-0,5 cm para a pipoca é ideal para alcançar a moagem/pulverização adequada utilizando o moinho de congelador(Figura 1B).</li>
		<li>Certifique-se de que a LN2 tenha evaporado completamente dos tubos que contêm a pipoca antes de armazená-los a -80 °C. É possível parar depois de preparar a pipoca de levedura, pois elas estão estáveis por vários anos quando mantidas a -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61164/61164fig01.jpg"> Figura 1: Preparação de pipoca de levedura. (A) A "pipoca" de levedura é feita pelo congelamento da suspensão da célula na LN2. Usamos de um a três tubos de 50 mL mantidos juntos com um elástico e colocados em um balde de gelo cheio de gelo seco. Os tubos são preenchidos com LN2 até pouco abaixo de suas bordas e são cobertos com nitrogênio líquido frequentemente para mantê-los quase cheios até que toda a suspensão celular tenha sido feita em pipoca (B) O tamanho da pipoca é um importante determinante da eficiência ideal de moagem. A faixa de tamanho da pipoca deve ter entre 0,3 e 0,5 cm de diâmetro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61164/61164fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
2. Criogrinding
<ol><li>Para começar, certifique-se de que háLN 2 suficiente disponível para esfriar o moinho de congelador, moendo frascos, suprimentos e para operar a máquina para todas as amostras. Para menos de cinco amostras, 30-35 L de LN2 devem ser suficientes. Encha a câmara do moinho de congelador com LN2 até a linha de enchimento. ATENÇÃO: Todas as etapas que envolvam a LN2 devem ser realizadas em uma área bem ventilada e a própria fábrica de congeladores deve ser localizada em tal área para evitar risco de asfixia. Use equipamentos de proteção pessoal, incluindo calçados adequados, jaleco, óculos de segurança, uma camada base de luvas de nitrito, depois luvas térmicas, seguido por outro par de luvas de nitrito. Tenha extrema cautela ao manusear ln2.</li>
	<li>Feche a tampa do moinho de congelador lentamente, evitando o respingo de LN2 e deixe alguns minutos para a máquina esfriar. Pode ser necessário reabastecer a câmara com LN2 para compensar a perda devido à evaporação antes de prosseguir para a próxima etapa. NOTA: Refil LN2 conforme necessário apenas até a linha de enchimento. Não enchimento demais da câmara, pois isso pode ser perigoso e prejudicial para a máquina. Sistemas automatizados de recarga estão disponíveis para o moinho de congelador que pode reabastecer o LN2 evaporando conforme necessário diretamente de um tanque de armazenamento conectado ao moinho de congelador.</li>
	<li>Pré-arrefecimento os grandes frascos de moagem e a barra de impacto magnético, mergulhando-os na LN2 mantidos em uma pequena guerra separada. Decante toda a LN2 quando a LN2 parar de borbulhar. Em seguida, adicione a pipoca de amostra/levedura ao frasco de moagem e sele-a firmemente com os dois plugues de extremidade de aço inoxidável.<ol>
<li>Não encha mais de um terço do frasco de moagem com a amostra, pois isso pode reduzir a eficiência da moagem. Em vez disso, amostras maiores podem ser processadas dividindo-as em dois ou mais frascos e moendo-os sequencialmente. Frascos de moagem menores podem ser usados para amostras menores (até 3 mL).</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque o frasco de moagem na câmara do moinho de congelador e bloqueie-o no lugar. Feche a tampa.</li>
	<li>Para a levedura brotante, triture as amostras para um total de três ciclos por 2 min/ciclo (com 2 minutos de quebra para resfriamento entre ciclos) a uma taxa de esmagamento de 14. Quando a máquina parar após completar os ciclos, abra a tampa do moinho de congelador lentamente e desbloqueie cuidadosamente o frasco com o lise celular congelado em pó e remova-o do moinho de congelador. Se vários frascos pequenos forem usados, trabalhe rapidamente para remover um frasco de cada vez e coloque-os em gelo seco. NOTA: Geralmente não há necessidade de ajustar os parâmetros de moagem ao usar frascos de diferentes tamanhos com o mesmo tipo de amostra. No entanto, os parâmetros de moagem, como o número de ciclos e a taxa de moagem, precisam ser empiricamente determinados para diferentes tipos de amostra, dependendo da facilidade com que eles lise. A maioria das células de mamíferos e tecidos moles seliseão em ciclos de 1 a 2 a uma taxa de esmagamento de 10. Amostras mais difíceis delise, como bactérias, leveduras, larvas de mosca e moscas adultas, requerem 3-6 ciclos na taxa máxima, enquanto tecidos duros como osso, dentes, etc. podem exigir até 10 ciclos. Uma pequena alíquota da amostra descongelada pode ser vista sob o microscópio antes e depois da moagem para contar o número de células intactas e não tortos para determinar a eficiência da lise. Uma excelente análise do impacto dos parâmetros criogrinding na liberação de proteínas e DNA da levedura brotante foi publicada anteriormente15.</li>
	<li>Trabalhando rapidamente para não permitir que a amostra descongele, desaparafusar cuidadosamente uma das peças finais (escolha a que parece ter ficado um pouco solta durante a moagem) usando a ferramenta de abertura. Em seguida, use um par de fórceps longos (que são pré-refrigerados em um balde com gelo seco) para remover a barra impactor. Colete a amostra pulverizada invertendo e tocando o frasco de moagem em um prato de pesagem de poliestireno pré-refrigerado com LN2 e mantido em gelo seco.</li>
	<li>Uma vez que todo o lysato de células congeladas em pó tenha sido recuperado do frasco de moagem, despeje o lysate em pó do prato de pesagem de volta para o tubo de 50 mL e proceda imediatamente para o passo de descongelamento lento descrito em seguida para melhores resultados. Alternativamente, armazene o lise em pó congelado durante a noite a -80 °C, embora isso possa resultar em alguma degradação.</li>
	<li>Prepare um balde de gelo com 50% de água e coloque-o em uma placa de agitação com um agitador magnético. Submerse um rack de arame ou outro rack adequado no chorume de gelo para segurar as amostras.<ol>
<li>Em seguida, descongele lentamente as amostras em um banho de chorume de gelo com agitação constante do chorume usando um agitador magnético. Adicione mais gelo para substituir o gelo derretido (algumas águas podem precisar ser descartadas para evitar que o balde de gelo transborde). Uma vez que vários inibidores têm meia vida curta em tampões aquosos, adicione coquetel inibidor adicional de protease (ver Tabela de Materiais) e 10 μM inibidor proteasome MG-132 ao lisato assim que as amostras começarem a descongelar (após aproximadamente 30 min).</li>
		<li>Remova o gelo formado na parte externa dos tubos a cada 5 minutos para acelerar o processo de descongelamento. Note que o descongelamento rápido das amostras à temperatura ambiente ou mais alta pode levar a uma degradação significativa.</li>
	</ol></li>
	<li>Depois que as amostras tiverem descongelado completamente (pode levar mais de uma hora dependendo da quantidade de amostra), centrifugar o lysate a ~3.220 g por 20 min em uma centrífuga de mesa refrigerada a 4 °C para remover a maior parte dos detritos celulares do liseto.</li>
	<li>Transfira o supernatante para tubos de centrífugas de policarbonato de 50 mL que foram pré-refrigerados no gelo e centrífuga as amostras a 16.000 g por 20 minutos a 4 °C (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Transfira apenas o supernanato claro consistindo do extrato celular inteiro esclarecido do centro da coluna líquida no tubo de forma muito lenta e cuidadosa, sem perturbar a camada lipídica nublada(Figura 2),em um tubo refrigerado de 15 mL usando pipetas sorológicas pré-refrigeradas. Evite remover todo o lise no tubo de centrífuga para evitar a transferência de lipídios e detritos. O cano de sobra no tubo centrífuga pode ser centrifuuado várias vezes para recuperar pequenas quantidades de extrato após cada giro. NOTA: Lipídios, juntamente com quaisquer proteínas desnaturadas, parecem nublados/leitosos e estão localizados no topo da interface líquido/ar, e ocasionalmente acima da própria pelota que consiste em detritos celulares insolúveis(Figura 2).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61164/61164fig02.jpg"> Figura 2: Extrair camadas em um tubo de centrífuga. As principais características visíveis de todo o extrato celular em um tubo após centrifugação a 16.000 g por 20 min são indicadas. A abundância relativa de cada característica depende do tipo de amostra, da fase de crescimento das células (exponencial versus estacionária), da quantidade de tampão de lise usada para resuspend células e da eficiência da lise. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61164/61164fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="12"><li>Centrifugar qualquer lise restante por 5 minutos para recuperar mais do extrato. Repita esta centrifugação de 5 minutos várias vezes se necessário para recuperar o máximo possível do extrato claro. Descarte o lise nublado contendo lipídios perto da parte inferior do tubo perto da pelota.</li>
	<li>Use esses extratos para aplicações a jusante, como purificação complexa de proteínas, imunoprecipitação e análise proteômica.</li>
</ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Uma limitação de estudar proteínas nativas a partir de levedura é a lise ineficiente das células de levedura devido à sua parede celular resistente. Embora vários métodos tenham sido desenvolvidos, o método mais consistente e eficiente em nossas mãos é o criogrinding de células de leveduras flash congelado como pipoca. Este método permite a preparação confiável de extratos celulares inteiros de alta qualidade de levedura brotante em comparação com outros métodos de lise. Os resultados representativos demonstraram que a c...

A levedura é um organismo modelo popular para estudos de proteínas, pois é um simples organismo eucariótico com abundância de ferramentas genéticas e bioquímicas disponíveis para pesquisadores1. Por causa de sua parede celular resistente, um desafio que os pesquisadores enfrentam é desaformar as células sem danificar o conteúdo celular. Diferentes métodos estão disponíveis para a obtenção de extratos proteicos através da interrupção de células de levedura que incluem lise enzimática (zymolyase)2,3, lise química4, lise física por congelamento5,à base de pressão (imprensa francesa)6,7, mecânica (contas de vidro, moedor de café)8,9, baseado em sônicação10 e criogênico2,11. A eficiência da lise celular e o rendimento da proteína podem variar consideravelmente dependendo da técnica empregada, afetando assim o resultado final ou a adequação para a aplicação a jusante desejada para o lise. Ao estudar proteínas instáveis, ter modificações pós-transacionais fugazes ou sensíveis à temperatura, é particularmente importante usar um método que minimize a perda ou a degradação da amostra durante a preparação.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Técnica de preparação de extrato</td>
			<td>Detalhes</td>
			<td>Vantagens</td>
			<td>Desvantagens</td>
			<td>Análise a jusante</td>
			<td>Referência</td>
		</tr><tr><td>Imprensa francesa: Homogeneizador de alta pressão (também conhecido como Microfluidizer) com pré-tratamento enzimático usando Zymolyase</td>
			<td>Zymolyase-20T, um homogeneizador de alta pressão microfluidizador. O disruptor consiste em uma bomba de alta pressão acionada a ar (razão 1:250; pressão de ar necessária 0,6-l MPa) e uma câmara de interrupção especial com uma unidade de pressão traseira adicional. É necessário um tamanho amostral mínimo de 20 mL para o processamento.</td>
			<td>A interrupção total final obtida usando o protocolo combinado aproximou-se de 100 % com 4 passes a uma pressão de 95 MPa, em comparação com apenas 32 % de interrupção com 4 passes a 95 MPa usando apenas homogeneização sem o Zymolyase.</td>
			<td>Não é apropriado para aplicações em pequena escala. As enzimas podem ficar caras para preparações em grande escala.</td>
			<td>Purificação de proteínas</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>Batedor de contas: células tratadas com zymolyase com contas de vidro em um instrumento fastprep</td>
			<td>Aproximadamente um volume igual de contas de vidro frias, secas e lavadas com ácido é adicionado a um determinado volume de pelotas de célula no tampão de lise e as células são interrompidas por uma agitação manual vigorosa.</td>
			<td>É particularmente útil ao fazer extratos de muitas culturas de leveduras pequenas diferentes para fins de ensaio, em vez de para purificação de proteínas.</td>
			<td>Durante o procedimento das contas de vidro, as proteínas são tratadas severamente causando espuma extensiva levando à desnaturação proteica. A quantidade de quebra celular varia, enquanto a proteólise, bem como a modificação das proteínas podem resultar do aquecimento do extrato acima de 4°C durante a quebra mecânica.</td>
			<td>Principalmente análises de DNA e RNA, mas também análises de proteínas por eletrofiorese de gel desnaturing, com ou sem manchas ocidentais.</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>Tratamento zymolyase seguido de lise usando uma combinação de choque osmótico e homogeneização do Dounce</td>
			<td>Após a digestão enzimática das paredes celulares, os esferoplastos são líssedos com 15 a 20 traçados de um pilão apertado (folga de 1 a 3 μm) em um homogeneizador do Dounce.</td>
			<td>Vantajoso para o uso de cepas deficientes protease, como BJ926 ou EJ101. Esta é a maneira mais suave de quebrar células de levedura e, portanto, é mais adequada para o preparo de extratos que podem realizar funções enzimáticas complexas (por exemplo, tradução, transcrição, replicação de DNA) e em que a integridade das estruturas macromoleculares (por exemplo, ribossomos, emendas) deve ser mantida. Também é útil para isolar núcleos intactos que podem ser usados para estudos de cromatina (Bloom and Carbon, 1982) ou para extratos de proteína nuclear (Lue e Kornberg, 1987).</td>
			<td>As principais desvantagens do procedimento de lise esferoplastia são que ele é relativamente tedioso e caro, especialmente para preparações em larga escala (>10 litros), e os longos períodos de incubação podem levar à proteólise ou modificação de proteínas.  Para as preparações de cromatina, elas parecem ser de qualidade variada ou inferior às produzidas pela centrifugação diferencial (baseada na integridade da escada nucleossomo).</td>
			<td>Isolando núcleos intactos para estudos de cromatina, extratos que podem realizar funções enzimáticas complexas, extratos que requerem a integridade de estruturas macromoleculares, extratos de proteínanuclear.</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Interrupção celular de células congeladas flash moendo em nitrogênio líquido usando uma argamassa/pilão ou um liquidificador</td>
			<td>As células são congeladas imediatamente em nitrogênio líquido e depois líricas moendo manualmente em uma argamassa usando um pilão, ou usando um liquidificador Waring na presença de nitrogênio líquido.</td>
			<td>O protocolo é rápido e fácil. Pode acomodar quantidades variadas de células de levedura, incluindo culturas muito grandes. Sua principal vantagem é que as células são imediatamente retiradas do estado de crescimento ativo em nitrogênio líquido (−196°C), diminuindo as atividades de enzimas degradativas, como proteases e nucleases, bem como atividades que modificam proteínas (por exemplo, fosfates e quinases). É particularmente adequado para fazer extratos de células inteiras a partir de uma única cultura de levedura para purificação de proteínas em larga escala.</td>
			<td>Um pouco confuso e potencialmente perigoso para o investigador descuidado. Pequenas amostras (ou seja, culturas de levedura de 10 a 100 ml) não são facilmente processadas porque não há massa suficiente de aglomerados de células congeladas para fraturar efetivamente no liquidificador. É demorado processar amostras individuais e limpar o equipamento entre os usos.</td>
			<td>Extratos de células inteiras de uma única cultura de levedura para purificação de proteínas em larga escala.</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Autolise, fábrica de contas</td>
			<td>pH 5.0, 50 °C, 24 h, 200 rpm / Ø 0,5 mm, 5 × 3 min/3 min</td>
			<td>Lise rápida e eficiente, especialmente para preparação de extratos em pequena escala</td>
			<td>A geração de calor leva à desnaturação e degradação das macromoléculas. Equipamento de espancamento de contas necessário.</td>
			<td>Análises em pequena escala.</td>
			<td rowspan="2">10</td>
		</tr><tr><td>Autolise, Sonicação</td>
			<td>pH 5.0, 50 °C, 24 h, 200 rpm, 4 × 5 min/2 min, pulser 80%, potência 80%</td>
			<td>Os equipamentos de sonicação geralmente estão disponíveis na maioria das instituições.</td>
			<td>A geração de calor leva à desnaturação e degradação das macromoléculas. Equipamento de sonicação necessário. A lise lenta pode levar mais de 24 horas.</td>
			<td>Preparações da parede celular de levedura.</td>
		</tr><tr><td>Processo de ebulição e congelamento</td>
			<td>Nenhum equipamento especializado é necessário além de um freezer padrão e um bloco de aquecimento ou banho de água quente.</td>
			<td>Eficiente, reprodutível, simples e barato.</td>
			<td>A geração de calor leva à desnaturação e degradação das macromoléculas.</td>
			<td>Análises de DNA por PCR.</td>
			<td>5</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Comparação dos métodos disponíveis para a preparação de extratos de levedura.
A criogrinding (também conhecida como moagem criogênica/moagem criogênica) é comumente empregada para recuperar ácidos nucleicos, proteínas ou produtos químicos de amostras sensíveis à temperatura de forma confiável para análises quantitativas ou qualitativas. Tem sido usado com sucesso para múltiplas aplicações em diversas áreas, incluindo biotecnologia, toxicologia, ciência forense12,13, ciência ambiental, biologia vegetal14 e ciência de alimentos. O isolamento de macromoléculas biológicas intactas é geralmente criticamente dependente da temperatura. Temperaturas extremamente baixas garantem que as proteases e núcleos permaneçam inativos, resultando em um isolamento confiável de proteínas intactas, ácidos nucleicos e outras macromoléculas para análises subsequentes. De fato, um moinho de congelador normalmente mantém uma temperatura amostral de -196 °C (o ponto de ebulição da LN2), minimizando assim o DNA/RNA ou desnaturação e degradação de proteínas.
A fábrica de congeladores emprega uma câmara de moagem eletromagnética que move rapidamente uma barra de metal sólido ou cilindro para frente e para trás dentro de um frasco contendo a amostra a ser pulverizada entre plugues finais de aço inoxidável. O instrumento cria e rapidamente inverte um campo magnético dentro da câmara de moagem. À medida que o campo magnético muda para frente e para trás, o ímã esmaga a amostra contra os plugues, alcançando assim o "criogrinding" e a pulverização da pipoca. A fábrica de congeladores substitui a argamassa e o pilão e permite o processamento sequencial de várias amostras (ou até 4 amostras menores simultaneamente) com alta reprodutibilidade e evita a variabilidade usuário-usuário associada à moagem manual. Uma vez que as amostras são processadas, os extratos celulares podem ser usados para uma variedade de aplicações a jusante.

<table><tbody><tr><td>Tubos de policarbonato de 50 mL com tampas de rosca</td><td>Beckman</td><td>357002</td><td>Tubos de centrífuga</td></tr><tr><td>BD Bacto Peptona</td><td>BD Biosiences</td><td>211677</td><td>Levedura YPD componente de mídia</td></tr><tr><td>BD Extrato de levedura</td><td>Bacto BD Biosiences</td><td>212750</td><td>Levedura YPD componente de mídia</td></tr><tr><td>Centrífuga Beckman Avanti</td><td>Beckman</td><td>B38624</td><td>Centrífuga de alta velocidade</td></tr><tr><td>Beckman JLA-9.1000</td><td>Beckman</td><td>366754</td><td>Rotor</td></tr><tr><td>D-(+)-Dextrose Anidro</td><td>MP Biomedicals</td><td>901521</td><td>Levedura YPD componente de mídia</td></tr><tr><td>Eppendorf A-4-44</td><td>Eppendorf</td><td>22637461</td><td>Rotor de caçamba oscilante</td></tr><tr><td>Eppendorf centrífuga refrigerada 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>22625101</td><td>Centrífuga refrigerada</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G5150-1GA</td><td>Excludente de volume e crioprotetor</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>FisherBiotech</td><td>BP310-100</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>HIS6 anticorpo</td><td>Novagen</td><td>70796</td><td>Anticorpo para etiqueta HIS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9541-1KG</td><td>Sal para manter a força iônica</td></tr><tr><td>MG-132</td><td>CALBIOCHEM</td><td>474790</td><td>Inibidor de proteassoma</td></tr><tr><td>Coquetel de inibidor de fosfatase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32957</td><td>Coquetel de inibidor de fosfatase</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>SIGMA</td><td>P7170-1L</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel de inibidor de protease</td> de mancha de proteína <td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32963</td><td>Coquetel de inibidor de protease</td></tr><tr><td>Rotor JLA 25.500</td><td>Beckman</td><td>JLA 25.500</td><td>Rotor</td></tr><tr><td>Butirato de sódio</td><td>EM Science</td><td>BX2165-1</td><td>Inibidor de histona desacetilase</td></tr><tr><td>Fluoreto de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6521</td><td>Inibidor de Fosfatase</td></tr><tr><td>Vanadato de Sódio</td><td>MP Biomedicals</td><td>159664</td><td>Inibidor de Fosfatase</td></tr><tr><td>Beta;-glicerofosfato de Sódio Alfa</td><td>Aesar</td><td>13408-09-8</td><td>Inibidor de Fosfatase</td></tr><tr><td>Spex Certiprep 6850 moinho congelador</td><td>SPEX Sample Prep</td><td>6850</td><td>Moinho Congelador</td></tr><tr><td>TALON Metal Affinity Resina</td><td>BD Biosiences</td><td>635502</td><td>Para puxar para baixo as proteínas marcadas com HIS</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>VWR International</td><td>VW1521-07</td><td>Detergente não iônico</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>AMRESCO</td><td>M131-250ML</td><td>Agente redutor</td></tr></tbody></table>

preparação de extratos celulares por criogrinding em um moinho de congelador automatizado

Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill

A facilidade da manipulação genética e a forte conservação evolutiva das máquinas celulares eucarióticas na levedura saccharomyces cerevisiae tornou-a um organismo modelo genético preeminente. No entanto, uma vez que o isolamento eficiente da proteína depende da interrupção ideal das células, o uso de levedura para análise bioquímica de proteínas celulares é dificultado por sua parede celular que é cara para digerir enzimaticamente (usando lyticase ou zymolyase), e difícil de interromper mecanicamente (usando um batedor de contas tradicional, uma prensa francesa ou um moedor de café) sem causar aquecimento de amostras, o que por sua vez causa denaturação e degradação de proteínas. Embora a moagem manual de células de levedura sob nitrogênio líquido (LN2) usando uma argamassa e pilão evite o superaquecimento das amostras, é trabalhosa intensiva e sujeita à variabilidade na lise celular entre os operadores. Por muitos anos, temos preparado com sucesso extratos de levedura de alta qualidade usando criogrinding de células em uma fábrica de congelador automatizada. A temperatura de -196 °C alcançada com o uso da LN2 protege o material biológico da degradação por proteases e núcleos, permitindo a recuperação de proteínas intactas, ácidos nucleicos e outras macromoléculas. Aqui descrevemos esta técnica em detalhes para células de levedura brotante que envolve primeiro o congelamento de uma suspensão de células em um tampão de lise através de sua adição dropwise em LN2 para gerar gotículas congeladas de células conhecidas como "pipoca". Esta pipoca é então pulverizada sob LN2 em um moinho de congelador para gerar um extrato congelado "em pó" que é descongelado lentamente e esclarecido por centrifugação para remover detritos insolúveis. Os extratos resultantes estão prontos para aplicações a jusante, como purificação de proteínas ou ácidos nucleicos, análises proteômicas ou estudos de co-imunoprecipitação. Esta técnica é amplamente aplicável para a preparação de extratos celulares de uma variedade de microrganismos, tecidos vegetais e animais, espécimes marinhos, incluindo corais, bem como isolar DNA/RNA de espécimes fósseis forenses e permafrost.

Comparamos dois métodos diferentes para a lise celular de levedura, a moagem de contas de vidro a 4 °C e um método automatizado de criogrinding a -196 °C, para avaliar as proteínas de recuperação relativa nos extratos celulares preparados com ambos os métodos. Para este estudo, optou-se por usar uma levedura brotante YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2::ura3 ubi3 -Δub-2 ubi4-Δ2::LEU2 [pUB39] [pUB221])16 carregando...

Descrevemos um método confiável para a preparação de extratos celulares inteiros de leveduras ou outras células usando uma fábrica de congelador criogênico que minimiza a degradação e a desnaturação de proteínas. Os extratos celulares são adequados para purificação de complexos proteicos funcionais, análises proteômicas, estudos de co-imunoprecipitação e detecção de modificações de proteína labile.

Preparação de extratos celulares por criogrinding em um moinho de congelador automatizado

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ...

A levedura é um organismo modelo popular, não apenas para estudos genéticos, mas também para estudos bioquímicos de proteínas e outras macromoléculas extraídas do tipo selvagem e cepas de leveduras mutantes. No entanto, devido às suas paredes celulares resistentes, um grande desafio que os pesquisadores enfrentam é essa lise eficiente das células de levedura sem danificar o conteúdo celular. O isolamento de macromoléculas biológicas intactas é geralmente crítico, dependente da temperatura.A preparação dos extratos em baixa temperatura garante que as proteases e núcleos intracelulares permaneçam inativos, resultando em isolamento confiável de proteínas intactas, ácidos nucleicos e outras macromoléculas para lise suficiente. Vários métodos estão disponíveis para a obtenção de extratos de levedura através de enzimática, química e lise física. No entanto, a lise enzimática é cara devido à exigência de enzimas purificadas para digerir a parede celular, limitando assim o uso de menor número de células.Além disso, as reações enzimáticas devem ser monitoradas de perto para evitar a digestão excessiva e a lise prematura das células. Métodos químicos utilizando agentes de desnaturação fortes, embora eficazes, resultam na desnaturação de proteínas e, como tal, não são adequados para o isolamento de complexos proteicos ou enzimas funcionais. Métodos físicos, como a lise sob alta pressão em uma imprensa francesa, podem ser realizados no frio a quatro Celsius, mas que não é frio o suficiente para evitar a degradação e a desnaturação de todas as proteínas nativas.Outros métodos físicos populares são o uso de uma argamassa e pilão, liquidificador ou moedor de café para moer células de levedura resuspended em um tampão de lise e congelado como gotículas ou moagem e mistura de contas de vidro e levedura em um moinho de batedor de contas de preparação rápida ou uma lise por sônica. No entanto, a moagem manual é intensiva em mão-de-obra e o rendimento da proteína resultante pode variar consideravelmente dependendo das técnicas empregadas enquanto a lise por sônica ou moagem em um liquidificador, moedor de café ou moinho de batedor de contas gera uma quantidade substancial de calor, o que resulta em uma desnaturação e degradação proteica. Portanto, para obter lise celular de levedura com proteínas em seu estado natal com desnaturação mínima e degradação para aplicações como purificações de complexos proteicos funcionais, ensaios bioquímicos ou detecção de modificações pós-translacionais fugazes, é essencial usar um método de lise facilmente escalável que minimizará a geração de calor, permitindo uma lise eficiente, independentemente da quantidade de células.Aqui descrevemos um método que envolve o uso de uma fábrica de congeladores criologicamente para a lise das células em nitrogênio líquido a menos 196 Celsius para gerar extratos de células congeladas, permitindo assim a recuperação de macromoléculas funcionais intactas, como proteínas ou DNA e RNA, a uma temperatura muito baixa que minimiza a desnaturação e a degradação. Este método pode ser prontamente adaptado para uso com qualquer tipo de amostra de célula ou tecido de qualquer espécie, incluindo amostras forenses e até antigas recuperadas de sítios arqueológicos ou encontradas congeladas em permafrost. A fábrica de congeladores usa uma câmara de moagem eletromagnética supercondutora que move rapidamente uma barra de metal sólido para frente e para trás dentro de um arquivo de policarbonato contendo a amostra a ser pulverizada entre plugues finais de aço inoxidável.Este método de lise celular física permite uma lise mais eficiente e, reproduvelmente, resulta em um extrato de melhor qualidade. As células de levedura foram cultivadas a uma concentração de 10 milhões de células por mil. Estas células de levedura foram colocadas antes da garrafa de centrífuga gelada e foram giradas por 10 minutos a 2.400 G.Uma vez que o giro está completo, decantar o sobrenante sem perturbar as células pelleted.Esta pelota foi resuspended em uma pequena quantidade de água gelada, cerca de metade do volume inicial da cultura para lavar as células. As células resuspended foram novamente giradas para baixo por mais 10 minutos a 2.400 G.Uma vez que o próximo giro está completo, nós, novamente, decantamos todo o supernante sem perturbar a pelota. Esta pelota será então resuspended e 15 ML de tampão de lise gelada.Certifique-se de que a pelota está completamente resuspendida. As células resuspended devem permanecer no gelo em um tubo pré-marcado até estar pronto para o próximo passo. Use sempre equipamentos de proteção individual ao manusear nitrogênio líquido, como óculos de segurança, proteção manual e jalecos.Para maximizar nossa destreza, muitas vezes usamos um par de luvas térmicas brancas entre dois pares de luvas de nitrito. Troque as luvas externas e nitríis com frequência, pois elas rasgam facilmente após serem expostas a nitrogênio líquido. Em nosso laboratório, transferimos uma alíquota de nitrogênio líquido para um pequeno recipiente de nitrogênio líquido de cinco litros.O nitrogênio líquido é então derramado em um tubo de 50 ML que foi pré-refrigerado em gelo seco. Uma vez que o tubo de 50 ML esteja cheio de nitrogênio líquido, adicionamos o extrato de levedura lentamente, de forma sábia ao tubo em incrementos de 1,5 mililitro. Para minimizar a formação de grandes pelotas de pipoca, a suspensão da levedura é adicionada em um movimento circular.Para evitar ainda a formação de grandes pelotas de pipoca, usamos grandes fórceps para garantir que todas as pelotas estejam entre 0,3 e 0,5 centímetros de diâmetro. Como o nitrogênio líquido está sempre evaporando, certifique-se de reabastecer o tubo com nitrogênio líquido antes de adicionar cada 1,5 mil alíquotas de suspensão de levedura. Uma vez que toda a suspensão da levedura tenha sido feita em pipoca, permita que o tubo com pipoca fique sem a tampa por dois a três minutos para deixar que todo o nitrogênio líquido residual evaporasse.Para ter certeza de que todo o nitrogênio líquido evaporou, feche a tampa quase completamente e agite suavemente. Se há um ruído de assoante, indica que o nitrogênio líquido ainda não evaporou completamente. Abra a tampa por mais um minuto ou mais para permitir que o nitrogênio líquido restante evapore antes de fechar a tampa firmemente.O líquido residual no tubo pode causar uma explosão se a tampa for fechada prematuramente. Esta pipoca de levedura pode ser armazenada quase indefinidamente em menos 80 graus C.Para pelo menos cinco amostras, certifique-se de que você tenha 30 a 35 litros de nitrogênio líquido disponíveis. Encha o moinho de congelador na linha completa e feche a tampa para permitir que o moinho de congelador esfrie por alguns minutos.Mais uma vez, lembre-se sempre de usar equipamento de proteção pessoal ao lidar com nitrogênio líquido. Os frascos de moagem de policarbonato, os plugues de extremidade de aço inoxidável e a barra de impacto deve ser pré-refrigerado com nitrogênio líquido. Mantenha esses componentes submersos até que o nitrogênio líquido pare de borbulhar.Lembre-se de manter todas as amostras de pipoca em gelo seco até que todo o processo de moagem esteja completo. Retire todo o nitrogênio líquido dos frascos de moagem e transfira sua pipoca para o frasco. Não se esqueça de colocar uma barra de impacto magnético no frasco de moagem também.Sele o frasco de moagem colocando cuidadosamente o plugue de aço inoxidável uniformemente na extremidade do frasco de moagem. Nós batemos cada extremidade do frasco de moagem em uma tábua de madeira com uma vibração absorvendo apoio de borracha para garantir que os plugues finais sejam colocados corretamente e estejam selando os frascos de moagem firmemente. É importante fixar os plugues finais para garantir que eles não se soltem e permitam que as amostras derramem no moinho de congelador durante o processo de moagem.Coloque um frasco de moagem na câmara de moagem do moinho de congelador e bloqueie no lugar. Feche a tampa do moinho de congelador e triture a amostra por três ciclos a dois minutos por ciclo, a uma taxa de esmagamento de 14. Após os ciclos de moagem estiverem completos, desbloqueie o frasco com o lise de células congeladas em pó.Para evitar que o lisato descongele, trabalhe de forma rápida e cuidadosa para desaparafusar um dos plugues finais usando a ferramenta de abertura. Uma vez que o frasco esteja aberto, remova a barra impactor e transfira rapidamente o extrato de pó congelado em um prato de pesagem de plástico pré-refrigerado. Recupere o máximo possível do extrato congelado batendo o frasco na tábua de madeira.Uma vez que todo o pó é removido do frasco, transfira rapidamente todos os extratos de pó em um tubo pré-rotulado de 15 mil mantidos em gelo seco. Embora seja melhor prosseguir com o descongelamento e o uso dos extratos imediatamente para minimizar a degradação da proteína, o liseto em pó congelado pode ser armazenado durante a noite a menos 80, se necessário. Descongele o pó lentamente em um chorume de gelo que é continuamente circulado usando uma barra de agitação magnética em um balde de gelo.Para facilitar até mesmo o descongelamento, remova o gelo que se desenvolve na parte externa dos tubos com frequência, cerca de cinco minutos ou mais. Uma vez que os extratos começam a descongelar no coquetel inibidor de protease 1X e 10 micromolars proteasome inibidor MG132 para evitar a degradação da proteína. Uma vez que as amostras estejam completamente descongeladas, o que pode levar mais de uma hora, gire as amostras a 3.220 G por 20 minutos a quatro graus Celsius.Este giro removerá a maioria dos detritos celulares do liseto. Quando o giro estiver completo, transfira o supernatante em garrafas de policarbonato que foram pré-refrigerados no gelo e descarte a pelota. Centrifugar o supernato e amostras a 16.000 G a quatro graus Celsius por 20 minutos para esclarecer o extrato.Após a rotação estar completa, recupere apenas o supernatante claro cuidadosamente do meio da coluna líquida sem perturbar a camada nublada que contém a peça em cima ou os detritos pelleted na parte inferior do tubo de centrífuga. Transfira o lise claro para um tubo fresco pré-refrigerado de 15 Mil. O líquido nublado restante pode ser recentementerifuado por cinco minutos na mesma velocidade para permitir a recuperação de um pouco mais do lysate atacado.Os extratos estão agora prontos para uso em experimentos, como purificação de complexos proteicos e imunoprecipitação. Comparamos dois métodos diferentes de lise celular de levedura, a moagem de contas de vidro a quatro Celsius e um método automatizado de moagem crio em menos 196 Celsius para avaliar as proteínas relativas recuperadas e extratos celulares preparados com ambos os métodos. A partir deste estudo, optamos por usar uma cepa de levedura brotante carregando uma cópia alta plasmid expressando uma ubiquitina marcada por HIS-MYC.Assim, podemos avaliar a afinidade de recuperação de proteínas polibiquitinadas marcadas de extratos por atacado, seguindo a purificação de afinidade usando talon cobalto HIS tag affinity beed seguido por manchas ocidentais com um anticorpo monoclonal HIS tag. Proteínas polibiquitinadas que normalmente são de curta duração devido à sua rápida degradação pelo maquinário proteasome de ubiquitina e, assim, oferecem uma maneira muito boa de comparar a qualidade dos extratos por atacado preparados por diferentes métodos. Como vemos pela metade direita da membrana manchada de Ponceau, recuperamos um maior rendimento total de proteína nos extratos por atacado preparados pelo protocolo da fábrica de congeladores crios, como julgado pela mais intensa mancha de Ponceau em toda a faixa de extrato por atacado.Isto é especialmente claro nas partes inferior e superior das faixas inteiras de extratos da fábrica de congeladores. Além disso, como mostrado pela metade direita da mancha ocidental his tag, observamos uma melhor recuperação da proteína ubiquitinada his-MYC, seguida por puxar para baixo usando contas talon dos extratos de atacado preparados pela moagem criogênica. Concluímos que a fábrica de congeladores criogênicos é superior a outros métodos para a preparação de extratos celulares, especialmente quando macromoléculas funcionais são necessárias para a aplicação a jusante.

preparation-cell-extracts-cryogrinding-an-automated-freezer

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Que vamos mostrar aqui como usar elétron cryotomography (ECT) para estudar a ultra-estrutura das células bacterianas em quase nativo estados, a "macromolecular" (~ 4 nm) resolução.

Electron Cryotomography de células bacterianas

Fonte: Wiegand, D. J., et al. Expressão de proteína livre de células usando a bactéria de crescimento rápido Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demonstra a preparação de um extrato celular de Vibrio natriegens, uma bactéria de crescimento rápido conhecida por sua alta taxa de síntese de proteínas. O pellet bacteriano é lavado e ressuspenso em tampão de lise antes da sonicação no gelo para evitar a degradação celular. O lisado é centrifugado para separar os detritos celulares...

Preparação de Extrato de Células Brutas de Vibrio natriegens

Aqui descrevemos protocolos para romper as células de mamíferos por moagem em estado sólido a uma temperatura criogénica, produzem um extracto celular a partir do pó de células resultante, e isolar complexos proteína de interesse por captura de afinidade sobre esferas paramagnéticas escala mícron acoplado com anticorpo.

Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

Este manuscrito descreve um método fácil de usar e criofixação de baixo custo para a visualização de células em suspensão por meio de microscopia electrónica de transmissão.

Congelamento Plunge: Uma ferramenta para os estudos ultra-estruturais e de imunolocalização de células em suspensão em Microscopia Eletrônica de Transmissão

É apresentado um instrumento e métodos para a preparação dos volumes de nanolitros de tamanho de amostra para microscopia eletrônica de transmissão. Sem papel-mancha passos são necessários, evitando assim as consequências prejudiciais que isso pode ter para proteínas, reduzindo a perda de amostra significativamente e permitindo a análise do lisado para proteômica visual única célula.

Preparação da amostra miniaturizada para microscopia eletrônica de transmissão

Um método criogênico de pulverização para processar patas de urina usando um moinho congelador de nitrogênio líquido foi desenvolvido para melhorar o rendimento e a qualidade do RNA ou proteína extraído dos tecidos e permitir a análise de perfis moleculares associados a inflamatórios Respostas.

Um protocolo de crio-pulverização para processar patas do rato para avaliar caminhos moleculares da inflamação do tecido em um modelo induzido da artrite do colágeno

Apresentado aqui é um protocolo para a cultura celular em membranas de nitreto de silício e congelamento de mergulho antes da imagem de fluorescência de raios-X com uma nanossonda de raios-X criogênico síncrotron. Quando apenas a temperatura ambiente nano-análise é fornecida, as amostras congeladas podem ser mais liofilizadas. Estes são passos críticos para obter informações sobre a composição elementar intracelular.

Cultura celular em membranas de nitreto de silício e criopreparação para a fluorescência de raios-X synchrotron Nano-análise

Este protocolo descreve o método crioAPEX, no qual uma proteína de membrana com etiqueta APEX2 pode ser localizada por microscopia eletrônica de transmissão dentro da ultraestrutura celular idealmente preservada.

O Método CrioAPEX para Análise de Microscopia Eletrônica da Localização da Proteína da Membrana dentro de células ultraestruturalmente preservadas

Apresentamos uma técnica para estabilizar rapidamente complexos translacionais (biossíntese de proteínas) com formaldeído interligando em leveduras vivas e células mamíferas. A abordagem permite dissecar intermediários transitórios e interações dinâmicas de RNA:protein. Os complexos interligados podem ser usados em vários aplicativos a jusante, como em métodos de perfil baseados em sequenciamento profundo, microscopia e espectrometria de massa.

Correção rápida in Vivo e isolamento de complexos translacionais de células eucarióticas

Aqui, apresentamos um pipeline para fresagem de feixe de íons com foco correlativo 3D na orientação da preparação de amostras celulares para tomografia crio-eletrônica. A posição 3D das proteínas fluorescentemente marcadas de interesse é primeiramente determinada por microscopia de criofluorescência e, em seguida, direcionada para moagem. O protocolo é adequado para células de mamíferos, leveduras e bactérias.

Preparação de amostras por fresagem de feixe de íons com foco correlativo 3D para tomografia crioeletrônica de alta resolução

Este método fornece um protocolo acessível e flexível para a preparação de grades de microscopia eletrônica (ME) para criotomografia celular in situ e microscopia correlativa de luz e eletrônica (CLEM).

Preparo de Amostras para Criotomografia In Situ de Células de Mamíferos

Aprenda a preparar extratos celulares de levedura por criomagem em moinho de congelador automatizado. Este método preserva a integridade proteica e melhora o rendimento de macromoléculas funcionais para estudos bioquímicos.

Preparação de extratos celulares por criogrinding em um moinho de congelador automatizado

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