Name: Preparação de extratos celulares por criogrinding em um moinho de congelador automatizado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min
Description: Aprenda a preparar extratos celulares de levedura por criomagem em moinho de congelador automatizado. Este método preserva a integridade proteica e melhora o rendimento de macromoléculas funcionais para estudos bioquímicos.

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A pesquisa no laboratório Gunjan é apoiada por financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde, Fundação Nacional de Ciência e do Departamento de Saúde da Flórida. Agradecemos ao estudante de graduação John Parker pela assistência técnica.

1. Preparação de Pipoca de Levedura
<ol><li>Cultivar células de levedura em 0,5 L de mídia YPD a uma densidade de 1 x 107 células/mL. Conte células usando um Contador Coulter ou qualquer outro meio.</li>
	<li>Centrífugas por 10 min a 2.400 g e 4 °C.</li>
	<li>Lave cada amostra uma vez com 500 mL de água desionizada de gelo 18 mega Ohm Milli-Q.</li>
	<li>Pelotas resuspend em 15 mL de tampão de lyse gelado [20 mM HEPES-KOH pH 7.5, 110 mM KCl, 0,1% Tween, 10% glicerol, com agente redutor recém-adicionado 10 mM β-mercaptoetanol, coquetel inibidor de protease, 10 μM inibidor proteasome MG-132, 1 mM inibidor de butilato de sódio e inibidores de fosfatose (1 mM vanadato de sódio, flúor de sódio de 50 mM, 50 mM de sódio β-glicerofosfato)]. Consulte a Tabela de Materiais para obter mais detalhes. Mantenha células resuspended no gelo até que as amostras estejam prontas para o próximo passo. NOTA: Uma grande variedade de tampões de lise contendo uma série de detergentes não iônicos pode ser usado com as amostras e inibidores específicos incluídos nele com base na aplicação a jusante. A inclusão de inibidores protease e proteassômicos são cruciais para prevenir a degradação proteica, especialmente quando os extratos são descongelados.</li>
	<li>Faça pipoca de levedura congelada snap adicionando lentamente a suspensão celular uma gota de cada vez usando uma pipeta sorológica pré-refrigerada em um ou mais tubos de centrífugas de 50 mL mantidos em gelo seco e preenchidos com LN2 até pouco abaixo da borda. Cubra o nitrogênio líquido no tubo com frequência para compensar sua perda devido à rápida evaporação. Trabalhe em uma área bem ventilada para evitar os perigos associados à asfixia por nitrogênio.<ol>
<li>Em vez de um tubo de 50 mL, use vários tubos de 50 mL amarrados (ou qualquer recipiente com uma boca grande, como uma grande garrafa de centrífuga plástica que pode tolerar temperaturas criogênicas) para preparação de milho pop(Figura 1A). Quanto maior o recipiente e sua abertura, mais fácil é a preparação da pipoca, pois isso evita o agrupamento da pipoca para formar grandes agregados. Uma faixa de tamanho de 0,3-0,5 cm para a pipoca é ideal para alcançar a moagem/pulverização adequada utilizando o moinho de congelador(Figura 1B).</li>
		<li>Certifique-se de que a LN2 tenha evaporado completamente dos tubos que contêm a pipoca antes de armazená-los a -80 °C. É possível parar depois de preparar a pipoca de levedura, pois elas estão estáveis por vários anos quando mantidas a -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61164/61164fig01.jpg"> Figura 1: Preparação de pipoca de levedura. (A) A "pipoca" de levedura é feita pelo congelamento da suspensão da célula na LN2. Usamos de um a três tubos de 50 mL mantidos juntos com um elástico e colocados em um balde de gelo cheio de gelo seco. Os tubos são preenchidos com LN2 até pouco abaixo de suas bordas e são cobertos com nitrogênio líquido frequentemente para mantê-los quase cheios até que toda a suspensão celular tenha sido feita em pipoca (B) O tamanho da pipoca é um importante determinante da eficiência ideal de moagem. A faixa de tamanho da pipoca deve ter entre 0,3 e 0,5 cm de diâmetro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61164/61164fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
2. Criogrinding
<ol><li>Para começar, certifique-se de que háLN 2 suficiente disponível para esfriar o moinho de congelador, moendo frascos, suprimentos e para operar a máquina para todas as amostras. Para menos de cinco amostras, 30-35 L de LN2 devem ser suficientes. Encha a câmara do moinho de congelador com LN2 até a linha de enchimento. ATENÇÃO: Todas as etapas que envolvam a LN2 devem ser realizadas em uma área bem ventilada e a própria fábrica de congeladores deve ser localizada em tal área para evitar risco de asfixia. Use equipamentos de proteção pessoal, incluindo calçados adequados, jaleco, óculos de segurança, uma camada base de luvas de nitrito, depois luvas térmicas, seguido por outro par de luvas de nitrito. Tenha extrema cautela ao manusear ln2.</li>
	<li>Feche a tampa do moinho de congelador lentamente, evitando o respingo de LN2 e deixe alguns minutos para a máquina esfriar. Pode ser necessário reabastecer a câmara com LN2 para compensar a perda devido à evaporação antes de prosseguir para a próxima etapa. NOTA: Refil LN2 conforme necessário apenas até a linha de enchimento. Não enchimento demais da câmara, pois isso pode ser perigoso e prejudicial para a máquina. Sistemas automatizados de recarga estão disponíveis para o moinho de congelador que pode reabastecer o LN2 evaporando conforme necessário diretamente de um tanque de armazenamento conectado ao moinho de congelador.</li>
	<li>Pré-arrefecimento os grandes frascos de moagem e a barra de impacto magnético, mergulhando-os na LN2 mantidos em uma pequena guerra separada. Decante toda a LN2 quando a LN2 parar de borbulhar. Em seguida, adicione a pipoca de amostra/levedura ao frasco de moagem e sele-a firmemente com os dois plugues de extremidade de aço inoxidável.<ol>
<li>Não encha mais de um terço do frasco de moagem com a amostra, pois isso pode reduzir a eficiência da moagem. Em vez disso, amostras maiores podem ser processadas dividindo-as em dois ou mais frascos e moendo-os sequencialmente. Frascos de moagem menores podem ser usados para amostras menores (até 3 mL).</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque o frasco de moagem na câmara do moinho de congelador e bloqueie-o no lugar. Feche a tampa.</li>
	<li>Para a levedura brotante, triture as amostras para um total de três ciclos por 2 min/ciclo (com 2 minutos de quebra para resfriamento entre ciclos) a uma taxa de esmagamento de 14. Quando a máquina parar após completar os ciclos, abra a tampa do moinho de congelador lentamente e desbloqueie cuidadosamente o frasco com o lise celular congelado em pó e remova-o do moinho de congelador. Se vários frascos pequenos forem usados, trabalhe rapidamente para remover um frasco de cada vez e coloque-os em gelo seco. NOTA: Geralmente não há necessidade de ajustar os parâmetros de moagem ao usar frascos de diferentes tamanhos com o mesmo tipo de amostra. No entanto, os parâmetros de moagem, como o número de ciclos e a taxa de moagem, precisam ser empiricamente determinados para diferentes tipos de amostra, dependendo da facilidade com que eles lise. A maioria das células de mamíferos e tecidos moles seliseão em ciclos de 1 a 2 a uma taxa de esmagamento de 10. Amostras mais difíceis delise, como bactérias, leveduras, larvas de mosca e moscas adultas, requerem 3-6 ciclos na taxa máxima, enquanto tecidos duros como osso, dentes, etc. podem exigir até 10 ciclos. Uma pequena alíquota da amostra descongelada pode ser vista sob o microscópio antes e depois da moagem para contar o número de células intactas e não tortos para determinar a eficiência da lise. Uma excelente análise do impacto dos parâmetros criogrinding na liberação de proteínas e DNA da levedura brotante foi publicada anteriormente15.</li>
	<li>Trabalhando rapidamente para não permitir que a amostra descongele, desaparafusar cuidadosamente uma das peças finais (escolha a que parece ter ficado um pouco solta durante a moagem) usando a ferramenta de abertura. Em seguida, use um par de fórceps longos (que são pré-refrigerados em um balde com gelo seco) para remover a barra impactor. Colete a amostra pulverizada invertendo e tocando o frasco de moagem em um prato de pesagem de poliestireno pré-refrigerado com LN2 e mantido em gelo seco.</li>
	<li>Uma vez que todo o lysato de células congeladas em pó tenha sido recuperado do frasco de moagem, despeje o lysate em pó do prato de pesagem de volta para o tubo de 50 mL e proceda imediatamente para o passo de descongelamento lento descrito em seguida para melhores resultados. Alternativamente, armazene o lise em pó congelado durante a noite a -80 °C, embora isso possa resultar em alguma degradação.</li>
	<li>Prepare um balde de gelo com 50% de água e coloque-o em uma placa de agitação com um agitador magnético. Submerse um rack de arame ou outro rack adequado no chorume de gelo para segurar as amostras.<ol>
<li>Em seguida, descongele lentamente as amostras em um banho de chorume de gelo com agitação constante do chorume usando um agitador magnético. Adicione mais gelo para substituir o gelo derretido (algumas águas podem precisar ser descartadas para evitar que o balde de gelo transborde). Uma vez que vários inibidores têm meia vida curta em tampões aquosos, adicione coquetel inibidor adicional de protease (ver Tabela de Materiais) e 10 μM inibidor proteasome MG-132 ao lisato assim que as amostras começarem a descongelar (após aproximadamente 30 min).</li>
		<li>Remova o gelo formado na parte externa dos tubos a cada 5 minutos para acelerar o processo de descongelamento. Note que o descongelamento rápido das amostras à temperatura ambiente ou mais alta pode levar a uma degradação significativa.</li>
	</ol></li>
	<li>Depois que as amostras tiverem descongelado completamente (pode levar mais de uma hora dependendo da quantidade de amostra), centrifugar o lysate a ~3.220 g por 20 min em uma centrífuga de mesa refrigerada a 4 °C para remover a maior parte dos detritos celulares do liseto.</li>
	<li>Transfira o supernatante para tubos de centrífugas de policarbonato de 50 mL que foram pré-refrigerados no gelo e centrífuga as amostras a 16.000 g por 20 minutos a 4 °C (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Transfira apenas o supernanato claro consistindo do extrato celular inteiro esclarecido do centro da coluna líquida no tubo de forma muito lenta e cuidadosa, sem perturbar a camada lipídica nublada(Figura 2),em um tubo refrigerado de 15 mL usando pipetas sorológicas pré-refrigeradas. Evite remover todo o lise no tubo de centrífuga para evitar a transferência de lipídios e detritos. O cano de sobra no tubo centrífuga pode ser centrifuuado várias vezes para recuperar pequenas quantidades de extrato após cada giro. NOTA: Lipídios, juntamente com quaisquer proteínas desnaturadas, parecem nublados/leitosos e estão localizados no topo da interface líquido/ar, e ocasionalmente acima da própria pelota que consiste em detritos celulares insolúveis(Figura 2).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61164/61164fig02.jpg"> Figura 2: Extrair camadas em um tubo de centrífuga. As principais características visíveis de todo o extrato celular em um tubo após centrifugação a 16.000 g por 20 min são indicadas. A abundância relativa de cada característica depende do tipo de amostra, da fase de crescimento das células (exponencial versus estacionária), da quantidade de tampão de lise usada para resuspend células e da eficiência da lise. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61164/61164fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="12"><li>Centrifugar qualquer lise restante por 5 minutos para recuperar mais do extrato. Repita esta centrifugação de 5 minutos várias vezes se necessário para recuperar o máximo possível do extrato claro. Descarte o lise nublado contendo lipídios perto da parte inferior do tubo perto da pelota.</li>
	<li>Use esses extratos para aplicações a jusante, como purificação complexa de proteínas, imunoprecipitação e análise proteômica.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Uma limitação de estudar proteínas nativas a partir de levedura é a lise ineficiente das células de levedura devido à sua parede celular resistente. Embora vários métodos tenham sido desenvolvidos, o método mais consistente e eficiente em nossas mãos é o criogrinding de células de leveduras flash congelado como pipoca. Este método permite a preparação confiável de extratos celulares inteiros de alta qualidade de levedura brotante em comparação com outros métodos de lise. Os resultados representativos demonstraram que a c...

A levedura é um organismo modelo popular para estudos de proteínas, pois é um simples organismo eucariótico com abundância de ferramentas genéticas e bioquímicas disponíveis para pesquisadores1. Por causa de sua parede celular resistente, um desafio que os pesquisadores enfrentam é desaformar as células sem danificar o conteúdo celular. Diferentes métodos estão disponíveis para a obtenção de extratos proteicos através da interrupção de células de levedura que incluem lise enzimática (zymolyase)2,3, lise química4, lise física por congelamento5,à base de pressão (imprensa francesa)6,7, mecânica (contas de vidro, moedor de café)8,9, baseado em sônicação10 e criogênico2,11. A eficiência da lise celular e o rendimento da proteína podem variar consideravelmente dependendo da técnica empregada, afetando assim o resultado final ou a adequação para a aplicação a jusante desejada para o lise. Ao estudar proteínas instáveis, ter modificações pós-transacionais fugazes ou sensíveis à temperatura, é particularmente importante usar um método que minimize a perda ou a degradação da amostra durante a preparação.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Técnica de preparação de extrato</td>
			<td>Detalhes</td>
			<td>Vantagens</td>
			<td>Desvantagens</td>
			<td>Análise a jusante</td>
			<td>Referência</td>
		</tr><tr><td>Imprensa francesa: Homogeneizador de alta pressão (também conhecido como Microfluidizer) com pré-tratamento enzimático usando Zymolyase</td>
			<td>Zymolyase-20T, um homogeneizador de alta pressão microfluidizador. O disruptor consiste em uma bomba de alta pressão acionada a ar (razão 1:250; pressão de ar necessária 0,6-l MPa) e uma câmara de interrupção especial com uma unidade de pressão traseira adicional. É necessário um tamanho amostral mínimo de 20 mL para o processamento.</td>
			<td>A interrupção total final obtida usando o protocolo combinado aproximou-se de 100 % com 4 passes a uma pressão de 95 MPa, em comparação com apenas 32 % de interrupção com 4 passes a 95 MPa usando apenas homogeneização sem o Zymolyase.</td>
			<td>Não é apropriado para aplicações em pequena escala. As enzimas podem ficar caras para preparações em grande escala.</td>
			<td>Purificação de proteínas</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>Batedor de contas: células tratadas com zymolyase com contas de vidro em um instrumento fastprep</td>
			<td>Aproximadamente um volume igual de contas de vidro frias, secas e lavadas com ácido é adicionado a um determinado volume de pelotas de célula no tampão de lise e as células são interrompidas por uma agitação manual vigorosa.</td>
			<td>É particularmente útil ao fazer extratos de muitas culturas de leveduras pequenas diferentes para fins de ensaio, em vez de para purificação de proteínas.</td>
			<td>Durante o procedimento das contas de vidro, as proteínas são tratadas severamente causando espuma extensiva levando à desnaturação proteica. A quantidade de quebra celular varia, enquanto a proteólise, bem como a modificação das proteínas podem resultar do aquecimento do extrato acima de 4°C durante a quebra mecânica.</td>
			<td>Principalmente análises de DNA e RNA, mas também análises de proteínas por eletrofiorese de gel desnaturing, com ou sem manchas ocidentais.</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>Tratamento zymolyase seguido de lise usando uma combinação de choque osmótico e homogeneização do Dounce</td>
			<td>Após a digestão enzimática das paredes celulares, os esferoplastos são líssedos com 15 a 20 traçados de um pilão apertado (folga de 1 a 3 μm) em um homogeneizador do Dounce.</td>
			<td>Vantajoso para o uso de cepas deficientes protease, como BJ926 ou EJ101. Esta é a maneira mais suave de quebrar células de levedura e, portanto, é mais adequada para o preparo de extratos que podem realizar funções enzimáticas complexas (por exemplo, tradução, transcrição, replicação de DNA) e em que a integridade das estruturas macromoleculares (por exemplo, ribossomos, emendas) deve ser mantida. Também é útil para isolar núcleos intactos que podem ser usados para estudos de cromatina (Bloom and Carbon, 1982) ou para extratos de proteína nuclear (Lue e Kornberg, 1987).</td>
			<td>As principais desvantagens do procedimento de lise esferoplastia são que ele é relativamente tedioso e caro, especialmente para preparações em larga escala (>10 litros), e os longos períodos de incubação podem levar à proteólise ou modificação de proteínas.  Para as preparações de cromatina, elas parecem ser de qualidade variada ou inferior às produzidas pela centrifugação diferencial (baseada na integridade da escada nucleossomo).</td>
			<td>Isolando núcleos intactos para estudos de cromatina, extratos que podem realizar funções enzimáticas complexas, extratos que requerem a integridade de estruturas macromoleculares, extratos de proteínanuclear.</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Interrupção celular de células congeladas flash moendo em nitrogênio líquido usando uma argamassa/pilão ou um liquidificador</td>
			<td>As células são congeladas imediatamente em nitrogênio líquido e depois líricas moendo manualmente em uma argamassa usando um pilão, ou usando um liquidificador Waring na presença de nitrogênio líquido.</td>
			<td>O protocolo é rápido e fácil. Pode acomodar quantidades variadas de células de levedura, incluindo culturas muito grandes. Sua principal vantagem é que as células são imediatamente retiradas do estado de crescimento ativo em nitrogênio líquido (−196°C), diminuindo as atividades de enzimas degradativas, como proteases e nucleases, bem como atividades que modificam proteínas (por exemplo, fosfates e quinases). É particularmente adequado para fazer extratos de células inteiras a partir de uma única cultura de levedura para purificação de proteínas em larga escala.</td>
			<td>Um pouco confuso e potencialmente perigoso para o investigador descuidado. Pequenas amostras (ou seja, culturas de levedura de 10 a 100 ml) não são facilmente processadas porque não há massa suficiente de aglomerados de células congeladas para fraturar efetivamente no liquidificador. É demorado processar amostras individuais e limpar o equipamento entre os usos.</td>
			<td>Extratos de células inteiras de uma única cultura de levedura para purificação de proteínas em larga escala.</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Autolise, fábrica de contas</td>
			<td>pH 5.0, 50 °C, 24 h, 200 rpm / Ø 0,5 mm, 5 × 3 min/3 min</td>
			<td>Lise rápida e eficiente, especialmente para preparação de extratos em pequena escala</td>
			<td>A geração de calor leva à desnaturação e degradação das macromoléculas. Equipamento de espancamento de contas necessário.</td>
			<td>Análises em pequena escala.</td>
			<td rowspan="2">10</td>
		</tr><tr><td>Autolise, Sonicação</td>
			<td>pH 5.0, 50 °C, 24 h, 200 rpm, 4 × 5 min/2 min, pulser 80%, potência 80%</td>
			<td>Os equipamentos de sonicação geralmente estão disponíveis na maioria das instituições.</td>
			<td>A geração de calor leva à desnaturação e degradação das macromoléculas. Equipamento de sonicação necessário. A lise lenta pode levar mais de 24 horas.</td>
			<td>Preparações da parede celular de levedura.</td>
		</tr><tr><td>Processo de ebulição e congelamento</td>
			<td>Nenhum equipamento especializado é necessário além de um freezer padrão e um bloco de aquecimento ou banho de água quente.</td>
			<td>Eficiente, reprodutível, simples e barato.</td>
			<td>A geração de calor leva à desnaturação e degradação das macromoléculas.</td>
			<td>Análises de DNA por PCR.</td>
			<td>5</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Comparação dos métodos disponíveis para a preparação de extratos de levedura.
A criogrinding (também conhecida como moagem criogênica/moagem criogênica) é comumente empregada para recuperar ácidos nucleicos, proteínas ou produtos químicos de amostras sensíveis à temperatura de forma confiável para análises quantitativas ou qualitativas. Tem sido usado com sucesso para múltiplas aplicações em diversas áreas, incluindo biotecnologia, toxicologia, ciência forense12,13, ciência ambiental, biologia vegetal14 e ciência de alimentos. O isolamento de macromoléculas biológicas intactas é geralmente criticamente dependente da temperatura. Temperaturas extremamente baixas garantem que as proteases e núcleos permaneçam inativos, resultando em um isolamento confiável de proteínas intactas, ácidos nucleicos e outras macromoléculas para análises subsequentes. De fato, um moinho de congelador normalmente mantém uma temperatura amostral de -196 °C (o ponto de ebulição da LN2), minimizando assim o DNA/RNA ou desnaturação e degradação de proteínas.
A fábrica de congeladores emprega uma câmara de moagem eletromagnética que move rapidamente uma barra de metal sólido ou cilindro para frente e para trás dentro de um frasco contendo a amostra a ser pulverizada entre plugues finais de aço inoxidável. O instrumento cria e rapidamente inverte um campo magnético dentro da câmara de moagem. À medida que o campo magnético muda para frente e para trás, o ímã esmaga a amostra contra os plugues, alcançando assim o "criogrinding" e a pulverização da pipoca. A fábrica de congeladores substitui a argamassa e o pilão e permite o processamento sequencial de várias amostras (ou até 4 amostras menores simultaneamente) com alta reprodutibilidade e evita a variabilidade usuário-usuário associada à moagem manual. Uma vez que as amostras são processadas, os extratos celulares podem ser usados para uma variedade de aplicações a jusante.

<table><tbody><tr><td>Tubos de policarbonato de 50 mL com tampas de rosca</td><td>Beckman</td><td>357002</td><td>Tubos de centrífuga</td></tr><tr><td>BD Bacto Peptona</td><td>BD Biosiences</td><td>211677</td><td>Levedura YPD componente de mídia</td></tr><tr><td>BD Extrato de levedura</td><td>Bacto BD Biosiences</td><td>212750</td><td>Levedura YPD componente de mídia</td></tr><tr><td>Centrífuga Beckman Avanti</td><td>Beckman</td><td>B38624</td><td>Centrífuga de alta velocidade</td></tr><tr><td>Beckman JLA-9.1000</td><td>Beckman</td><td>366754</td><td>Rotor</td></tr><tr><td>D-(+)-Dextrose Anidro</td><td>MP Biomedicals</td><td>901521</td><td>Levedura YPD componente de mídia</td></tr><tr><td>Eppendorf A-4-44</td><td>Eppendorf</td><td>22637461</td><td>Rotor de caçamba oscilante</td></tr><tr><td>Eppendorf centrífuga refrigerada 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>22625101</td><td>Centrífuga refrigerada</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G5150-1GA</td><td>Excludente de volume e crioprotetor</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>FisherBiotech</td><td>BP310-100</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>HIS6 anticorpo</td><td>Novagen</td><td>70796</td><td>Anticorpo para etiqueta HIS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9541-1KG</td><td>Sal para manter a força iônica</td></tr><tr><td>MG-132</td><td>CALBIOCHEM</td><td>474790</td><td>Inibidor de proteassoma</td></tr><tr><td>Coquetel de inibidor de fosfatase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32957</td><td>Coquetel de inibidor de fosfatase</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>SIGMA</td><td>P7170-1L</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel de inibidor de protease</td> de mancha de proteína <td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32963</td><td>Coquetel de inibidor de protease</td></tr><tr><td>Rotor JLA 25.500</td><td>Beckman</td><td>JLA 25.500</td><td>Rotor</td></tr><tr><td>Butirato de sódio</td><td>EM Science</td><td>BX2165-1</td><td>Inibidor de histona desacetilase</td></tr><tr><td>Fluoreto de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6521</td><td>Inibidor de Fosfatase</td></tr><tr><td>Vanadato de Sódio</td><td>MP Biomedicals</td><td>159664</td><td>Inibidor de Fosfatase</td></tr><tr><td>Beta;-glicerofosfato de Sódio Alfa</td><td>Aesar</td><td>13408-09-8</td><td>Inibidor de Fosfatase</td></tr><tr><td>Spex Certiprep 6850 moinho congelador</td><td>SPEX Sample Prep</td><td>6850</td><td>Moinho Congelador</td></tr><tr><td>TALON Metal Affinity Resina</td><td>BD Biosiences</td><td>635502</td><td>Para puxar para baixo as proteínas marcadas com HIS</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>VWR International</td><td>VW1521-07</td><td>Detergente não iônico</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>AMRESCO</td><td>M131-250ML</td><td>Agente redutor</td></tr></tbody></table>

preparação de extratos celulares por criogrinding em um moinho de congelador automatizado

Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill

A facilidade da manipulação genética e a forte conservação evolutiva das máquinas celulares eucarióticas na levedura saccharomyces cerevisiae tornou-a um organismo modelo genético preeminente. No entanto, uma vez que o isolamento eficiente da proteína depende da interrupção ideal das células, o uso de levedura para análise bioquímica de proteínas celulares é dificultado por sua parede celular que é cara para digerir enzimaticamente (usando lyticase ou zymolyase), e difícil de interromper mecanicamente (usando um batedor de contas tradicional, uma prensa francesa ou um moedor de café) sem causar aquecimento de amostras, o que por sua vez causa denaturação e degradação de proteínas. Embora a moagem manual de células de levedura sob nitrogênio líquido (LN2) usando uma argamassa e pilão evite o superaquecimento das amostras, é trabalhosa intensiva e sujeita à variabilidade na lise celular entre os operadores. Por muitos anos, temos preparado com sucesso extratos de levedura de alta qualidade usando criogrinding de células em uma fábrica de congelador automatizada. A temperatura de -196 °C alcançada com o uso da LN2 protege o material biológico da degradação por proteases e núcleos, permitindo a recuperação de proteínas intactas, ácidos nucleicos e outras macromoléculas. Aqui descrevemos esta técnica em detalhes para células de levedura brotante que envolve primeiro o congelamento de uma suspensão de células em um tampão de lise através de sua adição dropwise em LN2 para gerar gotículas congeladas de células conhecidas como "pipoca". Esta pipoca é então pulverizada sob LN2 em um moinho de congelador para gerar um extrato congelado "em pó" que é descongelado lentamente e esclarecido por centrifugação para remover detritos insolúveis. Os extratos resultantes estão prontos para aplicações a jusante, como purificação de proteínas ou ácidos nucleicos, análises proteômicas ou estudos de co-imunoprecipitação. Esta técnica é amplamente aplicável para a preparação de extratos celulares de uma variedade de microrganismos, tecidos vegetais e animais, espécimes marinhos, incluindo corais, bem como isolar DNA/RNA de espécimes fósseis forenses e permafrost.

Comparamos dois métodos diferentes para a lise celular de levedura, a moagem de contas de vidro a 4 °C e um método automatizado de criogrinding a -196 °C, para avaliar as proteínas de recuperação relativa nos extratos celulares preparados com ambos os métodos. Para este estudo, optou-se por usar uma levedura brotante YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2::ura3 ubi3 -Δub-2 ubi4-Δ2::LEU2 [pUB39] [pUB221])16 carregando...

Descrevemos um método confiável para a preparação de extratos celulares inteiros de leveduras ou outras células usando uma fábrica de congelador criogênico que minimiza a degradação e a desnaturação de proteínas. Os extratos celulares são adequados para purificação de complexos proteicos funcionais, análises proteômicas, estudos de co-imunoprecipitação e detecção de modificações de proteína labile.

Preparação de extratos celulares por criogrinding em um moinho de congelador automatizado

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ...

A levedura é um organismo modelo popular, não apenas para estudos genéticos, mas também para estudos bioquímicos de proteínas e outras macromoléculas extraídas do tipo selvagem e cepas de leveduras mutantes. No entanto, devido às suas paredes celulares resistentes, um grande desafio que os pesquisadores enfrentam é essa lise eficiente das células de levedura sem danificar o conteúdo celular. O isolamento de macromoléculas biológicas intactas é geralmente crítico, dependente da temperatura.A preparação dos extratos em baixa temperatura garante que as proteases e núcleos intracelulares permaneçam inativos, resultando em isolamento confiável de proteínas intactas, ácidos nucleicos e outras macromoléculas para lise suficiente. Vários métodos estão disponíveis para a obtenção de extratos de levedura através de enzimática, química e lise física. No entanto, a lise enzimática é cara devido à exigência de enzimas purificadas para digerir a parede celular, limitando assim o uso de menor número de células.Além disso, as reações enzimáticas devem ser monitoradas de perto para evitar a digestão excessiva e a lise prematura das células. Métodos químicos utilizando agentes de desnaturação fortes

preparation-cell-extracts-cryogrinding-an-automated-freezer

Research

JoVE Journal

Biology

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