Isolando Tecidos do Sistema Nervoso Central e Meninges Associadas para Análise a Jusante de Células Imunes

O isolamento rápido dos tecidos do SNC, incluindo as meninges, permite uma análise abrangente do fenótipo, função e localização das células imunes em condições homeostáticas e patogênicas. Os dois métodos demonstrados permitem a extração rápida de tecidos do SNC com as meninges, ideal para análise a jusante usando técnicas de célula única e métodos histológicos. Embora os resultados representativos se concentrem na análise de células imunes, esses dois métodos podem ser usados para analisar células residentes no SNC, incluindo microglia, astrócitos, pericitos, células endoteliais, células estromais e neurônios.

Comece isolando amostras de cérebro e medula espinhal de camundongos sacrificados. Depois de remover a cabeça, faça uma incisão na linha média da pele e vire-a sobre os olhos para liberar o crânio. Corte no osso nasal para liberar a mandíbula do crânio.

Em seguida, remova a mandíbula, a língua e os olhos. Corte ao longo dos aspectos laterais do crânio para liberar o tecido ao longo do conduto auditivo externo e corte-o. Para coletar a amostra da medula espinhal, separe a caixa torácica da coluna vertebral cortando paralelamente à coluna com uma tesoura afiada.

Faça um pequeno corte na região lombar inferior para isolar a coluna vertebral e, em seguida, apare e remova qualquer músculo restante ao longo da coluna para expor as vértebras. Ao realizar a descalcificação, verifique o osso diariamente para determinar se ele é macio e flexível. Remova o tecido da solução de EDTA com uma pinça, coloque-o em uma placa de Petri e teste suavemente a maciez óssea com uma agulha de calibre 25.

Se a agulha penetrar facilmente no osso, o processo de descalcificação estará completo. Para extrair a calota craniana no cérebro, faça uma incisão na linha média na pele e vire a pele sobre os olhos. Coloque a tesoura dentro do forame magna e comece a cortar o crânio lateralmente ao longo das córtices em direção ao bulbo olfatório, mantendo as incisões acima do conduto auditivo externo e da mandíbula.

Faça os mesmos cortes no lado oposto com os cortes que se encontram no bulbo olfatório para liberar a calota craniana do cérebro. Usando uma pinça, retire a calota craniana e coloque-a em um tubo cônico de 15 mililitros contendo cinco mililitros de meio RPMI frio suplementado com HEPES 25 milimolares. Coloque uma pinça curva abaixo da base do cérebro e levante-a para libertar o cérebro da calota craniana.

Extraia a coluna vertebral e o tecido da medula espinhal cortando paralelamente à coluna para separar a caixa torácica da coluna vertebral. Em seguida, faça um pequeno corte na região lombar inferior para isolar a coluna das vértebras. Apare e remova qualquer músculo restante ao longo da coluna para expor as vértebras.

Em seguida, coloque a tesoura cirúrgica extra fina dentro da coluna vertebral e corte ao longo da borda lateral da coluna. Corte a borda lateral oposta completamente para dividir a coluna vertebral em uma porção anterior e posterior. Use uma pinça para retirar a medula espinhal lenta e cuidadosamente da coluna vertebral e coloque-a em um tubo cônico de 15 mililitros contendo cinco mililitros de RPMI frio com HEPES de 25 milimolares.

Em seguida, transfira as porções anterior e posterior da coluna vertebral para outro tubo. Para remover as meninges da calota craniana, retire a calota craniana do meio RPMI e use uma pinça afiada para marcar ao redor da borda externa. Descasque as meninges da borda da calota craniana, raspando para remover as meninges durais e aracnóides e coloque as meninges em uma placa de Petri.

Para remover as meninges da coluna vertebral, retire a coluna do meio e marque ao redor das bordas da coluna vertebral com uma pinça afiada para liberar as meninges. Use uma pinça curva para retirar as meninges da borda das vértebras e coloque-as em uma placa de Petri. Coloque um filtro de malha de náilon em um tubo cônico de 50 mililitros.

Para criar uma suspensão celular, mova as meninges para uma peneira e adicione três mililitros de RPMI suplementado com HEPES e, em seguida, use um êmbolo de uma seringa de cinco mililitros para moer o tecido e o meio através da peneira. Despeje o tecido do cérebro ou da medula espinhal com a mídia em uma placa de Petri de 100 milímetros e use uma pinça para mover o tecido para o fundo. Pique o tecido cerebral com uma lâmina de barbear estéril e junte o tecido na parte inferior da placa.

Adicione três mililitros de RPMI suplementado com 10% FCS à placa de Petri e, em seguida, use uma pipeta sorológica de 10 mililitros para ressuspender o tecido no meio e transferi-lo para um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione colagenase tipo 1 e DNase 1 ao tecido e incube os tubos em banho-maria a 37 graus Celsius por 40 minutos. Inverta os tubos a cada 15 minutos para misturar completamente o tecido com as enzimas.

Após a incubação, adicione EDTA a cada tubo para uma concentração final de 0,01 molar e incube os tubos por mais cinco minutos para inativar a colagenase. Adicione nove mililitros de RPMI suplementado com 10% FCS a cada tubo e, em seguida, centrifugue os tubos a 450 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Use uma pipeta Pasteur com vácuo para aspirar o sobrenadante, tomando cuidado para não tocar no pellet celular.

Adicione três mililitros de solução de gradiente de densidade isotônica 100% ao pellet celular e, em seguida, adicione mídia RPMI 10% FCS adicional para trazer o volume final para 10 mililitros e ressuspender o pellet celular. Inverter e misturar bem o tubo, depois inserir uma pipeta serológica com um mililitro de solução de gradiente de densidade isotónica a 70% no fundo do tubo. Espalhe lentamente a solução, tomando cuidado para não formar bolhas.

Retirar a pipeta serológica do tubo, tomando o cuidado de não perturbar o gradiente. Centrifugue o tubo a 800 G por 30 minutos a quatro graus Celsius e, em seguida, aspire o sobrenadante, incluindo a camada de detritos de mielina, até que restem dois a três mililitros no tubo. Use uma pipeta de um mililitro para colher a camada de células entre o gradiente de densidade de 30% e 70% e transfira-a para um novo tubo de 15 mililitros.

Adicione o meio RPMI 10%FCS para trazer o volume final para 15 mililitros e, em seguida, centrifugue as células a 450 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Este protocolo foi usado para avaliar as células B e T nas meninges, cérebro e medula espinhal durante a esclerose múltipla progressiva. O bloqueio foi conduzido para distinguir células imunes infiltrantes derivadas perifericamente CD45 de neurônios, astrócitos e oligodendrócitos CD45 CD45 negativos

Poucas células CD45 altas estavam presentes na medula espinhal e no tecido cerebral de camundongos tratados com simulação. O mesmo ponto de corte para alta expressão de CD45 foi usado nas meninges para identificar células imunes CD45 altas e excluir células não imunes. Em todos os tecidos do SNC TMEV-IDD, foram observadas porcentagens aumentadas de células imunes CD45 altas em comparação com camundongos tratados com simulação.

Durante a TMEV-IDD crônica, a porcentagem de células B entre as células imunes CD45 altas no cérebro e na medula espinhal foi maior em comparação com o compartimento meníngeo. Cérebros e medulas espinhais descalcificados foram fotografados para identificar a localização de células B e T dentro do compartimento do SNC. A extração convencional do cérebro da calota craniana resultou em uma camada de pia intacta, mas as camadas meníngeas restantes foram excluídas.

Tanto no cérebro descalcificado quanto na medula espinhal, todas as camadas meníngeas estavam intactas. As células B e as células T comutadas por isotipo foram localizadas com expressão de IgG e CD3, respectivamente. A coloração de IgG com ER-TR7 revelou que as células B estavam presentes no parênquima do SNC e nas meninges, enquanto os agregados celulares dentro das meninges positivas para ER-TR7 continham várias células B positivas para IgG e células T CD3 positivas.

Uma etapa crítica nesses protocolos é a extração cuidadosa dos tecidos do SNC, essencial para melhorar a pureza das suspensões unicelulares e para obter tecido histológico com morfologia de alta qualidade. As técnicas descritas permitem a análise abrangente das células que ocupam o compartimento do SNC, ideal para examinar o fenótipo, a função e a localização celular sob homeostase e durante a patogênese da doença.