Name: In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprenda a eletroporação in utero para manipulação genética em progenitores neurais do neocórtex de furões. Este método permite estudar a expansão e dobra do neocórtex em desenvolvimento com alta especificidade espacial e temporal.

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Somos gratos aos Serviços e Instalações do Instituto Max Planck de Biologia Celular Molecular e Genética pelo excelente apoio prestado, notadamente toda a equipe dos serviços biomédicos (BMS) pela excelente criação de furões e J. Peychl e sua equipe da Instalação de Microscopia Leve. Somos particularmente gratos a Katrin Reppe e Anna Pfeffer da BMS por apoio veterinário excepcional e Lei Xing do grupo Huttner por ajudar em cirurgias de furões.

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com a Legislação Alemã de Bem-Estar Animal após aprovação da Landesdirektion Sachsen (licenças TVV 2/2015 e TVV 21/2017).
1. Preparação para eletroporação uterativa
<ol><li>Prepare a mistura de DNA. Neste protocolo é utilizada uma concentração final de 1 μg/μL de pGFP. Dissolva o DNA em PBS e complemente com 0,1% Fast Green para facilitar a visualização. Uma vez preparado, misture a mistura de DNA por pipetting para cima e para baixo várias vezes ou por toques de dedos. Armazene em temperatura ambiente até usar. NOTA: Para coeletrões, a mistura de DNA é preparada para conter uma concentração final de 1 μg/μL de codificação plasmida de um gene de interesse juntamente com 0,5 μg/μL de pGFP diluído em PBS.</li>
	<li>Prepare a mesa de cirurgia com todas as ferramentas e instrumentos necessários.</li>
	<li>Puxe capilares de vidro usando o puxador de micropipette. Ajuste o diâmetro da ponta capilar cortando a parte distal do capilar usando fórceps como descrito anteriormente41.</li>
</ol>2. Preparação de furões para cirurgia
<ol><li>Mantenha as jills grávidas com embriões no E33 em jejum por pelo menos 3h antes da cirurgia para reduzir o risco de vômito.</li>
	<li>Antes da cirurgia, esterilize todas as ferramentas autoclavando. Realizar a cirurgia em uma sala especialmente designada em condições assépticas para eliminar possíveis fontes de contaminação.</li>
	<li>Coloque a jill grávida na caixa de narcose com 4% de isoflurane.</li>
	<li>Quando anestesiado, coloque o furão sobre a mesa de operação com uma almofada de calor e conecte a máscara de narcose com um fluxo constante de 2 a 3% de isoflurane no nariz. Para garantir o nível adequado de anestesia, verifique se há falta dos seguintes reflexos:<ol>
<li>O reflexo palpebral tocando a pele periocular</li>
		<li>O reflexo flexor beliscando a pele entre o2º e o 3º,ou3º e4º dedo dos dois membros traseiros</li>
		<li>Se o reflexo palpebral estiver ausente e o reflexo flexor for claramente reduzido, verifique se o reflexo da dor belisca um dedo do pé de cada membro traseiro. NOTA: Certifique-se de ter um estetoscópio à mão para monitorar a frequência cardíaca e o ritmo, se necessário.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injete o furão subcutâneamente com analgésico (0,1 mL de metamizol, 50 mg/kg de peso corporal), antibiótico (0,1 mL/kg de peso corporal de 20 mg/kg de amoxicilina + ácido clavulanic) e glicose (10 mL de solução de glicose de 5%).</li>
	<li>Coloque uma solução de pomada nos olhos para evitar a desidratação dos olhos durante o procedimento cirúrgico.</li>
	<li>Raspe a barriga do furão usando uma máquina de barbear.</li>
	<li>Limpe a pele com água e sabão, desinfete a barriga com 70% de esfoliante de etanol, desinfete 2x com iodo e deixe secar.</li>
</ol>3. Na eletroporação uterópica de furões
<ol><li>Certifique-se de que a área cirúrgica é estéril: coloque ferramentas cirúrgicas estéreis em tecidos estéreis e troque de casaco e luvas.</li>
	<li>Coloque uma cortina cirúrgica estéril no animal.</li>
	<li>Usando um bisturi, abra cirurgicamente a barriga na linea alba com um corte de ~5 cm de comprimento.</li>
	<li>Corte a camada muscular usando uma tesoura.</li>
	<li>Coloque os cotonetes de gaze ao redor do local da incisão e molhe-os com PBS. Os cotonetes absorverão o PBS adicional que será adicionado durante a cirurgia. NOTA: Mantenha o suporte de calor e PBS durante toda a cirurgia.</li>
	<li>Exponha o útero do furão e coloque-o nos cotonetes de gaze.</li>
	<li>Carregue um capilar de vidro com a solução de injeção usando uma pipeta com uma ponta de carregamento longa. Certifique-se de que o volume de carregamento esteja aproximadamente entre 5-20 μL, dependendo do número de embriões e do número de condições experimentais diferentes. O volume médio injetado por embrião é de 3 a 5 μL. Conecte o capilar de vidro carregado a um suporte e conecte o outro lado do suporte a um tubo e a um bocal.</li>
	<li>Inspecione o primeiro embrião e encontre a cabeça.</li>
	<li>Coloque a fonte de luz de fibra óptica ao lado da cabeça do embrião para facilitar a visualização. NOTA: As paredes uterinas do furão são muito escuras, e é difícil ver através delas a menos que a luz esteja brilhando diretamente sobre elas.</li>
	<li>Realize uma única injeção intraventricular no ventrículo de um dos hemisférios cerebrais e mantenha o outro hemisfério intacto para servir como controle interno. O ventrículo em si não é facilmente distinto pelo olho, por isso sua localização é estimada com base na localização da íris pigmentada, que é visível. A injeção intraventricular é feita pegando o suporte preso ao capilar de vidro e penetrando na pele, crânio e tecido cerebral com a ponta do capilar de vidro. NOTA: Certifique-se de não danificar a placenta, que é mais escura que placentas murinas.<ol>
<li>Quando a ponta do capilar de vidro estiver no ventrículo, injete aproximadamente 3-5 μL da solução de injeção por tubos bucais usando o porta-voz conectado ao suporte capilar de vidro. Como a solução injetada contém 0,1% de Verde Rápido, o ventrículo injetado agora ficará verde escuro, e será visível como uma estrutura em forma de rim.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque os eletrodos da pinça no útero acima da cabeça do embrião para que o polo positivo seja colocado acima da área que será alvo e o polo negativo abaixo da área injetada.</li>
	<li>Defina as seguintes condições de eletroporação no eletroporador: Comprimento do pulso = 50 ms; Tensão de pulso = 100 V; Intervalo de pulso = 1 s; Número de pulsos = 5. Em seguida, pressione o botão "Pulse" no eletroporador.</li>
	<li>Solte rapidamente várias gotas de 1x PBS quente no embrião eletroporado.</li>
	<li>Repita o procedimento para todos os embriões. Mantenha o útero constantemente molhado com PBS quente. NOTA: Se os primeiros embriões voltados para a vagina não são facilmente acessíveis, é melhor não eletroporá-los.</li>
	<li>Quando todos os embriões estiverem eletroporados, coloque o útero de volta na cavidade peritoneal.</li>
	<li>Sutura a camada muscular com o peritônio usando uma sutura 4-0.</li>
	<li>Suturar a pele usando a mesma espessura e pulverizar a ferida com spray de alumínio.</li>
	<li>Coloque o animal em uma gaiola e mantenha aquecido com uma fonte de calor. Monitore cuidadosamente o animal até que ele acorde.</li>
</ol>4. Cuidados pós-operatórios e moradia de animais-alvo
<ol><li>Durante 3 dias após a cirurgia, certifique-se de que os animais estejam passando pelos seguintes cuidados pós-operatórios: 20 mg/kg de amoxicilina (antibiótico) 1x por dia; 25 mg/kg metamizol (analgésico) 3x diariamente.</li>
	<li>Certifique-se de que os furões estejam alojados individualmente.</li>
	<li>Certifique-se de que os furões são examinados por um veterinário pelo menos 1x por dia.</li>
	<li>Certifique-se de que os furões sejam perturbados o mínimo possível durante a entrega.</li>
	<li>Depois que os filhotes forem desmamados ou sacrificados, preparem os jills para histerectomia.</li>
</ol>5. Histerectomia de furões
NOTA: Uma histerectomia é realizada para reduzir o número de animais sacrificados para que os animais esterilizados possam ser doados para adoção como animais de estimação. O procedimento pré-cirúrgico para histerectomia é o mesmo da etapa 2.
<ol><li>Raspe e esterilize a barriga do furão conforme descrito nas etapas 3.1 e 3.2.</li>
	<li>Abra cirurgicamente a barriga na linhaa alba. Corte a camada muscular. Levante a camada muscular e proteja o intestino com um dedo enquanto abre totalmente a camada muscular.</li>
	<li>Coloque os cotonetes de gaze ao redor do local da incisão e molhe-os com PBS estéril. Exponha o útero furão e os ovários e coloque-os nos cotonetes de gaze.</li>
	<li>Inicie a histerectomia de um lado ligando a arteria ovarica e vena ovarica cranial ao mesovar. Coloque um grampo em cada lado da ligadura e realize outra ligadura craniana nos grampos. Coloque o terceiro grampo nas extremidades da ligadura para salvá-los. Repita do outro lado.</li>
	<li>Corte entre os grampos e desprende o cornua uteri da mesenteria de ambos os lados.</li>
	<li>Ligate a arteria uterina em ambos os lados uterinos caudal para ostium uteri. Em seguida, ligar a vagina e consertar a ligadura. Coloque o grampo nas extremidades das ligaduras para salvá-los. Coloque dois grampos cranianos na ligadura. Corte entre os grampos e desprende o útero da vagina. Remova o útero e os ovários e elimine-os. Raspe a membrana mucosa residual da bunda do útero.</li>
	<li>Retire todos os grampos restantes e encurte as extremidades da ligadura. Certifique-se de controlar o sangramento depois que os grampos tiverem sido removidos.</li>
	<li>Sutura a camada muscular e a pele como descrito nas etapas 3.16 e 3.17. Siga o protocolo pós-operatório como nas etapas 3.18 e 4.1-4.3. Mantenha os animais na unidade animal por pelo menos 2 semanas com visitas veterinárias regulares. Depois que os animais forem totalmente recuperados, eles podem ser doados para adoção.</li>
</ol>

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<li>Fietz, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OSVZ+progenitors+of+human+and+ferret+neocortex+are+epithelial-like+and+expand+by+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling.</a> Nature Neurosciences. 13 (6), 690-699 (2010).</li>
<li>Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evolution+of+the+human+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and evolution of the human neocortex.</a> Cell. 146 (1), 18-36 (2011).</li>
<li>Fietz, S. A., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+progenitor+expansion%2C+self-renewal+and+neurogenesis-a+polarized+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Cortical progenitor expansion, self-renewal and neurogenesis-a polarized perspective.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 23-35 (2011).</li>
<li>De Juan Romero, C., Bruder, C., Tomasello, U., Sanz-Anquela, J. M., Borrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+domains+of+gene+expression+in+germinal+layers+distinguish+the+development+of+gyrencephaly%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Discrete domains of gene expression in germinal layers distinguish the development of gyrencephaly.</a> EMBO Journal. 34 (14), 1859-1874 (2015).</li>
<li>Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+investigations+of+the+brain+of+higher+mammals+using+gyrencephalic+carnivore+ferrets%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosciences+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular investigations of the brain of higher mammals using gyrencephalic carnivore ferrets.</a> Neurosciences Research. 86, 59-65 (2014).</li>
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<li>Borrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+to+the+postnatal+ferret+cerebral+cortex+by+DNA+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery to the postnatal ferret cerebral cortex by DNA electroporation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 186 (2), 186-195 (2010).</li>
<li>Borrell, V., Kaspar, B. K., Gage, F. H., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evidence+for+radial+migration+of+neurons+by+long-distance+somal+translocation+in+the+developing+ferret+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">In vivo evidence for radial migration of neurons by long-distance somal translocation in the developing ferret visual cortex.</a> Cerebral Cortex. 16 (11), 1571-1583 (2006).</li>
<li>Johnson, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspm+knockout+ferret+reveals+an+evolutionary+mechanism+governing+cerebral+cortical+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size.</a> Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).</li>
<li>Vaid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+population+of+Hopx-dependent+basal+radial+glial+cells+in+the+developing+mouse+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A novel population of Hopx-dependent basal radial glial cells in the developing mouse neocortex.</a> Development. 145 (20), 169276(2018).</li>
<li>Pilz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+progenitors+in+the+mammalian+telencephalon+includes+a+new+radial+glial+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type.</a> Nature Communications. 4, 2125(2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

No útero a eletroporação no furão é uma técnica importante, com vantagens e desvantagens em relação a outros métodos. Existem etapas e limitações críticas para este método, bem como possíveis modificações e aplicações futuras para ter em mente.
Desde o pioneirismo de Victor Borrell e colegas sobre manipulação genética do neocórtex do furão pós-natal via eletroporação ou injeção viral35,42,43, o furão ...

O neocórtex é a folha externa do cerebrum mamífero e a sede de funções cognitivas mais altas1,,2,3,4,5. Para alcançar uma manipulação genética aguda no neocórtex mamífero in vivo durante o desenvolvimento embrionário, dois métodos diferentes foram explorados: infecção viral6 e na eletroporaçãouterónica 7. Ambos os métodos permitem um direcionamento eficiente de células neocorticais, mas sofrem de algumas limitações. A maior vantagem da eletroporação uteiremida em relação à infecção viral é a capacidade de alcançar especificidade espacial dentro do neocórtex, que é alcançado pela regulação da direção do campo elétrico.
Desde que a eletroporação foi mostrada pela primeira vez para facilitar a entrada de DNA nas células in vitro8,ela foi aplicada para entregar DNA em vários vertebrados in vivo. Na neurociência do desenvolvimento, a eletroporação utero do neocórtex do camundongo foi relatada pela primeira vez em 20019,10. Este método consiste em uma injeção da mistura de DNA no ventrículo lateral do cérebro embrionário e posterior aplicação do campo elétrico usando eletrodos de pinça, o que permite precisão espacial7,,11. A eletroporação utero tem sido aplicada desde então para fornecer ácidos nucleicos a fim de manipular a expressão de genes endógenos ou emplacados no neocórtex do camundongo. Importantes progressos foram feitos recentemente, aplicando a metodologia de edição de genoma mediado por CRISPR/Cas9 via eletroporação utero no neocórtex do camundongo para realizar (1) interrupção genética nos neurônios pós-metóticos12,,13 e células progenitoras neurais14, e (2) genoma15 e edição epigenome16.
Logo após o primeiro relato em camundongos, na eletroporação uterónica foi aplicado ao neocórtex de rato embrionário17,18. Os não roedores permaneceram um desafio até que a primeira eletroporação uterópica de furões, um pequeno carnívoro, foi relatada em 201219,20. Desde então, no útero a eletroporação de furões tem sido aplicada para estudar os mecanismos de desenvolvimento do neocórtex rotulando progenitores neurais e neurônios20,21,22,,23, manipulando a expressão de genes endógenos, incluindo o uso da tecnologia CRISPR/Cas924, e fornecendo genes ectópicos21,22,,25, incluindo genes humanos-específicos26. Além disso, a eletroporação utero de furões tem sido usada para abordar características do desenvolvimento do neocórtex humano em condições patológicas27,28.
No contexto do desenvolvimento do neocórtex, as vantagens de usar furões como organismo modelo em comparação com camundongos se devem ao fato de que os furões melhor recapitulam uma série de características humanas. No nível anatômico, os furões exibem um padrão característico de dobramento cortical, que também está presente no ser humano e na maioria dos outros primatas, mas está completamente ausente em camundongos ou ratos4,,29,,30,,31. No nível histológico, os furões têm duas zonas germinals subventriculares distintas, conhecidas como zonas subventriculares internas e externas (ISVZ e OSVZ,respectivamente) 32,33, separadas pela camada interna de fibra23. Essas características também são compartilhadas com primatas, incluindo humanos, mas não com camundongos34. O ISVZ e o OSVZ em furões e humanos são povoados com abundantes células progenitoras neurais, enquanto a zona subventricular (SVZ) de camundongos contém apenas progenitores neurais esparsos21,,32,,35,,36. A nível celular, os furões apresentam uma alta proporção de um subtipo de progenitores neurais referidos como glia radial basal ou externa (bRG ou oRG, respectivamente), que são considerados instrumentais para a expansão evolutiva do neocórtex mamífero34,,37,38. bRG são, portanto, altamente abundantes no neocórtex do furão humano e embrionário fetal, mas são muito raros no neocórtex do camundongo embrionário35,36. Além disso, o furão bRG apresenta heterogeneidade morfológica semelhante à do bRG humano, muito superior ao do mouse bRG21. Finalmente, em nível molecular, o desenvolvimento do neocórtex furão mostra padrões de expressão genética altamente semelhantes aos do neocórtex humano fetal, que presume-se controlar o desenvolvimento da dobra cortical, entre outras coisas39.
As características biológicas e moleculares das características biológicas e moleculares do furão bRG tornam-nas altamente proliferativas, semelhantes à bRG humana. Isso resulta em um aumento da produção de neurônios e desenvolvimento de um neocórtex expandido e altamente complexo34. Essas características tornam os furões excelentes organismos modelo para estudar características humanas do desenvolvimento de neocórtex que não podem ser modelados em camundongos26,40. Para aproveitar ao máximo o furão como organismo modelo, foi desenvolvido o método apresentado. Consiste na eletroporação uterópica de embriões furões furões E33 com um plasmídeo expressando GFP (pGFP) sob o controle de um promotor onipresente, CAG. Os embriões eletroporados podem então ser analisados embrionáriamente ou postalmente. Para reduzir o número de animais sacrificados, os furões fêmeas (jills) são esterilizados pela histerectomia e doados para adoção como animais de estimação. Se os embriões-alvo forem colhidos em estágios embrionários, uma segunda cirurgia é realizada e os embriões são removidos por cesariana, enquanto os jills são histerectomizados. Se os embriões-alvo forem analisados em estágios pós-natal, os jills são histerectomizados após os filhotes serem desmamados ou sacrificados. Por isso, também é apresentado um protocolo para a histerectomia dos jills.

<table><tbody><tr><td>Seringa de 1ml</td><td>BD</td><td>309628</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>4-0 Sutura Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>V392ZG</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Spray de alumínio</td><td>cp-pharma</td><td>98017</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Amoxicilina+ácido clavulânico (Synulox RTU)</td><td>WDT</td><td>6301</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Suporte para cappilar</td><td>WPI</td><td>MPH6S12</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Solução de pomada de dexpantenol</td><td>Bayer</td><td>6029009.00.00</td><td>Folha</td></tr> de <tr><td>campo cirúrgico 45x75cm</td><td>Hartmann</td><td>2513052</td><td></td></tr><tr><td>Surgery Electrode Pinça, banhado a platina 5mm</td><td>BTX</td><td>45-0489</td><td>Electroporation Electroporator</td></tr><tr><td></td><td>BTX</td><td>ECM830</td><td>Fast</td></tr><tr><td>Green</td><td>Sigma</td><td>F7258-25G</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Furão Mustela putorius furo</td><td>Marshall</td><td>NA</td><td>Organismo experimental</td></tr><tr><td>Fonte de luz de fibra óptica</td><td>Olympus</td><td>KL1500LCD</td><td>Pinça de eletroporação</td></tr><tr><td></td><td>Instrumento Allgaier</td><td>08-033-130</td><td>Pinça de cirurgia</td></tr><tr><td>3C-SA</td><td>Rubis Tech</td><td>3C-SA</td><td>Pinça de cirurgia</td></tr><tr><td>55</td><td>Dumostar</td><td>11295-51</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Fórceps 5-SA</td><td>Rubis Tech</td><td>5-SA</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Gaze cotonetes grandes</td><td>Hartmann</td><td>401723</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Gaze cotonetes pequenos</td><td>Hartmann</td><td>401721</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>GFAP anticorpo</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>GFP</td><td>Aves labs</td><td>GFP1020</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>Tampas de vidro (vidro borossilicato com filamento, OD: 1,2 mm, ID: 0.69mm, 10cm de comprimento)</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF120-69-10</td><td>Eletroporação</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Bela-pharm</td><td>K4011-02</td><td>Almofada</td></tr><tr><td>de Calor para Cirurgia</td><td>Hans Dinslage</td><td>Sanitas SHK18</td><td>Iodo para Cirurgia</td></tr><tr><td>(Solução de Betadine 100 mg/ml)</td><td>Meda</td><td></td><td>997437 Cirurgia</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>CP</td><td>21311</td><td></td></tr><tr><td>Dicas de Carregamento para Cirurgia 20&micro; l</td><td>Eppendorf</td><td>#5242 956.003</td><td>Eletroporação</td></tr><tr><td>Metamizol</td><td>WDT</td><td>99012</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação de Metzenbaum</td><td>Aesculap</td><td>BC600R</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta</td><td>Instrumento Sutter</td><td>Modelo P-97</td><td>Eletroporação</td></tr><tr><td>pCAGGS-GFP</td><td>NA</td><td></td><td>NA Na De Kalebic et al., eLife, 2018</td></tr><tr><td>Anticorpo PCNA</td><td>Millipore</td><td>CBL407</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>pH3 Anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab10543</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Aesculap</td><td>294200104</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Barbeador</td><td>Braun</td><td>EP100</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Sox2 anticorpo</td><td>R + D Systems</td><td>AF2018</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>Braçadeira cirúrgica 13cm</td><td>WDT</td><td>27080</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Colher dupla cirúrgica (Williger)</td><td>WDT</td><td>27232</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Campo cirúrgico</td><td>WDT</td><td>28800</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica pequena</td><td>FST</td><td>14090-09</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Suporte de agulha de sutura</td><td>Aesculap</td><td>BM149R</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Tbr2 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab23345</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferência de anticorpos 3ml</td><td>Fischer científico</td><td>13439108</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Julabo</td><td>TW2</td><td>Cirurgia</td></tr></tbody></table>

in vivo targeting of neural progenitor cells in ferret neocortex by in utero electroporation

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

A manipulação da expressão genética in vivo durante o desenvolvimento embrionário é o método de escolha ao analisar o papel dos genes individuais durante o desenvolvimento dos mamíferos. No útero a eletroporação é uma técnica-chave para a manipulação da expressão genética no cérebro embrionário mamífero in vivo. Um protocolo para a eletroporação uterópica do neocórtex embrionário de furões, um pequeno carnívoro, é apresentado aqui. O furão está cada vez mais sendo usado como modelo para o desenvolvimento do neocórtex, pois seu neocórtex exibe uma série de características anatômicas, histológicas, celulares e moleculares que também estão presentes em primatas humanos e não humanos, mas ausentes em modelos de roedores, como rato ou rato. No útero a eletroporação foi realizada no dia embrionário (E) 33, um estágio de midneurogenesis no furão. No útero a eletroporação tem como alvo células progenitoras neurais que revestem os ventrículos laterais do cérebro. Durante a neurogênese, essas células progenitoras dão origem a todos os outros tipos de células neurais. Este trabalho mostra resultados e análises representativas no E37, no dia pós-natal (P) 1 e P16, correspondentes a 4, 9 e 24 dias após a eletroporação uterativa, respectivamente. Em estágios anteriores, a progênia das células-alvo consiste principalmente de vários subtipos progenitores neurais, enquanto em estágios posteriores a maioria das células rotuladas são neurônios pós-metóticos. Assim, na eletroporação uterópora permite o estudo do efeito da manipulação genética nas características celulares e moleculares de vários tipos de células neurais. Através de seu efeito em várias populações celulares, na eletroporação uterópica também pode ser usado para a manipulação de características histológicas e anatômicas do neocórtex furão. É importante ressaltar que todos esses efeitos são agudos e são realizados com uma especificidade espostetorial determinada pelo usuário.

Na eletroporação uterino de furões na E33 resultou na segmentação das células progenitoras neurais que revestem a superfície ventricular do neocórtex embrionário (Figura 1). Essas células são chamadas de progenitoras apical e são altamente proliferativas, dando origem a todos os outros tipos de células durante o desenvolvimento. Após a divisão assimétrica, os progenitores apical geraram outro progenitor apical e uma célula mais diferenciada, tipicamente um progenitor basal (BP), que delamino...

Apresentado aqui é um protocolo para realizar manipulação genética no cérebro de furão embrionário usando na eletroporação uterónica. Este método permite o direcionamento de células progenitoras neurais no neocórtex in vivo.

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...

Este protocolo nos permite realizar uma manipulação genética in vivo em um modelo animal chave que nos permite estudar a expansão e a dobra de um neocórtex em desenvolvimento. A principal vantagem deste método está em usar alta especificidade espacial e temporal no direcionamento dessas células-tronco neurais que são o tipo de célula chave para o desenvolvimento cerebral. Antes de iniciar o procedimento, puxe capilares de vidro em um puxador de micro pipeta e use fórceps para cortar a parte distal do capilar para ajustar o diâmetro da ponta capilar.No dia 33, adicione a concentração adequada de DNA na PBS, suplementada com 0,1% Fast Green com mistura suave, e coloque um furão feminino grávida de 3 horas em uma mesa de operação com uma almofada de calor. Confirme o nível adequado de sedação tocando a pele periocular e beliscando a pele entre o segundo e o terceiro ou terceiro e quarto dedo dos dois membros traseiros. Isoflurano pode causar efeitos adversos, incluindo náuseas e tonturas.Ao manusear isoflurane em forma líquida, use o equipamento de proteção. Durante a cirurgia, use recipientes apropriados para capturar o gás. Injete o animal subcutâneamente com analgésico, antibiótico

in-vivo-targeting-neural-progenitor-cells-ferret-neocortex-utero

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

In Utero injeção intraventricular e eletroporação de embriões de ratos E16

In Utero injeção intraventricular e eletroporação de embriões de camundongos E15

Na eletroporação utero é um método valioso para transfecting células progenitoras neuronal in vivo. Dependendo da colocação dos eletrodos e do ponto no tempo de desenvolvimento de eletroporação, certos subgrupos de células corticais podem ser alvo. Células-alvo podem então ser analisados ​​in vivo ou in vitro para efeitos da alteração genética.

No útero Eletroporação seguido por Cultura Neuronal primário para estudar a função do gene no subconjunto dos neurônios corticais

Na eletroporação útero permite a entrega rápida em um gene espacialmente e temporalmente maneira controlada no desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC). Aqui nós descrevemos um adaptável altamente in utero protocolo de eletroporação que pode ser usado para entregar constrói expressão em vários domínios embrionário do SNC, incluindo o telencéfalo diencéfalo e retina.

Entrega Gene eficiente em múltiplos territórios CNS Usando In Utero Eletroporação

Um método de transferência de genes no cérebro do rato em desenvolvimento é descrito usando um único método cirúrgico ea forma especial de eletrodos. Esta técnica exclusiva permite a transfecção de DNA plasmídeo temporal e espacialmente, o que ajudará muitos neurocientistas em estudar o desenvolvimento do cérebro.

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

A superfície pial é uma zona de progenitor original no SNC, que está a receber cada vez mais atenção. Aqui, detalhamos um método para manipulação genética rápida desta zona progenitor usando um método de eletroporação modificado. Este procedimento pode ser usado para investigações celulares e moleculares de linhagens celulares e vias de sinalização envolvidas na diferenciação celular e para esclarecer o destino e as propriedades das células-filhas.

Neonatal Pial Superfície Eletroporação

Este procedimento mostra como direcionar interneurônios no prosencéfalo de camundongo em desenvolvimento por meio de eletroporação in utero. Essa técnica foi particularmente eficiente para alcançar a expressão gênica seletiva em subtipos de interneurônios destinados às camadas superficiais do córtex.

Subtipo seletivo Eletroporação de Cortical Interneurônios

Este protocolo descreve em detalhes como transfectar especificamente diferentes regiões do sistema nervoso central C57BL/6 por meio de eletroporação in utero. Incluídas neste protocolo estão instruções detalhadas para transfecções de regiões que se desenvolvem no córtex, hipocampo, tálamo, hipotálamo, núcleo septal lateral e estriado.

Específicos do Striatum Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- e<em&gt; In Utero</em&gt; A electroporação em ratinhos C57BL / 6 mouse

Este manuscrito fornece protocolos que usam in utero eletroporação (IUE) para descrever a conectividade estrutural dos neurônios no nível de uma única célula e a excitabilidade dos neurônios marcados com fluorescência. A histologia é utilizado para caracterizar dendrítica e projecções axonais. a gravação de célula inteira em fatias agudas é usado para investigar a excitabilidade.

In Utero Eletroporação Abordagens para estudar a excitabilidade neuronal subpopulações e Conectividade uma única célula

O dobro na eletroporação uteral permite atingir populações celulares que são separadas espacial e temporalmente. Esta técnica é útil para visualizar interações entre essas populações celulares usando proteínas fluorescentes em condições normais, mas também após experimentos funcionais para perturbado genes de interesse.

Dupla em Eletroporação utero para atingir populações celulares temporais e espacialmente separadas

Aqui, apresentamos a manipulação genética aguda de organoides corticais humanos fatiados por eletroporação. Esses modelos organoides corticais são particularmente passíveis de injeção, pois estruturas semelhantes a ventrículos podem ser prontamente identificadas após o corte, permitindo a investigação funcional do desenvolvimento cortical humano, distúrbios do neurodesenvolvimento e evolução cortical.

Eletroporação de organoides corticais humanos fatiados para estudos da função gênica

Aprenda a eletroporação in utero para manipulação genética em progenitores neurais do neocórtex de furões. Este método permite estudar a expansão e dobra do neocórtex em desenvolvimento com alta especificidade espacial e temporal.

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

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