Name: Circadiano De Drosophila Melanogaster (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Aprenda a sincronizar Drosophila melanogaster para pesquisa de ritmos circadianos usando técnicas de imunoblotting e imunofluorescência. Este método permite estudar relógios biológicos e suas implicações em doenças como Alzheimer e Parkinson.

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Agradecimentos especiais à Universidade do Missouri-Kansas City e ao laboratório Jeffrey L. Price.

1. Produção de alimentos voadores
<ol><li>Por cada 1 L de água, prepare comida de mosca composta por 4,69 g de melaço seco, 19,70 g de levedura ativa seca, 87,22 g de farinha de milho e 7,83 g de ágar.</li>
	<li>Misture o conteúdo listado acima em um pote e gire o calor para 250 °F. Misture bem como os ingredientes são adicionados.</li>
	<li>Mantenha a tampa sobre o pote de crock, pois o alimento de mosca está aquecendo, ao mesmo tempo em que mistura o conteúdo a cada 10 minutos até chegar a uma fervura. Deixe a fervura de rolamento continuar por 20 minutos antes de desligar o fogo.</li>
	<li>Adicione 83,60 mL de água e mantenha a tampa do pote de crockpot fora enquanto a comida esfria.</li>
	<li>Misture e regisse a temperatura do alimento a cada 10 minutos com um termômetro de vidro. Evite deixar uma camada de filme se acomodar em cima da comida.</li>
	<li>Uma vez que o alimento tenha esfriado a 60 °C, adicione 10,44 mL de Tegosept e 5,51 mL de ácido propínico por litro de água adicionado (ver passo 1.1).</li>
	<li>Misture bem e aumente o calor até 60 °C para evitar que a comida fique muito fria.</li>
	<li>Bombeie a comida de mosca conforme necessário usando o enchimento Droso.</li>
	<li>Para frascos estreitos, bombeie 10 mL e para garrafas de fundo quadrados de 6 oz bombear 60 mL.</li>
</ol>2. Coleta de moscas de idade definida
<ol><li>Monitore garrafas de moscas do tipo selvagem armazenadas a 25 °C por 5-7 dias até que grandes quantidades de pupa (cerca de 200 pupas) sejam anexadas ao lado da garrafa. As garrafas utilizadas são garrafas de calção Drosophila de 6 oz com fundo quadrado.</li>
	<li>Limpe os adultos existentes da garrafa. Ou coloca os adultos em uma garrafa nova ou coloca-os em 70% de etanol. Use a extremidade maçante de um pincel #0 para empurrar todos os adultos restantes para a comida de mosca. Certifique-se de limpar a escova de tinta com 70% de etanol antes e depois dos usos.</li>
	<li>Deixe as garrafas limpas descansarem por 3 dias em uma incubadora de 25 °C para permitir que a próxima geração se esclae. Estas moscas terão entre 0 e 3 dias de idade.</li>
</ol>3. Separação de moscas
<ol><li>Após 3 dias, separe os machos das fêmeas e colete o número desejado para cada sexo para cada um dos quatro pontos de tempo. As moscas podem ser diferenciadas pelo sexo examinando a genitália; os machos têm genitália arredondada escura, enquanto as fêmeas têm genitálias mais claras e pontiagudas. As fêmeas também são muito maiores que moscas machos.<ol>
<li>Use uma almofada de anestesia de CO2 para separar efetivamente as moscas e diferenciar entre os sexos. Mova as moscas com pincéis de tinta para evitar matá-las.</li>
		<li>Coletar 100 machos e 100 fêmeas para cada ponto de tempo, com 50 machos por frasco e 100 fêmeas por frasco. Os machos tendem a ser mais agressivos e suas interações sociais levam a muitas mortes quando há 100 indivíduos em um frasco. As fêmeas, com até 100 indivíduos, não são afetadas enquanto estão contidas no frasco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar as coletas nos seguintes pontos de tempo: ZT1, ZT7, ZT13 e ZT19(Tabela 1). Observe que as coleções feitas no escuro (ZT12-ZT24) são sensíveis à luz, enquanto as coleções ZT0-ZT11 são feitas durante os horários de luz e as luzes da sala podem ser acesas. Observe que duas incubadoras separadas são usadas com padrões de luz inversos de 12 horas para permitir que todas as coleções ocorram durante o dia e não durante a noite.</li>
	<li>Use moscas em excesso para criar novas garrafas de moscas para futuras entranhas. Coloque 25 fêmeas com 5-7 machos em cada garrafa nova e coloque na incubadora a 25 °C.</li>
</ol>4. Incubação de moscas
<ol><li>Permita que as moscas permaneçam em incubadoras regulamentadas à luz por 3-5 dias para permitir que a entrada circadiana ocorra. Certifique-se de que as incubadoras são leves porque mesmo pequenas quantidades de poluição luminosa perturbarão a entrada.</li>
</ol>5. Fixação de imunofluorescência
<ol><li>Após a entrada, prepare novos frascos de solução de fixação para amostras que serão utilizadas para imunofluorescência. Antes de remover as moscas da incubadora, adicione 4,8 mL de 4% de formaldeído diluído em 1x PBS + 0,1% Tween-20 a cada novo frasco estreito para cada 100 moscas que devem ser fixadas. Cada frasco abrigará 100 moscas circadianas machos ou 100 fêmeas. Coloque os frascos estreitos no gelo.</li>
</ol>6. Coleta de imunofluorescência
<ol><li>Ao coletar as moscas da incubadora para imunofluorescência, remova a tampa da garrafa e inverta rapidamente a garrafa no funil. Toque suavemente as moscas na solução através do funil para ajudar a guiar as moscas para o frasco; combinar dois tubos dos 50 machos para um total de 100 machos em um frasco e usar um único tubo de 100 fêmeas para o outro frasco.</li>
	<li>Realizar coleções ZT13 e ZT19 no escuro; usar uma luz vermelha para ver como a drosophila são muito menos sensíveis a esses comprimentos de onda de luz e, portanto, são menos propensas à poluiçãoluminosa 13. A proteína criptocromática, em particular, é especialmente sensível à luz azul, que deve ser evitada14.<ol>
<li>Para reduzir a exposição à luz, certifique-se de que o quarto de coleta esteja leve e apertado com quaisquer fontes de luz bloqueadas ou cobertas. Enrole estes frascos em papel alumínio para que as moscas ZT13 e ZT19 não sejam expostas à luz quando colocadas no misturador de nozes na etapa seguinte. As moscas ZT1 e ZT7 não são sensíveis à luz e podem ser colocadas na batedeira sem cobertura de papel alumínio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Misturador e armazenamento de nozes
<ol><li>Depois que as moscas tiverem sido coletadas, tape a parte superior dos frascos contendo fixação para evitar derramamento e coloque-as na batedeira de nozes a 165 RPM a 4 °C por 4h. As moscas não são mais sensíveis à luz após esta etapa de fixação, por isso a folha pode ser removida para verificar se a solução está se movendo e as moscas estão sendo submersas no fixador.</li>
	<li>Depois de remover a mosca contendo frascos da batedeira de nozes, remova o formaldeído e lave três vezes com 3.000 μL de 1x PBS, invertendo o frasco a cada lavagem.</li>
	<li>Armazene os frascos com amostras de imunofluorescência a 4 °C para aguardar a futura imunofluorescência15.</li>
</ol>8. Coleta para extração de proteínas
<ol><li>Prepare quatro tubos de 50 mL e um Dewar contendo nitrogênio líquido para preservação de amostras para extração de proteínas</li>
	<li>Para coletar moscas para extração de proteína ou ácido nucleico, transfira moscas das garrafas para o tubo da mesma forma que na etapa 6.1 e tampar rapidamente o tubo para evitar a liberação de moscas e colocar o tubo em nitrogênio líquido para congelar.</li>
</ol>9. Armazenamento para extração de proteínas
<ol><li>Armazene amostras congeladas para extração de proteínas a -80 °C. Estes podem ser processados de acordo com o protocolo de extração de proteínas apropriado para análise a jusante, incluindo a imunoblotação16.</li>
</ol>

<ol><li>Halberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+physiological+and+clinical+aspects+of+24-hour+periodicity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal-Lancet%22%5BJournal%5D)">Some physiological and clinical aspects of 24-hour periodicity.</a> The Journal-Lancet. 73 (1), 20-32 (1953).</li>
<li>Smarr, B. L., Jennings, K. J., Driscoll, J. R., Kriegsfeld, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time+to+remember%3A+the+role+of+circadian+clocks+in+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A time to remember: the role of circadian clocks in learning and memory.</a> Behavioral Neuroscience. 128 (3), 283-303 (2014).</li>
<li>Leng, Y., Musiek, E. S., Hu, K., Cappuccio, F. P., Yaffe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+circadian+rhythms+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Neurology%22%5BJournal%5D)">Association between circadian rhythms and neurodegenerative diseases.</a> The Lancet. Neurology. 18 (3), 307-318 (2019).</li>
<li>Hood, S., Amir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+and+the+Circadian+Clock%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration and the Circadian Clock.</a> Frontiers in aging Neuroscience. 9, 170(2017).</li>
<li>Sulli, G., Lam, M. T. Y., Panda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+Circadian+Clock+and+Cancer%3A+New+Frontiers+for+Cancer+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interplay between Circadian Clock and Cancer: New Frontiers for Cancer Treatment.</a> Trends in Cancer. 5 (8), 475-494 (2019).</li>
<li>Zehring, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-element+transformation+with+period+locus+DNA+restores+rhythmicity+to+mutant%2C+arrhythmic+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">P-element transformation with period locus DNA restores rhythmicity to mutant, arrhythmic Drosophila melanogaster.</a> Cell. 39 (2 Pt 1), 369-376 (1984).</li>
<li>Bargiello, T. A., Jackson, F. R., Young, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+circadian+behavioural+rhythms+by+gene+transfer+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoration of circadian behavioural rhythms by gene transfer in Drosophila.</a> Nature. 312 (5996), 752-754 (1984).</li>
<li>Siwicki, K. K., Eastman, C., Petersen, G., Rosbash, M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+the+period+gene+product+of+Drosophila+reveal+diverse+tissue+distribution+and+rhythmic+changes+in+the+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Antibodies to the period gene product of Drosophila reveal diverse tissue distribution and rhythmic changes in the visual system.</a> Neuron. 1 (2), 141-150 (1988).</li>
<li>Hardin, P. E., Hall, J. C., Rosbash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+of+the+Drosophila+period+gene+product+on+circadian+cycling+of+its+messenger+RNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Feedback of the Drosophila period gene product on circadian cycling of its messenger RNA levels.</a> Nature. 343 (6258), 536-540 (1990).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+period+gene+encodes+a+predominantly+nuclear+protein+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The period gene encodes a predominantly nuclear protein in adult Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 12 (7), 2735-2744 (1992).</li>
<li>Vosshall, L. B., Price, J. L., Sehgal, A., Saez, L., Young, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Block+in+nuclear+localization+of+period+protein+by+a+second+clock+mutation%2C+timeless%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Block in nuclear localization of period protein by a second clock mutation, timeless.</a> Science (New York, N.Y). 263 (5153), 1606-1609 (1994).</li>
<li>Price, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((double-time+is+a+novel+Drosophila+clock+gene+that+regulates+period+protein+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">double-time is a novel Drosophila clock gene that regulates period protein accumulation.</a> Cell. 94 (1), 83-95 (1998).</li>
<li>Hanai, S., Hamasaka, Y., Ishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+entrainment+to+red+light+in+Drosophila%3A+requirement+of+Rhodopsin+1+and+Rhodopsin+6%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Circadian entrainment to red light in Drosophila: requirement of Rhodopsin 1 and Rhodopsin 6.</a> Neuroreport. 19 (14), 1441-1444 (2008).</li>
<li>Vinayak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exquisite+light+sensitivity+of+Drosophila+melanogaster+cryptochrome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exquisite light sensitivity of Drosophila melanogaster cryptochrome.</a> PLoS Genetics. 9 (7), e1003615(2013).</li>
<li>Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+Immunofluorescent+Staining+of+Mushroom+Body+and+Photoreceptor+Neurons+in+Adult+Drosophila+melanogaster+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56174(2017).</li>
<li>Au-Eslami, A., Au-Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blotting%3A+Sample+Preparation+to+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Western Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359(2010).</li>
<li>Fan, J. Y., Muskus, M. J., Price, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrainment+of+the+Drosophila+circadian+clock%3A+more+heat+than+light%5BTitle%5D)+AND+%22Science%27s+signal+Transduction+Knowledge+Environment%22%5BJournal%5D)">Entrainment of the Drosophila circadian clock: more heat than light.</a> Science's signal Transduction Knowledge Environment. (413), pe65(2007).</li>
<li>Miyasako, Y., Umezaki, Y., Tomioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separate+sets+of+cerebral+clock+neurons+are+responsible+for+light+and+temperature+entrainment+of+Drosophila+circadian+locomotor+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Separate sets of cerebral clock neurons are responsible for light and temperature entrainment of Drosophila circadian locomotor rhythms.</a> Journal of Biological Rhythms. 22 (2), 115-126 (2007).</li>
<li>Edery, I., Zwiebel, L. J., Dembinska, M. E., Rosbash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+phosphorylation+of+the+Drosophila+period+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Temporal phosphorylation of the Drosophila period protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2260-2264 (1994).</li>
<li>Helfrich-Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroarchitecture+of+the+circadian+clock+in+the+brain+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">The neuroarchitecture of the circadian clock in the brain of Drosophila melanogaster.</a> Microscopy Research and Technique. 62 (2), 94-102 (2003).</li>
<li>Price, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+for+clock+mutants+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Genetic screens for clock mutants in Drosophila.</a> Methods in Enzymology. 393, 35-60 (2005).</li>
</ol>

Os pesquisadores utilizam esse protocolo de entramento com sucesso e consistência. Este procedimento permite a fixação de uma grande piscina de amostragem que pode ser armazenada para análise futura. Além disso, essa estratégia preserva os padrões neurológicos induzidos pela entrada para exames futuros.
A fixação para armazenamento é um dos principais componentes do processo de entranção, pois ajuda a estabilizar o tecido cerebral e permite mais tempo para analisar cada cérebro a partir do pool de dados, minimizando assim os resíduos de cérebros que perdem viabilidade devido aos21anos . O objetivo principal é circadiano entrar o maior número possível de moscas para que haja inventário contínuo disponível para dissecções de cabeça e, em última instância, imunofluorescência ou extração de proteínas para observar os achados e determinar se os resultados são de alta confiança. Para garantir que a entranção circadiana seja preservada através da fixação, é fundamental que qualquer fonte de poluição luminosa seja eliminada. O processo de fixação permite que a Drosophila seja armazenada mantendo seu "timetamp" neurológico para que possam ser dissecados posteriormente e analisados sem diferenças perceptíveis para moscas que são dissecadas e sofreram imunofluorescência imediatamente após a entrada. Para fins de fixação antes da imunofluorescência, o laboratório determinou com consistência que as moscas são viáveis pelo menos até 1 mês. Fixações para extração de proteína de mancha ocidental tornam os cérebros viáveis indefinidamente quando armazenados a -80 °C.
Outro passo crítico do protocolo é o sexing das moscas. É importante que este passo seja feito com precisão, pois ter ambos os sexos no mesmo frasco antes da fixação pode levar ao acasalamento, o que produzirá novas moscas que são de idade mais jovem e análise de proteínas corruptas se os machos forem acidentalmente examinados em vez de fêmeas ou vice-versa. Além disso, ao fazer sexo é importante remover amostras de larvas que às vezes são ligadas às fêmeas. Isso impede o desenvolvimento de novas descendências dentro do frasco feminino que poderiam potencialmente corromper resultados.
O próximo passo para o protocolo de entramento pode ser com itens relacionados à análise de dados. O foco do protocolo é a localização de proteínas, mas se há outras variáveis que são impactadas pela entranção circadiana, elas devem ser exploradas por novos caminhos, muitas vezes exigindo extração de proteínas ou ácidos nucleicos. Além disso, existem outras proteínas do cérebro que ainda podem ser analisadas através deste protocolo. Os experimentos associados ao protocolo analisaram certas proteínas, mas a lista de genes e proteínas que desempenham um papel na biologia circadiana não foi esgotada. O protocolo é eficaz no cumprimento do objetivo de estabelecer um ritmo circadiano, no entanto, as aplicações são amplas.

Quase todos os organismos da Terra, do maior até o único celular, têm um relógio biológico interno com um ciclo de cerca de um dia. Este é conhecido como o ritmo circadiano (cunhado em 1953 por Franz Halberg a partir dos termos latinos circa = cerca/aproximadamente e "morre" = dia)1. Embora os componentes do relógio central sejam conhecidos e seus mecanismos rudimentares de função conceituados, ainda há muito o que entender sobre como os ritmos biológicos são mantidos em todo o corpo. É importante ressaltar que a má regulação dos ritmos biológicos está associada a desfechos de saúde ruins, incluindo má formação da memória, distúrbios do sono, transtorno de afeto sazonal, depressão, transtorno bipolar, diabetes, obesidade, neurodegeneração e câncer2,,3,4,5.
Drosophila é um modelo bem estabelecido para a investigação da biologia circadiana. Geneticamente e bioquimicamente tratáveis, grandes números são facilmente entranados (como será mostrado). De fato, todas as sete publicações citadas como principais publicações de apoio na concessão do Prêmio Nobel pela descoberta de ritmos circadianos alavancaram esses pontos fortes do modelo Drosophila6,,7,,8,9,,10,,11,12.
Além disso, mostramos estratégias eficazes para a coleta de moscas entratinadas para fins de imunofluorescência, ácido nucleico ou análise baseada em extração de proteínas. Utilizando essas estratégias, pode-se processar e armazenar quantidades maiores de amostras para análise no futuro. Esses métodos são muito vantajosos, pois são reprodutíveis e podem produzir centenas de moscas presas que podem fazer parte de um grande pool de dados.

<table><tbody><tr><td>Pipeta 100-1000uL</td><td>Eppendorf</td><td>ES-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 10-100uL</td><td>Eppendorf</td><td>ES-100</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Paraformaldeído 16%</td><td>15710</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL01-6X100ML</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423500</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Conexão de Filtro</td><td>de Anestesia Mundo Precision Instruments</td><td>EZ-251A</td><td></td></tr><tr><td>Farinha de Milho</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-100</td><td></td></tr> Bomba de Alimentos de <tr><td>Melaço Seco</td><td>OT280504</td><td></td><td>Direto</td></tr><tr>para<td>Droso-filler</td><td>geneseesci.com</td><td>59-169</td><td></td></tr><tr><td>Garrafas de estoque de Drosophila, fundo quadrado de 6 oz com Flugs</td><td>geneseesci.com</td> frascos de Drosophila <td>32-130BF</td><td></td></tr><tr><td>, Resina K Estreita geneseesci.com a granel super</td><td></td><td>32-118SB</td><td></td></tr><tr><td>Levedura ativa seca</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-103</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>IBI Scientific</td><td>IB15720</td><td></td></tr><tr><td>EZ Basic Anesthesia System</td><td>World Precision Instruments</td><td>EZ-175</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubos de centrífuga</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubos de fundo redondo</td><td>Corning</td><td></td><td></td>352057</tr><tr><td>Marcador de ponta fina Sharpie</td><td>Sharpie</td><td>30001</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de nutatas Fisherbrand Fisher</td><td>Scientific</td><td>88-861-043</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de plástico estreitos</td><td>Termômetro de vidro Genesee Scientific</td><td>49-102</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Palmer</td><td>EW-08008-12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mangueira de nitrogênio líquido</td><td>Thermo Scientific</td><td>398202</td><td></td></tr><tr><td>Tanque de nitrogênio líquido-Dewar</td><td>Cooper Surgical Inc</td><td>900109-1</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de transferência de nitrogênio líquido</td><td>Electron Mircoscopy Sciences</td><td>61891-02</td><td></td></tr><tr><td>Pincéis (Red Sable) Tamanho #0</td><td>Electro Microscopy Sciences</td><td>66100-00</td><td>Isso é usado para separar as moscas através do sexo sem causar ferimentos.</td></tr><tr><td>Funil de plástico</td><td>Plews e Edelmann</td><td>570-75-062</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de luz polarizadora</td><td>Microscópio Central</td><td>1100100402241</td><td>Usado para visualizar mais claramente a Drosophila durante a sexagem</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta ProPette</td><td>MTC Bio Incorporated</td><td>P5200-100U</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta ProPette</td><td>MTC Bio Incorporated</td><td>P5200-1M</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta ProPette</td><td>MTC Bio Incorporated</td><td>P5200-5M</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Propiônico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1386-1L</td><td></td></tr><tr><td>Bolas de Rayon</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-100</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds wrap folha de alumínio padrão</td><td>Staples</td><td>1381273</td><td></td></tr><tr><td>Roaster Oven (Crockpot)</td><td>Hamilton Beach</td><td>32950</td><td></td></tr><tr><td>Fita Mágica Scotch 810</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>77300</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de spray com gatilho</td><td>US Plastic</td><td>66446</td><td>Usado para pulverizar etanol para limpar áreas de trabalho</td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Drosophila Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3990FL</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Revco 4 graus Geladeira de laboratório</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>REL7504D</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Revco Freezer de Laboratório</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>REL7504A</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Anatrace</td><td>T1003-1-GA</td><td></td></tr></tbody></table>

circadiano de drosophila melanogaster

Circadian Entrainment of Drosophila Melanogaster

Quase universais entre organismos, ritmos circadianos coordenam a atividade biológica à órbita da Terra ao redor do Sol. Para identificar fatores que criam esse ritmo e entender as saídas resultantes, é necessária a entrada de organismos modelos para pontos de tempo circadianos definidos. Aqui detalhamos um procedimento para entrar muitos Drosophila a um ritmo circadiano definido. Além disso, detalhamos as etapas pós-entratinação para preparar amostras para imunofluorescência, ácido nucleico ou análise baseada em extração de proteínas.

A entranção circadiana controlada permite que os pesquisadores examinem a biologia em pontos de tempo específicos durante todo o dia circadiano usando os horários de tempo ZT1-ZT19 ou adicionem pontos de tempo conforme necessário. Aqui usamos luz e escuridão para entrar em moscas para ciclos circadianos e verificar a entrada por imunobloquetação e análise de imunofluorescência da proteína do período, um marcador para a entrada circadiana(Figura 1). Após a entrada correta, as proteínas de período devem ter um padrão característico de intensidade e mobilidade(Figura 1A) e devem ser visíveis em locais específicos do cérebro ZT1(Figura 1B). Embora outras variáveis, incluindo alimentos e temperatura, possam influenciar a entrada circadiana, a luz é mais simples e confiável para controlar17. Para efeitos desses métodos, as temperaturas da incubadora são mantidas constantes, contando com neurônios de relógio cerebral que são influenciados pela luz para a entrada18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61176/61176fig1.jpg"> Figura 1: Verificação da entrainment. (A) A Imunoblotting de extratos celulares inteiros preparados a partir de cabeças de moscas entratinadas mostra padrões canônicos de mobilidade e intensidade de proteínas de período19. 1,4 cabeças femininas de cada um dos tempos zeitgeber indicados (ZT) foram analisadas utilizando um anticorpo anti-Per. (B) Imunofluorescência de cérebros entratinados coletados em TV, onde a proteína do período é encontrada em um padrão característico (painéis inferiores, recriados a partir de Helfrich-Forster20). São mostradas imagens tiradas de diferentes seções do cérebro, capturando todos os neurônios esperados para conter proteína de período no ZT1. A barra de escala é de 40 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61176/61176fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ZT1</td>
			<td>ZT7</td>
			<td>ZT13</td>
			<td>ZT19</td>
		</tr>
<tr>
<td>Luz entre 10:00 e 22:00</td>
			<td>Luz entre 10:00 e 22:00</td>
			<td>Escuro entre 9:00 e 21:00</td>
			<td>Escuro entre 9:00 e 21:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Coletado às 11:00 após 1 hora na luz</td>
			<td>Coletado às 17:00 após 7 horas na luz</td>
			<td>Coletado às 10:00 após 1 hora no escuro</td>
			<td>Coletado às 16h após 7 horas no escuro</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Horários de tempo de ritmo circadiano ZT1-ZT19.

Aqui, detalhamos como sincronizar drosophila a um dia circadiano. Este é o primeiro e mais importante passo necessário para o estudo de ritmos biológicos e cronobiologia.

Circadiano De Drosophila Melanogaster

Nearly universal among organisms, circadian rhythms coordinate biological activity to earth&#39;s orbit around the sun. To identify factors creating this ...

Sincronizar drosophila para definir tempos circadianos é o primeiro passo para estudar eventos que controlam ou respondem ao relógio biológico. A sincronização de todos os modelos seguirá a mesma abordagem básica. Há muitos passos para fazer isso prático e pode parecer esmagador colocá-los todos juntos.Espere tentar algumas vezes antes que pareça natural. Mantenha as temperaturas estáveis e quero a luz acesa durante os três minutos. Prepare a comida de mosca em um Crock-Pot a 121 graus Celsius, misturando-se à medida que os ingredientes são adicionados.Cubra o Crock-Pot e leve o conteúdo para ferver, misturando o conteúdo a cada 10 minutos. Depois de 20 minutos em uma fervura, desligue o fogo e adicione 83,6 mililitros de água ao Pote de Crock. Deixe a tampa fora enquanto a comida esfria.Enquanto a comida estiver esfriando, mexa a cada 10 minutos para evitar permitir que um filme se forme por cima. Também meça a temperatura a cada 10 minutos com um termômetro de vidro. Uma vez que o alimento tenha esfriado para abaixo de 60 graus Celsius, adicione Tegosept e ácido propiônico, como descrito no manuscrito.Misture bem e ajuste o Crock-Pot para manter uma temperatura, apenas alguns graus menos de 60 graus Celsius. Use uma bomba peristáltica para distribuir a comida de mosca. Para frascos estreitos, bombeie 10 mililitros, e para garrafas de fundo quadrados de seis onças, bombeie 60 mililitros.Armazene moscas selvagens a 25 graus Celsius por 10 a 12 dias, até que aproximadamente 200 pupas estejam presas ao interior da garrafa. Para remover os adultos da garrafa, coloque-os em uma garrafa nova e use a extremidade maçante de um pincel número zero para empurrar todos os adultos restantes. Limpe o pincel com 70% de etanol antes e depois do uso.Incubar a pupa a 25 graus Celsius para permitir que a próxima geração emerja. Depois de três dias, as moscas terão de zero a três dias de idade. Lembre-se que a temperatura, a luz e até mesmo a sua escolha de comida influenciarão a entrada.Certifique-se de mantê-los, cada controle durante o seu experimento. Nos pontos de tempo designados para coleta, use uma almofada de anestesia de dióxido de carbono para imobilizar as moscas, e coletar 100 machos e 100 fêmeas. Moscas fêmeas são muito maiores que os machos.As moscas também podem ser diferenciadas examinando a genitália. Os machos têm genitália arredondada escura, enquanto as fêmeas têm genitálias mais claras e pontiagudas. Coloque machos e fêmeas em frascos separados com 100 fêmeas por frasco e 50 machos por frasco.As interações sociais masculinas levam a muitas mortes quando há 100 indivíduos em um frasco. Para permitir a entrada circadiana, coloque os frascos em incubadoras reguladas por luz por três a cinco dias. Para produzir moscas para futuras entranhas, coloque 25 das fêmeas restantes, e cinco a sete dos machos restantes em uma nova garrafa.Incubar a garrafa a 25 graus Celsius. Para cada 100 moscas que serão coletadas. Prepare um frasco estreito adicionando 4,8 mililitros de fixação.Coloque os frascos estreitos em um balde de gelo, e leve o balde, toalhas de papel, papel alumínio e fita adesiva para a incubadora. Para coletar as moscas, coloque um funil no frasco estreito, em seguida, remova a tampa do frasco de moscas e inverta-a rapidamente para o funil. Toque suavemente para ajudar a guiar as moscas para o frasco de fixação.Ao coletar machos, combine dois frascos de 50 moscas em um frasco estreito. Enrole os frascos para ZT13 e ZT19 em papel alumínio. Depois de transferir as moscas, tape as tampas no lugar para evitar derramamento.Coloque os frascos no Misturador de Nozes a 165 RPM, e quatro graus Celsius, durante quatro horas. As moscas não são mais sensíveis à luz, então, a folha pode ser removida para verificar se as moscas estão sendo submersas no fixador. Depois de remover os frascos do Misturador de Nozes, remova o formaldeído e depois lave as moscas três vezes com 3000 microliters de 1X PBS, invertendo o frasco durante cada lavagem.Armazene os frascos a quatro graus Celsius, para aguardar futuras imunofluorescências. A luz e a escuridão eram usadas para entrar em moscas para ciclos circadianos. A entrada foi verificada por imunoblotação, e análise de imunofluorescência da proteína do período, um marcador para a entrada circadiana.A imunoblotação de extratos celulares inteiros, preparados a partir de cabeças de moscas entratinadas, mostra um padrão canônico de mobilidade e intensidade de proteínas de período. A imunofluorescência de cérebros entranados, coletadas no ZT1, mostra proteínas de período em padrão característico. Este método é um ponto de partida para imunofluorescentes, imunoplotting, imunoprecipitação, análise comportamental, e qualquer outra técnica que você possa querer usar para comparar como o caminho muda à medida que o relógio biológico marca.Com a capacidade de entrar no organismo modelo, você pode perguntar se seu caminho favorito muda ao longo do tempo, e se os efeitos em seu caminho favorito podem levar à interrupção do biológico. Uma série de doenças são agravadas quando o relógio biológico é interrompido. Identificar os mecanismos subjacentes nos ajudará a criar medicamentos mais eficazes para pessoas que sofrem de doenças, como Alzheimer e Mal de Parkinson.

circadian-entrainment-of-drosophila-melanogaster

Research

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Biology

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