Name: Ensaios de alta taxa de limite térmico em insetos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Aprenda ensaios de alta taxa para avaliar limites térmicos em insetos pequenos usando Drosophila. Este método permite medir tolerância ao calor e frio de forma eficiente e semi-automatizada.

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Agradecemos a Ellie McCabe pela ajuda na criação de moscas. Este trabalho é apoiado pelo Instituto Nacional de Agricultura dos Estados Unidos do Projeto Hatch de Alimentos e Agricultura 1010996 e a National Science Foundation concede OIA-1826689 à N.M.T.

1. Ensaio minde alto rendimento ct min
<ol><li>Montagem da coluna jaqueta(Figura 1A, Figura 2)<ol>
<li>Corte os tubos acrílicos mais largos (7 cm x 6,35 cm x 0,3 cm) e os mais estreitos (5,7 cm x 5,1 cm x 0,3 cm) de tubos acrílicos iguais (31,5 cm) com uma serra(Figura 2A). Estes dois tubos serão as paredes externas e mais internas da coluna jaquetada.</li>
		<li>Corte dois anéis (2 cm de largura) do tubo acrílico de 6,35 cm x 5,7 cm x 0,3 cm com uma serra de corte(Figura 2A). Estes dois anéis serão os espaçadores entre os tubos mais íntimos e externos, criando um espaço entre os dois longos tubos de acrílico para o fluido fluir.</li>
		<li>Faça cuidadosamente dois furos no tubo de acrílico externo (mais largo), um orifício na parte superior e um na parte inferior. Certifique-se de que cada orifício está a 3,5 cm da extremidade do tubo. Faça os furos em lados opostos do tubo(Figura 2B).</li>
		<li>Para reduzir as rachaduras, coloque fita adesiva no tubo sobre o ponto do orifício futuro e faça uma broca muito lentamente na configuração de torque mais baixa da broca.</li>
		<li>Usando a torneira de rosca, rosque ambos os orifícios para que os adaptadores da mangueira possam ser aparafusados nos dois orifícios do tubo externo. Para reduzir a rachadura, use lubrificante e rosque lentamente à mão.</li>
		<li>Deslize os dois espaçadores para a jaqueta interna, um em cada extremidade (inferior e superior). Deixe um espaço pequeno (0,5 cm) entre o espaçador e a extremidade da jaqueta interna(Figura 2B).</li>
		<li>Soldar os espaçadores no lugar usando cimento acrílico.</li>
		<li>Após o cimento no tubo interno e os espaçadores se definirem, deslize esta construção para o tubo externo maior com os orifícios. Certifique-se de que os tubos externos e internos estão alinhados em ambas as extremidades. Os espaçadores estarão a 0,5 cm do final, formando pequenas trincheiras nas duas extremidades da coluna(Figura 2C).</li>
		<li>Solde o tubo externo aos espaçadores usando cimento acrílico, usando grampos de aço ajustáveis para manter o aparelho unido. Espere o cimento definir.</li>
		<li>Enfie os adaptadores da mangueira nos orifícios do tubo externo agora fixados aos espaçadores e ao tubo interno. NOTA: Os adaptadores devem apenas roscar no tubo externo e não no espaço aberto entre os tubos mais internos e externos. Se os adaptadores da mangueira passarem muito longe, encurte-os até o comprimento apropriado com uma serra de corte.</li>
		<li>Sele os adaptadores da mangueira em seus fios no tubo externo com selante de silicone.</li>
		<li>Encha as duas trincheiras entre os tubos mais íntimos e externos em ambas as extremidades da coluna jaqueta com selante de silicone.</li>
		<li>Para testar a coluna, conecte tubos de 0,6 cm de diâmetro aos adaptadores da mangueira. Conecte o adaptador na parte inferior da coluna a uma fonte de água com tubulação, e o adaptador na parte superior da coluna a um ralo com um pedaço diferente de tubulação.</li>
		<li>Passe a água pelo aparelho de baixo para cima e verifique se há vazamentos. Se houver vazamentos, identifique de onde eles estão vindo e se lacre com silicone.</li>
	</ol></li>
	<li>Configuração da coluna jaqueta e monitor de funil Drosophila (DFM)<ol>
<li>Fixar a coluna revessa em uma bancada de réplica com um grampo de réplica de três pinos. Alinhe a coluna verticalmente com uma extremidade aberta ao teto e a outra aberta ao banco do laboratório(Figura 1B).</li>
		<li>Conecte a entrada e a saída do fluido de um banho refrigerado controlado pela temperatura aos bicos adaptadores da coluna com tubos plásticos de 0,6 cm de diâmetro(Figura 1B). Conecte a entrada de fluido ao bocal na parte inferior da coluna e a saída de fluido ao bocal na parte superior da coluna.</li>
		<li>Corte dois plugues isolantes de espuma circular de 3 cm de espessura (a mesma circunferência da abertura do compartimento mais interno da coluna). Certifique-se de que os plugues se encaixam perfeitamente e sele a coluna mais interna quando inserida em ambas as extremidades(Figura 1B).</li>
		<li>Furar um buraco no centro de um dos plugues e rosqueiar a extremidade nua de um termopar através do orifício de cerca de 5 cm e fixe com fita adesiva. Conecte a outra extremidade do termopar em um data-logger termopar.</li>
		<li>Conecte o data-logger termopar ao computador.</li>
		<li>Cunhar dois pedaços de protetor de sarjeta de plástico (5 cm x 7 cm, com aberturas de ~0,5 cm de diâmetro) dentro da coluna para funcionar como material de empinamento. Coloque um pedaço de guarda 2/3rds do topo da coluna e o outro 1/3do topo da coluna(Figura 1B).</li>
		<li>Fixar o plugue inferior (sem um termopar) e o plugue superior (com um termopar). Quando o plugue estiver inserido na parte superior da coluna, certifique-se de que o termopar não toque nas laterais da coluna.</li>
		<li>Ajuste a altura da coluna no suporte de réplica para que haja uma distância de 25 cm entre a parte inferior da coluna e a parte superior do banco.</li>
		<li>Fixar um anel de réplica (5 cm de diâmetro) ao suporte de réplica 5 cm abaixo da parte inferior da coluna e gire o anel para o lado da coluna.</li>
		<li>Coloque o DFM diretamente no anel de réplica(Figura 1B). Conecte todos os componentes eletrônicos: a fonte de alimentação, a interface de alimentação e o computador de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
		<li>Uma vez que os componentes estejam conectados, siga o protocolo do fabricante para concluir a configuração do software DFM e DFM.</li>
	</ol></li>
	<li>CtMin Análise<ol><li>Gire as válvulas de entrada e saída do banho de fluido para as posições abertas.</li>
		<li>Pressione o botão de alimentação para ligar o banho de fluido controlado pela temperatura e, em seguida, pressione o botão de reprodução para executar um programa de elevação e manutenção da temperatura do banho para 25 °C. Dê o banho de fluido e a coluna 5-10 min para alcançar e manter 25 °C.</li>
		<li>Remova o plugue na parte superior da coluna e substitua-o por um funil (5,08 cm de diâmetro; veja Figura 1C).</li>
		<li>Toque moscas de seu frasco de comida para a coluna.</li>
		<li>Remova o funil e substitua-o pelo plugue superior rapidamente, cuidado para não deixar as moscas escaparem. Dê às moscas 5 minutos para se estabelecerem, ocasionalmente tocando o plugue inferior para encorajar as moscas a subir.</li>
		<li>Pressione o botão de partida no banho de fluido e inicie o programa ctmin de rampa (25 °C por 5 min; 25 °C a 10 °C a 0,5 °C/min; 10 °C por 2 min; depois 10 °C a -10 °C a 0,25 °C/min). NOTA: Outras variações deste protocolo de rampade min ct podem ser utilizadas dependendo da questão da pesquisa (por exemplo, comparações dos efeitos de diferentes taxas de rampa na CTmin28).</li>
		<li>Clique em abrir o software de gravação termopar no computador e clique no ícone Gravar para começar a gravar a temperatura dentro da coluna a cada segundo durante a duração do ensaio. Certifique-se de que cada registro de temperatura inclui um carimbo de tempo específico para o segundo, para que os dados de temperatura possam ser posteriormente mesclados com dados do DFM.</li>
		<li>Adicione 5 mL de 90% de etanol a um tubo de centrífuga cônica de 15 mL e coloque-o em um rack abaixo da coluna.</li>
		<li>Ocasionalmente, toque no plug inferior da coluna para atrair qualquer mosca na parte inferior para subir. A maioria das moscas estará em um poleiro ou perto do topo da coluna por 15 °C.</li>
		<li>A 15 °C, retire o plugue inferior e colete todas as moscas ainda na parte inferior do etanol. Conte e note que essas moscas foram coletadas a 15 °C, mas seuminuto ct é desconhecido. NOTA: A temperatura em que o plugue inferior é removido deve ser decidida antes do ensaio e com base nomin de tomografia previsto da espécie de ensaio ou tratamento. Para este ensaio, foi escolhida 15 °C com base noct min destas linhas DGRP específicas encontradas em ensaios preliminares.</li>
		<li>Coloque um funil de vidro de 75 mm de diâmetro externo no DFM. Ajuste o anel de réplica, DFM e funil para que estejam sob a coluna. Certifique-se de que o lábio do funil sela completamente a parte inferior da coluna(Figura 1D).</li>
		<li>Insira a parte inferior do funil no tubo de coleta de 15 mL(Figura 1D).</li>
		<li>Abra o software DFM no computador clicando no ícone Software. O software começará imediatamente a registrar a hora/data em que as moscas atingem seu CTmin. Moscas que atingem seuminuto de tomografia perdem função neuromuscular e caem de seus poleiros, e depois através do DFM.</li>
		<li>Monitore se todas as moscas atingiram seuminuto ct à medida que a temperatura diminui verificando o plugue superior e os poleiros para ver se alguma mosca ainda está empoleirada (ou seja, ainda mantendo a função neuromuscular). O julgamento termina quando todas as moscas atingiram seu CTmin.</li>
		<li>No final do ensaio, ajuste o DFM e afunile longe da abertura da coluna. Algumas moscas podem chegar aoseu minuto ct, mas permanecem presas na coluna (ou seja, presas em um poleiro ou penduradas por um único gancho tarso). Abra a tampa superior e remova essas moscas. Ominuto da tomografia dessas moscas é desconhecido.</li>
		<li>Combine os arquivos de saída .txt do software de gravação termopar (ou seja, temperatura, data e hora) e o software DFM (ou seja, número de moscas através do funil, data e hora) usando o comando Merge no RStudio. Mescle os dois arquivos com base na variável data/hora compartilhada.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Ensaio de calor de alta produtividade KD
<ol><li>Montagem e preparação do aparelho<ol>
<li>Com um adesivo, fixar a malha de arame tecido de aço (~1,5 mm de abertura) na parte inferior de uma placa 96 bem sem fundo.</li>
		<li>Conecte ímãs aos lados opostos da parte inferior de uma placa 96 bem sem fundo com uma pistola de cola quente e cola quente(Figura 3).</li>
		<li>Para criar uma tampa de septo personalizada com filme adesivo projetado para 96 placas de poço, coloque dois filmes lados pegajosos juntos para formar uma folha de plástico cume.</li>
		<li>Coloque as folhas de plástico sobre a placa de poço 96 e use fita adesiva para aderir a todos os quatro lados da placa. Sobre a abertura para cada poço na placa, corte um 'x' na folha de plástico com um cortador de caixa (ou seja, 96 x's totais).</li>
		<li>Anesthetize voa com CO2 e carregá-los individualmente em cada poço da placa 96 bem sem fundo modificada com uma tampa aspiradora e septum. Retire a tampa do septo da placa de 96 poços enquanto as moscas são anestesiadas com CO2 e substitua-a por uma tampa clara apertada.</li>
		<li>Coloque o 96 bem sem fundo carregado com moscas e com uma tampa clara e apertada sobre os alimentos. Certifique-se de que as moscas tenham pelo menos 48h entre a anestesia de CO2 e o início do ensaio (etapas 2.2.1-2.2.5). NOTA: A parte inferior das placas 96 bem modificadas não-inferiores é feita de malha, de modo que moscas anestesiadas com CO2 podem ser carregadas e deixadas em alimentos por pelo menos 48 horas antes de um teste começar. Qualquer recipiente plástico >8,5 cm de largura x 13 cm de comprimento que tenha pelo menos 2 cm de profundidade para acomodar uma camada de 1 cm de profundidade de alimentos pode ser usado.</li>
		<li>Fixar uma webcam no fundo do interior de uma incubadora controlada pela temperatura com fita. Aponte a câmera diretamente para cima(Figura 4). Fixar uma prateleira de incubadora cerca de 10 cm acima da câmera. NOTA: A webcam aponta para cima e registra a placa de 96 poços de baixo para garantir que o máximo possível da superfície do poço (por exemplo, não bloqueada da vista pelas paredes do poço da placa). Quando as moscas atingem seu KDT eles caem para o fundo do poço; neste caso, o lado mais próximo da webcam, e, portanto, estão em vista, independentemente de quão longe seu poço está do centro de vista.</li>
		<li>Conecte a webcam a um computador.</li>
		<li>Com fita adesiva, conecte uma folha branca de papel (8,5 cm x 13 cm; a área exata da parte inferior da placa de 96 poços) ao fundo da prateleira(Figura 4). Certifique-se de que o papel preenche todo o quadro quando visualizado através da webcam.</li>
		<li>Coloque uma fonte de luz na incubadora. Use papel ou outros materiais para amortecer a iluminação e minimizar o brilho. NOTA A etapa 2.1.10 é específica para cada incubadora porque a iluminação e as reflexões variam entre as incubadoras. O objetivo é ter iluminação suficiente na incubadora para proporcionar um bom contraste entre as moscas em cada poço e a folha branca de papel atrás da placa quando vista com a webcam.</li>
	</ol></li>
	<li>Executando o ensaio de calor KD<ol>
<li>Coloque a incubadora em 37,5 °C e espere cerca de 30 minutos para dar tempo à incubadora para alcançar e manter a temperatura desejada. A temperatura exata dependerá do inseto ser avaliado e de qualquer outra consideração temporal.</li>
		<li>Coloque a placa 96 bem invertida na incubadora, de tal forma que a parte inferior da placa (lado da malha) seja contra o papel branco na parte inferior da bandeja(Figura 4). Tome nota da orientação dos poços (nomes de coluna e linha) na bandeja e no quadro da webcam. Fita colorida ao longo das laterais da placa 96 e bordas do pedaço de papel branco pode verificar a orientação (Figura 4). NOTA: Certifique-se de que a temperatura da incubadora é consistente com a temperatura dentro da placa de poço 96, registrando a temperatura dentro da placa com um termopar durante um teste do ensaio de calor KD. Também é prudente verificar se há uma variação insignificante na temperatura entre os poços da placa do poço 96 com múltiplos termopares antes de conduzir o ensaio de calor KD.</li>
		<li>Feche a porta da incubadora.</li>
		<li>Clique em Gravar no software de gravação de vídeo.</li>
		<li>Depois de 2h, verifique a gravação para ver se todas as moscas chegaram ao seu ponto de descanso final e parou de se mover. Uma vez que todas as moscas tenham parado de se mover, clique em Parar no software de gravação de vídeo. Para os genótipos testados aqui, criados a 25 °C, a maioria das moscas atinge seu KDT por 60 min a 37,5 °C (veja também Jørgensen et al.9).</li>
		<li>Descarte as moscas.</li>
		<li>Use os scripts Python personalizados(Arquivos de Codificação Suplementar 1-3) para aproximar o tempo no vídeo quando as moscas atingirem seu KDT de calor. NOTA: A etapa 2.2.7 é opcional. Para acelerar a análise de vídeo, um conjunto de scripts Python personalizados foram desenvolvidos para medir mudanças na densidade de pixels ao longo do tempo em cada poço (ver Arquivo de Codificação Suplementar). Quando as moscas param de se mover, a densidade de pixels é constante, e um gráfico desses dados pode ser usado para localizar o tempo aproximado no vídeo quando as moscas são derrubadas. Embora possa ser possível usar este script para automatizar a análise de dados, atualmente pequenas imperfeições no vídeo levam a pequenas discrepâncias entre mudanças na densidade de pixels e o tempo de KD real.</li>
		<li>Clique em abrir o arquivo de vídeo e gravar o KDT de cada mosca em cada poço. A medida mais consistente de calor KDT entre ensaios e observadores é registrar o tempo em que uma mosca atinge seu ponto de descanso final.</li>
		<li>Acompanhe o vídeo ao contrário, focando em um único poço, e observando o tempo em que a mosca primeiro se move para fora de seu ponto de descanso final. Repita este processo para cada poço.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+variation%2C+thermal+extremes+and+the+physiological+performance+of+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals.</a> Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).</li>
<li>Angilletta, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAngilletta%2C+MJ+%22Thermal+Adaptation%3A+A+Theoretical+and+Empirical+Synthesis%22">Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis</a>. , New York, NY. (2009).</li>
<li>Coumou, D., Rahms Torf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+weather+extremes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Climate+Change%22%5BJournal%5D)">A decade of weather extremes.</a> Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).</li>
<li>Wang, G., Dillon, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+geographic+convergence+in+diurnal+and+annual+temperature+cycling+flattens+global+thermal+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Climate+Change%22%5BJournal%5D)">Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles.</a> Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).</li>
<li>MacMillan, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+cause+from+consequence%3A+A+systematic+approach+to+thermal+limits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits.</a> Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593(2019).</li>
<li>Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+invitation+to+measure+insect+cold+tolerance%3A+Methods%2C+approaches%2C+and+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thermal+Biology%22%5BJournal%5D)">An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow.</a> Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).</li>
<li>Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+critical+thermal+maximum%3A+History+and+critique%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">The critical thermal maximum: History and critique.</a> Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).</li>
<li>Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unifying+indices+of+heat+tolerance+in+ectotherms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thermal+Biology%22%5BJournal%5D)">Unifying indices of heat tolerance in ectotherms.</a> Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).</li>
<li>Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+assess+Drosophila+heat+tolerance%3A+Unifying+static+and+dynamic+tolerance+assays+to+predict+heat+distribution+limits%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Ecology%22%5BJournal%5D)">How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits.</a> Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).</li>
<li>Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+rapid+measurement+of+thermal+tolerance+traits+in+studies+of+small+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Entomology%22%5BJournal%5D)">A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects.</a> Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).</li>
<li>Andersen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+assess+Drosophila+cold+tolerance%3A+Chill+coma+temperature+and+lower+lethal+temperature+are+the+best+predictors+of+cold+distribution+limits%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Ecology%22%5BJournal%5D)">How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits.</a> Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).</li>
<li>Hu, X. P., Appel, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seasonal+variation+of+critical+thermal+limits+and+temperature+tolerance+in+Formosan+and+eastern+subterranean+termites+%28Isoptera%3A+Rhinotermitidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Entomology%22%5BJournal%5D)">Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae).</a> Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).</li>
<li>Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+for+tolerance+to+high+temperatures+in+a+population+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster.</a> Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).</li>
<li>Overgaard, J., Kristensen, T. N., Sørensen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validity+of+thermal+ramping+assays+used+to+assess+thermal+tolerance+in+arthropods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods.</a> PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).</li>
<li>Klok, C. J., Chown, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+thermal+limits%2C+temperature+tolerance+and+water+balance+of+a+sub-Antarctic+kelp+fly%2C+Paractora+dreuxi+%28Lepidoptera%3A+Tineidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae).</a> Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).</li>
<li>Salachan, P. V., Burgaud, H., Sørensen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+the+thermal+limits%3A+Non-linear+reaction+norms+drive+disparate+thermal+acclimation+responses+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946(2019).</li>
<li>Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+acclimation+temperature+on+thermal+activity+thresholds+in+polar+terrestrial+invertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).</li>
<li>MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+gut+in+insect+chilling+injury%3A+Cold-Induced+disruption+of+osmoregulation+in+the+fall+field+cricket%2C+Gryllus+pennsylvanicus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus.</a> Journal of Experimental Biology. 214 (5), 726-734 (2011).</li>
<li>Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+rapid+measurement+of+heat+or+cold+resistance+of+small+insects%5BTitle%5D)+AND+%22British+Ecological+Society%22%5BJournal%5D)">A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects.</a> British Ecological Society. 6 (4), 489-494 (1992).</li>
<li>Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+maternal+variation+for+heat+resistance+in+drosophila+from+the+field%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field.</a> Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).</li>
<li>Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+chill-coma+onset+and+recovery+at+the+extremes+of+the+thermal+window+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Biochemical+Zoology%22%5BJournal%5D)">The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).</li>
<li>Sørensen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+induction+of+the+heat+hardening+response+in+an+Arctic+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Letters%22%5BJournal%5D)">Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect.</a> Biology Letters. 15 (10), (2019).</li>
<li>Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computer-based+electronic+fall-through+probe+insect+counter+for+monitoring+infestation+in+stored+products%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+American+Society+of+Agricultural+Engineers%22%5BJournal%5D)">A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products.</a> Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).</li>
<li>MacKay, T. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+melanogaster+Genetic+Reference+Panel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel.</a> Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+A+laboratory+handbook%22">Drosophila: A laboratory handbook</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).</li>
<li>Garcia, M. J., Teets, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+stress+results+in+sustained+locomotor+and+behavioral+deficits+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology+Part+A%3A+Ecological+and+Integrative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331 (3), 192-200 (2019).</li>
<li>Teets, N. M., Hahn, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+the+shape+of+cold-survival+curves+in+a+single+fly+population+suggests+potential+for+selection+from+climate+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability.</a> Journal of Evolutionary Biology. 31 (4), 543-555 (2018).</li>
<li>Kelty, J. D., Lee, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+rapid+cold+hardening+by+cooling+at+ecologically+relevant+rates+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).</li>
<li>MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+insect+chill-coma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying insect chill-coma.</a> Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).</li>
<li>Salachan, P. V., Sørensen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+thermal+limits+affected+differently+by+developmental+and+adult+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations.</a> Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).</li>
<li>Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+robust+sex-specific+trade-off+between+cold+resistance+and+starvation+resistance+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).</li>
<li>Kelty, J. D., Lee, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cold-hardening+of+Drosophila+melanogaster+%28Diptera%3A+Drosophilidae%29+during+ecologically+based+thermoperiodic+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles.</a> Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).</li>
<li>Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insects+at+low+temperatures%3A+An+ecological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Insects at low temperatures: An ecological perspective.</a> Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os dois métodos detalhados acima geram dados de alto rendimento de métricas ecologicamente relevantes para limites térmicos superiores e inferiores. Esses protocolos baseiam-se em metodologias previamente estabelecidas comuns à pesquisa sobre limites térmicos de insetos (resumidas em Sinclair et al.) 6. Ambos os protocolos podem ser concluídos em um curto espaço de tempo (~2 h cada), produzir conjuntos de dados com grandes tamanhos de amostra, não sacrificar a repetibilidade ou a precisão e mi...

Limites térmicos de insetos A variação das condições ambientais, incluindo a temperatura, é um fator importante que influencia o desempenho, a aptidão, a sobrevivência e a distribuição geográfica dos organismos1,,2. Limites térmicos superiores e inferiores determinam a gama teórica de ambientes que um organismo pode tolerar e, portanto, esses limites são importantes preditores de distribuições vegetais e animais, especialmente diante das mudanças climáticas3,,4. Assim, os protocolos para medir com precisão os limites térmicos são importantes ferramentas para ecologistas, fisiologistas, biólogos evolucionários e biólogos de conservação, entre outros.
Como os animais terrestres mais abundantes e diversos, os insetos são frequentemente usados para medições de limites térmicos. Máxima térmica crítica (CTmax) e minima térmica crítica (CTmin) são comumente utilizadas para avaliar a variação intra e interespecífica na tolerância térmica5,,6,7. Enquanto a tomografiamáxima e aTC min podem ser medidas para fenótipos múltiplos, incluindo crescimento, produção reprodutiva e comportamento, eles são mais comumente aplicados à função locomotor5,,6,,7. Assim, a tomografiamáxima (também chamada de temperatura de knockdown de calor) e CTmin são muitas vezes definidas como as altas e baixas temperaturas em que os insetos perdem a função motora e são incapazes de permanecer em pé5,6,,7,,8,9,,10,11. Ctmin coincide com o início do coma frio, uma paralisia reversível provocada pelas temperaturas frias6. Embora a paralisia nos limites térmicos seja muitas vezes reversível, a exposição contínua a essas temperaturas leva à morte ecológica5.
Métodos comuns para medir limites térmicos Uma variedade de aparelhos têm sido usados para medir limites térmicos (resumidos em Sinclair et al.) 6. Brevemente, os insetos são aquecidos ou resfriados em incubadoras12,13, recipientes submersos em banhos fluidos11,,14,15,,16, blocos dealumínio 10,,17ou recipientes cobertos18, e monitorados até que a locomoção cesse. Para monitorar insetos durante o ensaio, o método mais comum é a observação direta, na qual os indivíduos são continuamente monitorados em tempo real ou retrospectivamente com vídeo gravado6,,9,10,,11,,15,,17. Embora os métodos de observação direta tenham requisitos mínimos de equipamento, eles são intensivos em mão-de-obra e limitam o rendimento. Alternativamente, os insetos podem ser observados indiretamente coletando indivíduos em horários discretos à medida que caem dos poleiros6,,19,,20,,21 ou utilizando monitores de atividade13.
Os métodos indiretos para medir limites térmicos são geralmente mais elevados e potencialmente menos propensos a erros do que os métodos de observação direta. O método mais comum para monitoramento indireto utiliza uma coluna controlada pela temperatura6,,8,,19,20,21. Os insetos são colocados dentro de uma coluna com poltronas, e a temperatura da câmara interna é controlada pelo bombeamento do fluido de um banho de fluido controlado pela temperatura através do revestimento revestido da coluna. Indivíduos que atingem seu limite térmico caem de seu poleiro e são coletados a temperaturas discretas ou intervalos de tempo. Embora este método funcione bem para ctmin, foi encontrado inadequado para ctmax, porque moscas voluntariamente saem da parte inferior da coluna quando a temperatura aumenta. O novo método descrito aqui contorna esse problema contendo individualmente moscas durante medições automatizadas.
Além do método de observação, dois tipos de regimes de temperatura são comumente utilizados para avaliar limites térmicos superiores. Os ensaios dinâmicos consistem em aumentar gradualmente a temperatura até que a função motora seja perdida; que a temperatura é a ct dinâmicamáx7,,8,9,13. Em contraste, os ensaios estáticos consistem em uma temperatura estressante constante até que a função motora seja perdida; esse ponto de tempo é o tempo de knockdown de calor (calor KDT), também chamado de CT estáticomax (sCTmax) em um artigo recente por Jørgensen et al.7,8,9,16,22. Embora os ensaiosde nocaute de TC max e heat knockdown (ensaios de KD de calor) produzam métricas com diferentes unidades, a modelagem matemática dos dois traços indica que eles dão informações comparáveis sobre tolerância ao calor e são ambos ecologicamente relevantes8,,9. Ensaios dinâmicos produzem uma temperatura que pode ser comparada às condições ambientais, e são preferíveis quando há grandes diferenças na tolerância ao calor, como comparações entre espécies com nichos térmicos amplamente diferentes. No entanto, devido ao alto Q10 para acúmulo de lesões térmicas, um ensaio estático pode ser preferível para detectar tamanhos de pequenos efeitos, como variação intraespecífica na tolerância ao calor9. Além disso, praticamente falando, um ensaio estático requer equipamentos menos sofisticados do que um ensaio dinâmico.
Objetivo O objetivo deste artigo é formalizar métodos para ensaios de DCmin e heat KD que podem ser utilizados em pesquisas futuras para avaliar os limites térmicos dos insetos motile. Os protocolos são adaptados de metodologias previamente estabelecidas e são projetados para serem de alto rendimento, automatizados e econômicos. Ambos os ensaios podem ser concluídos em um curto espaço de tempo (~2 h), o que significa que vários experimentos podem ser realizados em um único dia, produzindo grandes quantidades de dados sem sacrificar a repetibilidade ou a precisão. Com esta configuração, a tolerância ao calor de 96 moscas pode ser medida simultaneamente, enquanto a coluna para CTmin pode conter mais de 100 moscas, desde que haja área de superfície adequada para empinamento.
O método de alta produtividade para observação dect min modifica a metodologia comum da coluna com a adição de um sensor infravermelho para contar automaticamente moscas. O uso de um sensor infravermelho para contagem foi proposto pela primeira vez por Shuman et al. em 199623, mas não foi amplamente adotado. A adição do sensor infravermelho permite a geração de dados contínuos em vez de coletar dados em intervalos discretos. Este protocolo também minimiza o erro do experimentador, eliminando a entrada manual de dados e a necessidade de alternar manualmente os tubos de coleta abaixo da coluna tomada em pontos de tempo discretos.
O método de alta produtividade para registro de KDT térmico é modificado a partir de dois estudos anteriores de tolerância ao calor em insetos10,12. Moscas individuais são armazenadas em uma placa de 96 poços em uma incubadora controlada pela temperatura e o vídeo é gravado. Este protocolo minimiza o viés do experimentador na determinação do KDT de calor porque os experimentos podem ser revisados e verificados reproduzindo a gravação. Este protocolo também fornece um conjunto de scripts Python personalizados que podem ser usados para acelerar a análise de vídeo. O uso de poços individuais elimina a interferência que pode ocorrer quando outros indivíduos se movem ou caem, o que pode ser um problema quando grupos de indivíduos são observados na mesma arena10,17. Além disso, a incubadora controlada pela temperatura fornece uma temperatura estável em todos os 96 poços, ao contrário do gradiente de temperatura às vezes observado em um bloco de alumínio controlado pela temperatura10. Observe também que o método de gravação do poço 96 pode ser adaptado para medir a tomografiadinâmica máxima e potencialmente CTmin (ver Discussão).
Para demonstrar cada protocolo, foram comparados os limites térmicos de fêmeas adultas de melanogaster Drosophila de linhas selecionadas do Painel de Referência Genética de Melanogaster Drosophila (DGRP) foram comparados24. Estas linhas foram selecionadas porque experimentos preliminares indicaram diferenças significativas na tolerância térmica. Estes ensaios provaram ser métodos robustos para discriminar diferenças na tolerância térmica. Os seguintes protocolos, ensaioct min de alta produtividade (seção 1) e ensaio de calor de alto rendimento KD (seção 2), descrevem as ações necessárias para produzir dados de CTmin e Heat KDT para qualquer estágio de vida de insetos motile capazes de se encaixar nos aparelhos, como drosophilaadulto . Para ctmin também é essencial que o inseto seja capaz de poleiro. Aqui, cada ensaio é demonstrado em Drosophila melanogasteradulto. No entanto, podem ser necessárias modificações para outras etapas tributárias ou de vida6. Pequenas alterações podem incluir o uso de material de empinamento com aberturas maiores para acomodar espécimes maiores no ensaiomin ct ou usar uma câmera de maior qualidade para discernir o KDT sutil de um inseto em movimento lento ou estágio de vida no ensaio de calor KD. Este protocolo não descreve métodos para preparar moscas, mas é importante padronizar protocolos de criação para garantir a repetibilidade25 (ver Garcia e Teets26 e Teets e Hahn27). Os protocolos fornecidos incluem informações sobre como construir e configurar os aparelhos, como registrar medições e uma breve descrição da análise de dados.

<table><tbody><tr><td>ARCTIC A40 Circulador de fluido refrigerado (rampas de teperature programáveis)</td> <td>Thermo Scientific; Waltham, MA</td><td>153-5401</td><td></td></tr><tr><td>C922 Pro Stream Webcam</td><td>Logitech; Newark, CA</td><td>960-001087</td><td></td></tr><tr><td>Braçadeira de aço ajustável circular &ndash; 5,08 cm a 7,62 cm</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubo acrílico transparente - 5,7 cm x 5,1 cm x 0,3 cm</td><td>United States Plastic Corp., OH</td><td>44036</td><td></td></tr><tr><td>Tubo acrílico transparente - 6,35 cm x 5,7 cm x 0,3 cm</td><td>United States Plastic Corp., OH</td><td>440515</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de acrílico transparente - 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm</td><td>United States Plastic Corp., OH</td><td>44041</td><td></td></tr><tr><td>Selante de silicone transparente</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qualquer Tubo de coleta (15 ml)</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Furadeira Sem Fio</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monitor de Funil de Drosophila (DFM)</td><td>TriKinetics; Waltham, MA</td><td>DFM</td><td>Usado para contar o número de moscas que caem no funil em um determinado momento</td></tr><tr><td>Software de coleta de dados DAM</td><td>TriKinetics; Waltham, MA</td><td></td><td>Registra a entrada de dados do DFM</td></tr><tr><td>Fly Storage Lid</td><td>FlySorter; Seatle, WA</td><td>FS-96LID-5PK</td><td>Usado para carregar moscas na placa de armazenamento para o ensaio sCTmax</td></tr><tr><td>Placa de armazenamento de moscas</td><td>FlySorter; Seatle, WA</td><td>FS-96PLATE-5PK</td><td>Usado para segurar moscas durante o ensaio sCTmax</td></tr><tr><td>Fly Food Tray</td><td>FlySorter; Seatle, WA</td><td>FS-TRAY-5PK</td><td>Usado para manter as moscas nos alimentos após o carregamento na placa de 96 poços até o ensaio sCTmax</td></tr><tr><td>Funil de vidro</td><td>Kimax</td><td>28950-75</td><td>75mm</td></tr><tr><td>Protetor de calha</td><td>Qualquer</td><td>abertura</td> de <td>~0,5 cm de diâmetro</td></tr><tr><td>Serra Any</td><td></td><td>Any Heratherm</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora Thermo Scientific</td><td>Thermo Scientific; Waltham, MA</td><td>OMS100</td><td></td></tr><tr><td>Adaptadores de nylon para mangueira (2) &ndash; &frac14; MNPT x 3/8</td><td>United States Plastic Corp., OH</td><td>61135</td><td></td></tr><tr><td>Pistola de cola quente e cola</td><td>Qualquer</td><td>fonte</td><td></td></tr> de <tr><td>luz</td><td>Qualquer</td><td></td> ímã Qualquer <td></td>Gravador</tr><tr><td></td><td></td><td></td> OMEGA TC-08 e software de player TC-08 OMEGA;<td></td></tr><tr><td></td><td> Norwalk, CT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termopar OMEGA (Tipo T)</td><td>OMEGA; Norwalk, CT</td><td>5LRTC-TT-K-20-36</td><td></td></tr><tr><td>Funil de plástico</td><td>Qualquer</td><td>Qualquer Tubo</td> de plástico de <td>2" de diâmetro</td></tr><tr><td>- 0,6 cm de diâmetro</td><td>United States Plastic Corp., OH</td><td>62852</td><td></td></tr><tr><td>Anel de retorta</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qualquer suporte de retorta</td><td></td><td></td> de 2" de diâmetro Qualquer <td></td></tr><tr><td>Retorta braçadeira de três pinos</td><td>Qualquer</td><td>Qualquer</td><td></td></tr>Conector de porta serial <tr><td>Rstudio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(PSIU9)</td><td>TriKinetics; Waltham, MA</td><td>PSIU9</td><td>Conexão intermediária entre o DFM e o computador, permite várias conexões DFM</td></tr><tr><td>Isopor (2" de espessura)</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fita</td><td>Qualquer</td><td>Fonte</td><td></td></tr> de <tr><td>Alimentação Ininterrupta (PS9-1)</td><td>TriKinetics; Waltham, MA</td><td>PS9-1</td><td>Fonte de alimentação para o DFM e PSIU9</td></tr><tr><td>Weld-on #4 Acrylic Cement</td><td>United States Plastic Corp., OH</td><td>45737</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaios de alta taxa de limite térmico em insetos

High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects

Limites térmicos superiores e inferiores de plantas e animais são importantes preditores de seu desempenho, sobrevivência e distribuições geográficas, e são essenciais para prever respostas às mudanças climáticas. Este trabalho descreve dois protocolos de alta produtividade para medir limites térmicos de insetos: um para avaliar minima térmica crítica (CTmin),e outro para avaliar o tempo de queda de calor (KDT) em resposta a um estressor de calor estático. No ensaiomin ct, os indivíduos são colocados em uma coluna com jaqueta acrílica, submetidos a uma rampa de temperatura decrescente, e contados à medida que caem de suas poltronas usando um sensor infravermelho. No ensaio de calor KDT, os indivíduos estão contidos em uma placa de 96 poços, colocados em uma incubadora definida a uma temperatura estressante, quente e vídeo gravado para determinar o tempo em que eles não podem mais permanecer eretos e se mover. Esses protocolos oferecem vantagens em relação às técnicas comumente utilizadas. Ambos os ensaios são de baixo custo e podem ser concluídos relativamente rapidamente (~2 h). O ensaiomin ct reduz o erro do experimentador e pode medir um grande número de indivíduos ao mesmo tempo. O protocolo de calor KDT gera um registro de vídeo de cada ensaio e, portanto, remove o viés do experimentador e a necessidade de monitorar continuamente os indivíduos em tempo real.

Os limites térmicos (ou seja, CTmin e KDT de calor) das fêmeas do Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP) foram medidos para demonstrar os dados de alta produtividade gerados a partir dos dois protocolos descritos. Omin ct foi avaliado utilizando as linhas DGRP 714 (n = 37) e 913 (n = 45). O Heat KDT foi avaliado e comparado com as linhas DGRP 189 (n = 42) e 461 (n = 42), e os arquivos de vídeo foram analisados manualmente. O tempo total dos e...

Os limites térmicos podem prever os ambientes que os organismos toleram, que são informações valiosas diante das rápidas mudanças climáticas. Descritos aqui estão protocolos de alta produtividade para avaliar minima térmico crítico e tempo de knockdown de calor em insetos. Ambos os protocolos maximizam o rendimento e minimizam o custo dos ensaios.

Ensaios de alta taxa de limite térmico em insetos

Upper and lower thermal limits of plants and animals are important predictors of their performance, survival, and geographic distributions, and are ...

A tolerância térmica é um componente crítico das distribuições de espécies e respostas às mudanças climáticas. Aqui fornecemos métodos para avaliar rapidamente o calor e a tolerância ao frio em pequenos insetos. Estes métodos para medir a tolerância ao frio, através do mínimo térmico crítico e tolerância ao calor, através do tempo de calor derrubado são de alto rendimento, semi-automatizados e requerem equipamento mínimo.Demonstrando o procedimento será David Awde, um pós-doutor do meu laboratório. Para configurar um ensaio mínimo térmico crítico, ligue um banho de fluido controlado pela temperatura e pressione o botão de reprodução para executar um programa, elevando e mantendo a temperatura do banho a 25 graus Celsius. Aguarde de cinco a 10 minutos para permitir que a coluna do banheiro fluido atinja 25 graus Celsius, antes de substituir o plugue na parte superior da coluna por um filtro de 5,08 centímetros de diâmetro.Toque aproximadamente 40 moscas de seu frasco de comida para a coluna através do funil e substitua rapidamente o funil pelo plugue, tomando cuidado para não deixar nenhuma mosca escapar. Então permita que as moscas se acomodem. Ocasionalmente, toque no plugue inferior para encorajar as moscas a subir.Após cinco minutos, pressione o botão de partida no ganho de banho fluido, para iniciar o programa crítico de rampa de minima térmica. Clique para abrir o software de gravação de casal térmico no computador e clique em gravar para começar a gravar a temperatura dentro da coluna, a cada segundo durante a duração do ensaio. Certifique-se de que cada registro de temperatura inclua o fuso de tempo específico para o segundo, para que os dados de temperatura possam ser posteriormente mesclados com dados do monitor do funil Drosophila.Adicione cinco mililitros de 90% de etanol a um tubo de centrífuga cônica de 15 mililitros e coloque o tubo em um rack abaixo da coluna. Ocasionalmente, toque no plug inferior da coluna para atrair qualquer mosca na parte inferior para subir. A maioria das moscas estará em um poleiro ou perto do topo da coluna por 15 graus Celsius.A 15 graus Celsius, coloque um funil de vidro de 75 milímetros de diâmetro externo no monitor do funil Drosophila. Remova o plugue inferior e colete todas as moscas ainda na tomada do etanol. Ajuste o anel de réplica, o monitor do funil e o funil, de modo que estejam sob a coluna.Certifique-se de que o lábio do funil sela completamente a parte inferior da coluna e insira a parte inferior do funil no tubo de coleta de 15 mililitros. Abra o software de monitor de funil Drosophila. O software começará imediatamente a gravar a hora e a data em que as moscas atingem seu minima térmico crítico.Moscas que atingem seu minima térmico crítico, perderão sua função neuromuscular e cairão de suas poltronas, através do monitor do funil Drosophila. Para monitorar se todas as moscas atingiram seu minima térmico crítico, à medida que a temperatura diminui, verifique o plugue superior e os poleiros para ver se alguma mosca ainda está empoleirada. Quando todas as moscas atingirem seu minima térmico crítico, movam o monitor do funil Drosophila e afunilem para longe da abertura da coluna.Em raras ocasiões, as moscas podem atingir seu minima térmico crítico, mas permanecem presas na coluna. Abra o plugue superior para remover essas moscas. Para configurar um alto nível de calor derrubado, use um aspirador e tampa de septo, para carregar moscas sedadas de dióxido de carbono individuais, em cada poço de uma placa de 96 bem modificada e selar a placa com uma tampa clara e apertada.Em seguida, coloque o prato sobre um suprimento de alimentos e deixe as moscas se aclimatar ao prato 96 poço por pelo menos 48 horas. No dia do ensaio, coloque a incubadora a 37,5 graus Celsius, após 30 minutos coloque a placa de cultura de mosca na incubadora com o fundo da placa contra o papel branco na parte inferior da bandeja. Observe a orientação da coluna do poço e nomes de linha na bandeja e no quadro da webcam e coloque fita colorida ao longo das laterais e bordas da placa para ajudar a verificar a orientação.Quando a placa estiver posicionada, feche a porta da incubadora e clique em gravar no software de gravação de vídeo. Depois de duas horas, verifique a gravação para ver se todas as moscas.chegaram ao seu ponto de descanso final e pararam de se mover. Quando todas as moscas pararem de se mover, clique em parar e se livrar das moscas.Abra o arquivo de vídeo e registe o tempo de knockdown de cada mosca em cada poço. A medida mais consistente do calor derrubado o tempo de inatividade entre os ensaios e observações é o momento em que uma mosca atinge seu ponto de descanso final. Em seguida, acompanhe o vídeo ao contrário, focando em um único poço e observando o tempo em que a mosca primeiro se move para fora de seu ponto de descanso final.Determinar o tempo final de descanso de cada mosca pode ser difícil. Para garantir uma análise precisa, é importante tomar seu tempo e observar cada um bem individualmente. Nesta análise representativa, as fêmeas da linha de painéis de referência genética Drosophila apresentaram temperaturas de minima térmicas significativamente mais baixas do que as fêmeas da linha DGRP 714.Além disso, o calor derrubou o tempo a 37,5 graus Celsius, difere significativamente entre as fêmeas das linhas 73 e 461 DGRP. Com pequenas modificações, este método para medir o tempo de calor derrubado, poderia ser usado para medir outros traços de tolerância térmica, como tempo de recuperação do coma frio ou máximo térmico crítico. Ao reduzir significativamente o tempo prático para os investigadores, esses métodos permitiram a exploração de traços de variação genética e tolerância térmica em uma escala que antes não era possível.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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